史靜茹，郭麗麗，劉在霞，劉永斌，張家新，張文廣

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.動(dòng)物遺傳育種與繁殖內(nèi)蒙古自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

綿羊作為重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，遍布世界，皮毛和羊肉為人類提供了生活用品和食物， 綿羊養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為畜牧業(yè)發(fā)展和農(nóng)牧民增收的重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)，我國(guó)綿羊存欄數(shù)趨于世界前列。 綿羊的繁殖性狀是一種經(jīng)濟(jì)性狀，與經(jīng)濟(jì)收益息息相關(guān)。綿羊的繁殖性狀與經(jīng)濟(jì)的關(guān)系促使學(xué)者對(duì)綿羊繁殖性狀進(jìn)行更深入的研究與探索。伴隨大數(shù)據(jù)時(shí)代的來臨，利用高通量測(cè)序技術(shù)探究復(fù)雜的有機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)成為趨勢(shì)， 最早被研發(fā)并應(yīng)用的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為微陣列技術(shù)（microarray technology），該技術(shù)較為成熟，花費(fèi)成本適中、數(shù)據(jù)分析軟件較多。 基因芯片技術(shù)是微陣列技術(shù)的基礎(chǔ)， 此技術(shù)只可檢測(cè)已知基因序列，不能檢測(cè)未知的基因序列。基因芯片技術(shù)靈敏度低并缺乏廣泛性， 使用該方法檢測(cè)豐度較低的序列和重復(fù)序列有一定難度， 異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也很難被檢測(cè)到。相比基因芯片技術(shù)，基因表達(dá)系列分析技術(shù)（serial analysis of gene expression，SAGE）無需依托基因序列信息，卻可以獲得所有基因的表達(dá)量。SAGE 技術(shù)不僅能夠顯示差異基因表達(dá)譜， 還可以探索低豐度基因和未知基因。SAGE 技術(shù)優(yōu)化后的大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)（massively parallel signatur sequencing，MPSS）， 測(cè)序步驟被簡(jiǎn)化，但測(cè)序精確性有所提高。這兩項(xiàng)技術(shù)都是建立在費(fèi)用較高的Sanger 測(cè)序基礎(chǔ)上， 測(cè)序工作量大是操作過程中存在的問題，沒有被推廣。與上述幾種方法相比， 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以直接測(cè)定每個(gè)轉(zhuǎn)錄本片段序列，精確性高，單個(gè)堿基的差異也可被檢測(cè)。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)無需特異性探針，不需要明確的物種基因信息，即可對(duì)任意物種直接進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，對(duì)研究除模式化生物外的其他生物具有極大意義。 盡管有高通量測(cè)序技術(shù)支持，哺乳動(dòng)物的生殖調(diào)控依然是養(yǎng)殖領(lǐng)域研究需要突破的難關(guān)， 綿羊的繁殖調(diào)控一直是研究者的重點(diǎn)關(guān)注方向［1］。

能否成功受胎并妊娠維持是影響經(jīng)濟(jì)效益關(guān)鍵的因素。 綿羊卵子的發(fā)生與發(fā)育信號(hào)通路現(xiàn)在已經(jīng)被生物信息學(xué)技術(shù)挖掘出來， 需要進(jìn)一步探究其生理機(jī)制與遺傳特性。研究表明，大多數(shù)多胎綿羊品種的繁殖性狀受到單基因主基因或多基因效應(yīng)的調(diào)控［2-3］。 此外，挖掘出大量與產(chǎn)羔、排卵和發(fā)情有關(guān)的基因，這些基因有GDF9、BMP15、BMPR1B、B4GALNT2、ESR1、ESR2、PGR、SMAD1、CYP11A1［4-5］。我國(guó)著名的地方多胎羊品種是小尾寒羊， 該品種具有四季發(fā)情的特點(diǎn)。 通過研究小尾寒羊卵泡期和黃體期各基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TGF-β 信號(hào)通路中SMAD1、SMAD4、TGFβRⅡ和FSTL3 基因與小尾寒羊四季發(fā)情有關(guān)［6］。 研究綿羊卵巢營(yíng)養(yǎng)因素引起的季節(jié)性發(fā)情，發(fā)現(xiàn)PLA2G4D 基因直接影響卵泡發(fā)育，間接影響瘦素分泌［7］。

國(guó)內(nèi)外研究人員通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)挖掘出大量的羊繁殖相關(guān)基因， 但是對(duì)維持妊娠的基因發(fā)掘較少，在母畜妊娠時(shí)期，需要母體和胎盤激素的協(xié)同調(diào)控，孕激素和雌激素的作用至關(guān)重要［8-9］。目前， 以孕激素和雌激素作為妊娠診斷依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，關(guān)于綿羊妊娠轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究鮮有報(bào)道。妊娠期間內(nèi)分泌系統(tǒng)也發(fā)生變化， 妊娠黃體不可缺少。若受精卵發(fā)育正常，保證維持妊娠，周期黃體在卵巢中能夠轉(zhuǎn)化成妊娠黃體，分泌孕酮［10-11］。 該研究對(duì)綿羊不同妊娠時(shí)期卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得差異表達(dá)基因，探究與妊娠維持相關(guān)的重要基因。

1 材料與方法

1.1 樣本數(shù)據(jù)來源

從NCBI 的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)SRA 存儲(chǔ)庫(kù)下載3 個(gè)妊娠時(shí)期綿羊卵巢組織轉(zhuǎn)錄組的18 個(gè)樣本數(shù)據(jù)［12］。試驗(yàn)綿羊均為蘇格蘭黑面羊和特克賽爾羊F1代雜交品種，3 個(gè)妊娠時(shí)間分別為妊娠23 d、妊娠35 d 和妊娠100 d， 每個(gè)妊娠時(shí)間有6 個(gè)技術(shù)重復(fù)樣本。

1.2 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Z-Score 方法， 對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。 將妊娠23 d、妊娠35 d 的綿羊卵巢組織基因進(jìn)行比較，妊娠35 d、妊娠100 d 的綿羊卵巢組織基因進(jìn)行比較。使用R 語言的limma包進(jìn)行差異分析， 篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）， 以P-Value<0.05和|logFC|≥2 作為篩選DEGs 的條件［13］。利用DAVID在線軟件對(duì)DEGs 注釋及功能富集分析， 并以PValue<0.05 作為信號(hào)通路顯著富集的標(biāo)志［14］。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

在妊娠23 d、妊娠35 d 綿羊卵巢組織基因中篩選出54 個(gè)DEGs，在妊娠35 d、妊娠100 d 綿羊卵巢組織基因中篩選出68 個(gè)DEGs， 兩組均包含HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2 和HSP90B1 基因。

2.2 差異表達(dá)基因功能富集分析

妊娠23 d 與妊娠35 d 綿羊卵巢組織基因的54 個(gè)DEGs 顯 著 富 集 到6 條 通 路 （P-Value<0.05）， 包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工信號(hào)通路（protein processing in endoplasmic reticulum）、 核糖體信號(hào)通路（ribosome）、雌激素信號(hào)通路（estrogen signaling pathway）、 癌癥蛋白聚糖信號(hào)通路（proteoglycans in cancer）、 擴(kuò)張型心肌病信號(hào)通路（dilated cardiomyopathy）和肥厚型心肌病信號(hào)通路（hypertrophic cardiomyopathy）（見圖1）。

圖1 妊娠23 d 與妊娠35 d 綿羊卵巢DEGs 顯著富集的KEGG 通路

妊娠35 d、 妊娠100 d 綿羊卵巢的68 個(gè)DEGs 顯著富集到11 條通路 （P-Value<0.05），包括癌癥相關(guān)信號(hào)通路（pathways in cancer）、黏著斑信號(hào)通路（focal adhesion）、抗原加工與提呈信號(hào)通路（antigen processing and presentation）、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號(hào)通路 （ECM-receptor interaction）、細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞信號(hào)通路（bacterial invasion of epithelial cells）、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工信號(hào)通路、核糖體信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥蛋白聚糖信號(hào)通路和前列腺癌信號(hào)通路（prostate cancer）（見圖2）。

圖2 妊娠35 d 與妊娠100 d 綿羊卵巢DEGs 顯著富集的KEGG 通路

3 討論

隨著人們生活水平的提高， 對(duì)綿羊產(chǎn)肉的品質(zhì)及所含的營(yíng)養(yǎng)成分有更高要求，因此，在保證綿羊肉品質(zhì)的同時(shí)， 提高綿羊繁殖能力才能滿足市場(chǎng)的需求。

該研究對(duì)綿羊不同妊娠時(shí)期卵巢轉(zhuǎn)錄組分析， 發(fā)現(xiàn)不同妊娠時(shí)期的卵巢篩選出的DEGs 均富集到雌激素信號(hào)通路。 雌激素是由卵巢和胎盤分泌的一種重要生殖激素，對(duì)動(dòng)物發(fā)情、分娩等生殖功能起著重要作用［15］。 在雌激素信號(hào)通路中包括HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2 和HSP90B1 基因。有研究表明糖皮質(zhì)激素受體（GR）NR3C1 及其共同伴侶HSP90AA1 存在差異甲基化， 可能在妊娠期應(yīng)激反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用， 可能是子癇前期的一 個(gè) 生 理 病 理 機(jī) 制［16-18］。 Nikishin 等［19］研 究 表 明HSP90AB1 基因可作為卵巢組織的參考基因［20］。在妊娠過程中，子宮的狀態(tài)一直在變化。正常妊娠期間的血管舒張， 胎盤形成和子宮擴(kuò)張會(huì)引起MMP2表達(dá)增加。在妊娠期間，各種分子參與著床和維持子宮內(nèi)膜功能。 MMP2 在子宮內(nèi)膜基質(zhì)重塑這一協(xié)調(diào)妊娠進(jìn)程的必要過程中起著重要作用［21］。 細(xì)胞外基質(zhì)成分可以被MMP2 降解， 在排卵和妊娠過程中具有重要作用， 能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成［22］。 MMP2 基因啟動(dòng)子存在單核苷酸多態(tài)性，有研究表明MMP2-735T 等位基因與反復(fù)自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)［23-24］。 Gremlich 等［25］表明胎兒MMP2-1306 與宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。 研究表明PRL8A2 是孕激素調(diào)節(jié)宮內(nèi)對(duì)生理性應(yīng)激反應(yīng)的媒介，PRL8A2 缺失會(huì)使HSP90B1 的表達(dá)顯著升高，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)［26］。

4 結(jié)論

通過對(duì)不同妊娠時(shí)期卵巢轉(zhuǎn)錄組比較分析，發(fā)現(xiàn)在妊娠期間雌激素信號(hào)通路上的基因表達(dá)有著很大差異， 包括HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2和HSP90B1 基因，這些基因可能對(duì)綿羊妊娠維持有著重要的作用。