王宜平，周鵬飛，葉正欽，李真誠，唐清秀，紀春曉,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128；2.湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128)

馬立克氏病(Marek's disease，MD)是由致瘤性馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)Ⅰ型毒株引起，其致瘤相關(guān)的基因有meq基因、抑瘤基因P53、細胞周期抑制蛋白P21、端粒酶、雙向啟動子pp38/pp24基因與1.8 kb基因家族、Vil-8基因及miRNA[1]等。MDV野毒株在疫苗的防御機制下已逐漸出現(xiàn)點突變和多態(tài)性變化,導(dǎo)致疫苗不能有效地抵抗MDV的攻擊從而引起免疫失敗，給國內(nèi)外的養(yǎng)雞行業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2]。研究表明，MD發(fā)病機理分為4個階段，即早細胞溶解期、潛伏期、晚細胞溶解期和增生期。首先，MDV將自身VP23蛋白編碼為一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，阻斷環(huán)GMP-AMP合成酶和干擾素基因刺激物誘導(dǎo)的β干擾素(interferon-β，IFN-β)的活化，并且選擇性抑制IFN調(diào)節(jié)因子7(interferon regulator factor 7，IRF7)，阻斷其與TANK結(jié)合激酶1(TANK binding kinase-1，TBK1)的結(jié)合，進而抑制IRF7磷酸化和核易位，從而降低IFN-β的產(chǎn)生，攻克宿主先天免疫防御的第一道防線I型干擾素反應(yīng)[3]。其次操縱宿主細胞的新陳代謝，劫持宿主細胞的糖酵解和谷氨酰胺分解無反應(yīng)性底物，以提供MDV復(fù)制所需的能量和大分子[4]。然后在感染MDV的6 d(dpi)進入早細胞溶解期，即B細胞溶解期，胸腺中大多數(shù)感染的細胞發(fā)生凋亡，而法氏囊中是大多數(shù)未感染的細胞發(fā)生凋亡造成原發(fā)性淋巴器官萎縮，引起嚴重的B淋巴細胞減少[5]。再次是潛伏期，當細胞不依賴于線粒體β-氧化時，最佳的MDV復(fù)制就會重新啟動激活[6]，進入晚細胞溶解期，病毒已被逐漸放大并轉(zhuǎn)移至T細胞，機體免疫力受到抑制[7]。最后是增生期，MDV作用于CD4+T淋巴細胞，從而誘導(dǎo)致命的淋巴瘤[8]。

二烯丙基二硫化物(diallyl disulfide，DADS)對多種惡性腫瘤細胞有抑制增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)分化凋亡等作用，如人骨肉瘤[9]、白血病[10]、宮頸癌[11]、胃癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、卵巢癌[14]、肺癌[15]、乳腺癌[16]。我國藥典上稱大蒜素為二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide，DATS)是不準確的，首先大蒜素中有效成分有很多，DADS為其中之一；然后DADS與DATS活性相當；接著暴露在空氣中，DADS穩(wěn)定性強，而DATS易分解；最后DADS毒性小于DATS[17]。為了闡釋DADS誘導(dǎo)馬立克氏病腫瘤細胞(Marek's lymphoma cell line，MDCC-MSB-1)凋亡的作用機制，試驗通過檢測DADS對MDCC-MSB-1細胞的活力、形態(tài)學、caspase-8蛋白酶活性增加比、Fas/FasL信號通路相關(guān)因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化，以探究其誘導(dǎo)凋亡機制，為病毒性腫瘤病的治療提供比較醫(yī)學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用細胞 馬立克氏病腫瘤細胞系MDCC-MSB-1細胞為哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈。

1.1.2 藥品與試劑 二烯丙基二硫化物(DADS)，F(xiàn)luka公司產(chǎn)品；吐溫-80，天津恒興化學試劑有限公司產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基，美國HyClone公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)，四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素，賽因百奧生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMSO)、PBS緩沖液、Hoechst 33342染色液、caspase-8活性測定試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；CCK-8試劑盒，美國GenView公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑，Takara公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇、無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；RT-PCR SuperMix、qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；OptiClean 1300超凈工作臺，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司產(chǎn)品；AE2000倒置熒光顯微鏡，Olymopus公司產(chǎn)品；318C+酶標儀，上海沛歐分析儀器有限公司產(chǎn)品；Neofuge 13R高速冷凍離心機，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司產(chǎn)品；核酸測定儀，德國 IMPLEN產(chǎn)品；DYY-2C 瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；Tanon-3500凝膠成像分析儀，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；PCR儀器、CFX ConnectTM熒光定量PCR儀，美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 二烯丙基二硫化物的制備 DADS試劑與Tween-80以1∶2的比例配制成母液，試驗?zāi)敢簼舛葹?8 230 μmol/L，用無菌生理鹽水稀釋成400、800、1 600、2 400 μmol/L不同濃度的溶液，置-20℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同濃度二烯丙基二硫化物作用MDCC-MSB-1細胞不同時間的抑制率 取對數(shù)生長期MDCC-MSB-1細胞，完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1.2×105個/mL，設(shè)置空白組(90 μL完全培養(yǎng)基+10 μL生理鹽水)，對照組(90 μL細胞懸液+10 μL生理鹽水)和試驗組(90 μL細胞懸液+10 μL不同濃度的DADS(使得DADS終濃度為40、80、160、240 μmol/L))，于96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)24、48、72 h，在到達培養(yǎng)時間時每孔加入10 μL CCK-8溶液再放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，于酶標儀上檢測OD450 nm值，根據(jù)OD值計算抑制率。

抑制率=[OD(對照組)-OD(試驗組)]/[OD(對照組)-OD(空白組)]×100%

1.2.3 不同濃度二烯丙基二硫化物作用MDCC-MSB-1細胞24 h后形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期MDCC-MSB-1細胞，完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為6×105個/mL，設(shè)置對照組(1.8 mL細胞懸液+200 μL生理鹽水)和試驗組(1.8 mL細胞懸液+200 μL不同濃度的DADS(使得DADS終濃度為80、160、240 μmol/L))，于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。然后2 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，用1 mL的Hoechst 33342染色工作液吹勻細胞沉淀，置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱再孵育20 min，PBS清洗細胞1遍后，置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.2.4 不同濃度DADS作用MDCC-MSB-1細胞24 h后caspase-8蛋白酶活性檢測 根據(jù)Bradford蛋白濃度測定試劑盒和caspase-8活性測定試劑盒說明書測出BSA標準蛋白和ρNA底物的標準曲線。取對數(shù)生長期MDCC-MSB-1細胞，完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為6×105個/mL，設(shè)置對照組(2.7 mL細胞懸液+300 μL生理鹽水)和試驗組(2.7 mL細胞懸液+300 μL不同濃度的DADS(使得DADS終濃度為80、160、240 μmol/L))，于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將細胞裂解根據(jù)BSA標準蛋白曲線檢測提取的細胞蛋白濃度，達到1 mg/mL～3 mg/mL后采用低酶反應(yīng)體系(60 μL反應(yīng)緩沖液，35 μL待測樣品，5 μL IETD-ρNA底物)，加入96孔板中，每組3個復(fù)孔。蓋緊96孔板并用封口膜密封，置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，于酶標儀上檢測OD405 nm值，根據(jù)OD值計算caspase-8活性增加的百分比。

活性增加的百分比=[OD(試驗組)/OD(對照組)]×100%

1.2.5 不同濃度二烯丙基二硫化物作用MDCC-MSB-1細胞24 h后Fas/FasL信號通路因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平檢測 登錄GenBank，根據(jù)已有的雞Fas、FADD、caspase-8、Bid、caspase-3和內(nèi)參基因β-actin mRNA核苷酸序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計相對應(yīng)的引物，由擎科生物有限公司合成，所用引物序列(表1)。取對數(shù)生長期MSB-1細胞，完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為6×105個/mL，設(shè)置對照組(2.7 mL細胞懸液+300 μL生理鹽水)和試驗組(2.7 mL細胞懸液+300 μL不同濃度的DADS(使得DADS終濃度為80、160、240 μmol/L))，于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將細胞裂解提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，普通PCR驗證cDNA是否轉(zhuǎn)錄成功，凝膠電泳拍照以及熒光定量PCR儀上擴增，共40個循環(huán)，每個樣品3個重復(fù)。

表1 引物信息

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計，以單因素多重比較分析差異性，其中P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著。采用Excel和GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度二烯丙基二硫化物作用MDCC-MSB-1細胞不同時間的抑制率

通過不同濃度的DADS作用MDCC-MSB-1細胞不同時間，于酶標儀上檢測其OD450 nm值，并根據(jù)公式計算出抑制率。結(jié)果顯示，隨著DADS濃度的升高或者作用時間的延長，抑制率均呈升高趨勢，呈時間劑量依賴性(圖1)。說明MDCC-MSB-1細胞對DADS具有較高的敏感性。并由圖1結(jié)果決定后續(xù)試驗低、中、高劑量組，分別為80、160、240 μmol/L。

圖1 DADS作用MDCC-MSB-1細胞的抑制率

2.2 不同濃度二烯丙基二硫化物作用MDCC-MSB-1細胞24 h對形態(tài)的影響

通過不同濃度的DADS作用MDCC-MSB-1細胞24 h，分別直接置于光學顯微鏡下(400×)和核酸染色后置于熒光顯微鏡下(400×)觀察細胞的形態(tài)變化。結(jié)果顯示，光學顯微鏡下細胞呈圓形或者類圓形，細胞膜完整，胞體較大，胞漿量較多(圖2A)，細胞的形態(tài)不規(guī)則，細胞膜完整但呈長條狀和出泡狀(圖2C)，細胞體積縮小，胞內(nèi)有小泡生成，細胞數(shù)量減少(圖2D)。熒光顯微鏡下細胞染色質(zhì)致密深染，細胞核位于細胞中央(圖3A)，細胞的細胞質(zhì)密度增加，核膜消失(圖3B)，細胞染色體DNA降解為多個片段，片段邊緣化(圖3C)，右下側(cè)細胞細胞膜完整，細胞殘骸被包裹為凋亡小體(圖3D)。說明DADS可從凋亡方向抑制MDCC-MSB-1細胞的增殖。

A.對照組；B.80 μmol/L；C.160 μmol/L；D.240 μmol/LA.Control group；B.80 μmol/L；C.160 μmol/L；D.240 μmol/L

A.對照組；B.80 μmol/L；C.160 μmol/L；D.240 μmol/LA.Control group；B.80 μmol/L；C.160 μmol/L；D.240 μmol/L

2.3 不同濃度二烯丙基二硫化物作用MDCC-MSB-1細胞24 h對caspase-8蛋白酶活性的影響

根據(jù)Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書測出盒內(nèi)BSA標準蛋白OD570 nm對濃度的標準曲線(圖4)。根據(jù)caspase-8活性測定試劑盒說明書測出盒內(nèi)ρNA底物產(chǎn)物OD405 nm對濃度的標準曲線(圖5)。之后通過BSA標準蛋白曲線計算不同濃度的DADS作用MDCC-MSB-1細胞24 h后提取的蛋白濃度，達到1 mg/mL～3 mg/mL后采用低酶反應(yīng)體系試驗，通過ρNA底物產(chǎn)物標準曲線計算caspase-8蛋白酶活性，最終通過上述公式計算caspase-8蛋白活性增加的百分比。結(jié)果顯示，試驗組中、高劑量組均相對對照組差異極顯著(P<0.01)(圖6)。說明DADS可誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細胞的凋亡啟動酶caspase-8蛋白的活性增強。

圖4 BSA蛋白標準曲線

圖5 ρNA底物產(chǎn)物標準曲線

**P<0.01

2.4 不同濃度二烯丙基二硫化物作用MDCC-MSB-1細胞24 h對Fas/FasL信號通路相關(guān)因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過提取總RNA，確保0、80、160、240 μmol/L試驗組OD260/OD280在正常范圍內(nèi)且核酸濃度達標，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。之后選取80 μmol/L試驗組經(jīng)普通PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物大小以及引物的特異性。結(jié)果顯示引物特異性高，符合要求(圖7)。

M.DNA標準DL 2 000；1.β-actin；2.Fas；3.FADD；4.Caspase-8；5.Caspase-3；6.Bid

通過熒光定量PCR檢測Fas/FasL凋亡通路相關(guān)因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，低、中、高劑量組的DADS均能夠誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細胞中Fas/FasL凋亡通路相關(guān)因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加。其中caspase-3 mRNA的相對表達量在低劑量組(80 μmol/L)時呈減少，與對照組相比，F(xiàn)as/FasL凋亡通路相關(guān)因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在高劑量組均顯示差異極顯著(P<0.01)，F(xiàn)ADD mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在低中高劑量組均顯示差異極顯著(P<0.01)，Bid mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在中劑量組(160 μmol/L)顯示差異顯著(P<0.05)。另外，caspase-3 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在低劑量組(80 μmol/L)時呈減少現(xiàn)象，但其與中劑量組存在差異極顯著(P<0.01)(圖8)。說明DADS可通過Fas/FasL凋亡通路誘導(dǎo)MDCC-MSB-1細胞的凋亡。

A.Fas mRNA；B.FADD mRNA；C.Caspase-8 mRNA；D.Caspase-3 mRNA；E.Bid mRNA；*P<0.05,**P<0.01

3 討論

馬立克氏病(MD)是一種引起雞淋巴組織增生性的免疫抑制性的高度傳染性的腫瘤病[18]，傳染源是病雞和帶毒雞，傳播方式是帶毒雞羽毛囊上皮內(nèi)攜帶的完整的病毒，經(jīng)皮膚代謝脫落擴散到環(huán)境中和帶毒的設(shè)備、飼料、人員經(jīng)空氣傳播[19]，傳播途徑是經(jīng)呼吸道吸入體內(nèi)感染，雌性肉雞易感性高，其中剛出殼的雛雞易感性最強。臨床上常見神經(jīng)型(多見于侵害一側(cè)臂神經(jīng)或坐骨神經(jīng)橫紋消失，灰黃色，增粗至正常的2倍～3倍)和內(nèi)臟型(多見于內(nèi)臟器官呈結(jié)節(jié)狀腫瘤)。同時，馬立克氏病病毒是唯一的一種可以用疫苗防控的腫瘤性皰疹病毒，疫苗的免疫程序根據(jù)所選的疫苗的不同有所差異，疫苗的保存和應(yīng)用根據(jù)所選的疫苗類型(即凍干苗和液氮苗)的不同也有所差異[20]。此外，馬立克氏病病毒的毒力在不斷地增強，這都給馬立克氏病的免疫失敗帶來了高風險。

CCK-8試劑盒中，主要的化學藥品是WST-8，化學成分與MTT相同，但具有毒性小、靈敏度高、直接使用檢測時間短的特點[21]。WST-8進入到活細胞中，可以被MSB-1細胞中的NAD氧化還原成為水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan)。產(chǎn)生的Formazan越多，顏色會越深，OD值也就越高，活細胞數(shù)量也就越多?？梢苑从矰ADS處理MSB-1細胞24、48、72 h后對細胞抑制率的變化。在該試驗研究中，發(fā)現(xiàn)抑制率呈時間劑量依賴性，同時，40 μmol/L和80 μmol/L二烯丙基二硫化物抑制率無差異性，為使低、中、高劑量組呈等梯度濃度，選擇了0、80、160、240 μmol/L作為二烯丙基二硫化物的空白、低、中、高摩爾濃度進行后續(xù)研究。

在作用24 h后，放置在光學顯微鏡和核酸染色后放置在熒光顯微鏡下觀察，能較為直觀的發(fā)現(xiàn)MSB-1細胞發(fā)生了凋亡所特有的形態(tài)學特征，提供了DADS可誘導(dǎo)MSB-1細胞發(fā)生凋亡的依據(jù)，為后續(xù)的作用機制探究做鋪墊。

Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族成員，直接參與并執(zhí)行凋亡程序，是白細胞介素1β轉(zhuǎn)化酶(interleukin-1βconverting enzyme，ICE)系列的總稱[22]。根據(jù)其在凋亡過程中功能的不同可再細分為凋亡啟動者(caspase-2、-8、-9、-10)和凋亡執(zhí)行者(caspase-3、-6、-7)。其功能不同與caspase蛋白酶的結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。procaspase蛋白是由一個前端結(jié)構(gòu)域(Pro)和活性域(大、小亞基及其連接區(qū))組成，其中凋亡啟動者在細胞中以procaspase蛋白無活性的單體存在，procaspase-8前端結(jié)構(gòu)域為死亡效應(yīng)區(qū)(death effector domain，DED)，當接收到凋亡刺激信號時，procaspase-8依賴于死亡受體誘導(dǎo)凋亡信號復(fù)合體(death-inducing signaling complex，DISC)得以募集，caspase-8蛋白酶以DED-DED方式結(jié)合，使得凋亡啟動者高濃度聚集[23]，之后以同源二聚體形勢自我活化并作用下游效應(yīng)蛋白[24]。因此，caspase-8蛋白酶活性在外源性Fas/FasL死亡受體凋亡通路有著啟動的關(guān)鍵作用。

在本研究結(jié)果表明，二烯丙基二硫化物可誘導(dǎo)MSB-1細胞caspase-8蛋白酶活性增強，這說明二烯丙基二硫化物可有效誘導(dǎo)MSB-1細胞發(fā)生Fas/FasL死亡受體通路的啟動。

Fas/FasL屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族，二者均為跨膜蛋白(由胞膜外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成)。其中Fas為Ⅰ型跨膜蛋白，胞外區(qū)為富含半胱氨酸重復(fù)序列的信號序列，胞內(nèi)區(qū)為稱為死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)的蛋白結(jié)合域，在體內(nèi)大部分細胞表達。FasL則為Ⅱ型跨膜蛋白，胞外區(qū)為疏水氨基酸結(jié)構(gòu)，具有從細胞膜表面脫落下來，形成可溶性配體分子，通過自分泌和旁分泌的方式影響全身細胞的能力[25]，只表達于活化的T細胞和鼠睪丸細胞中[26-27]。當兩者結(jié)合被激活，F(xiàn)as的DD相互作用，募集Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(fas-associating protein with a novel death domain，F(xiàn)ADD)，而FADD具有DED死亡效應(yīng)區(qū)，募集procaspase-8形成DISC并活化[28]。隨后直接效應(yīng)下游蛋白caspase-3，形成Fas/FasL死亡受體通路；或者切割Bid成tBid，tBid在其N端被豆蔻?；?N-myristoylation)修飾后[29]，作用線粒體表面Bax/Bcl-2，形成死亡受體通路與線粒體凋亡通路并存。

本研究表明，DADS可誘導(dǎo)MSB-1細胞Fas、FADD、caspase-8、caspase-3及Bid mRNA表達水平升高，在高劑量組最明顯，都呈極顯著升高。其中FADD mRNA在低劑量組表現(xiàn)為極顯著，說明誘導(dǎo)Fas/FasL所形成的死亡效應(yīng)區(qū)作用明顯，但是在低劑量組并沒有顯著性升高caspase-8 mRNA的表達水平，反倒降低了caspase-3 mRNA的表達水平，這可能的原因有好幾種，可能是細胞自身存在負反饋調(diào)節(jié)作用，減緩了藥物的作用；可能活化的caspase-8蛋白酶更多的作用于Bid，開啟線粒體凋亡通路，這和中劑量組Bid mRNA表達水平顯著升高，而caspase-3 mRNA表達水平無顯著變化相應(yīng)證；還可能存在其他調(diào)節(jié)。因此，二烯丙基二硫化物可誘導(dǎo)馬立克氏腫瘤細胞MSB-1的凋亡及發(fā)生Fas/FasL信號通路調(diào)控作用，但尚需就其誘導(dǎo)凋亡作用及機制進行深入研究，以便闡釋二烯丙基二硫化物在病毒性腫瘤疾病中的作用機制。