金元昌，曹清國(guó)，鄭傳丹，曾 鋼，郝美林，姜麗霞，陳明麗

(1.遵義師范學(xué)院，貴州遵義 563006；2. 內(nèi)蒙古牙克石市烏爾其漢鎮(zhèn)綜合保障和技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古牙克石 022159)

脊椎動(dòng)物依靠免疫系統(tǒng)來抵抗、防御病原微生物的侵襲，其免疫應(yīng)答被分為天然免疫和獲得性免疫，獲得性免疫包括體液免疫和細(xì)胞免疫，細(xì)胞免疫主要由細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL，CD8+)完成。CTL對(duì)靶細(xì)胞有特異殺傷作用，它自身并不能直接識(shí)別抗原，而是需要抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)協(xié)助。APC能夠有效攝取病原微生物或其他抗原并將其加工成8個(gè)～11個(gè)氨基酸的短肽，再由主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子(MHCⅠ)遞呈到細(xì)胞表面?？乖谋贿f呈表達(dá)后，T細(xì)胞上的抗原受體(T cell receptor，TCR)識(shí)別并結(jié)合MHCⅠ-抗原肽復(fù)合物，在CD8分子協(xié)助下T細(xì)胞和APC相互作用，啟動(dòng)CTL(效應(yīng)T細(xì)胞)活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

效應(yīng)T細(xì)胞通過激活靶細(xì)胞內(nèi)的溶酶體酶使靶細(xì)胞裂解死亡，其中TCR-MHCⅠ-抗原肽復(fù)合物為激活特異性CTL的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。只有MHCⅠ遞呈了合適的抗原肽并與TCR相互作用才能激發(fā)CTL免疫應(yīng)答。因此，MHCⅠ分子是CTL免疫應(yīng)答的核心分子，也是結(jié)構(gòu)免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)。

MHCⅠ存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，由α鏈和β2m兩部分以非共價(jià)鍵結(jié)合組成，前者由MHC基因所編碼，具有多態(tài)性；后者由非MHC基因所編碼，不具備多態(tài)性。以人MHCⅠ(HLA-A2)為例，α鏈胞外部分由α1、α2和α3三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含大約90個(gè)氨基酸；α鏈跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域由大約25個(gè)疏水氨基酸構(gòu)成，其后有一小段帶電親水氨基酸；α鏈胞質(zhì)尾區(qū)由30個(gè)氨基酸組成(圖1)。α1和α2結(jié)構(gòu)域位于MHCⅠ的頂部，具有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其螺旋結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)離細(xì)胞膜，指向外部，供TCR識(shí)別。α1和α2都含有一個(gè)反向平行的β片層和一個(gè)長(zhǎng)的α螺旋區(qū)域，兩者共同形成一個(gè)底部由8個(gè)β折疊組成的反向平行的β片層、兩側(cè)由兩個(gè)長(zhǎng)α螺旋構(gòu)成的平臺(tái)，即多肽結(jié)合槽。多肽結(jié)合槽位于MHCⅠ分子的頂部，抗原多肽平躺在此凹槽中。根據(jù)抗原多肽結(jié)合情況，整個(gè)MHCⅠ多肽結(jié)合槽可以劃分成6個(gè)口袋，依次為A～F。每個(gè)口袋都由一組MHCⅠ氨基酸構(gòu)成，表現(xiàn)出不同的形狀、大小、化學(xué)性質(zhì)和帶電性等[1]?？乖嚯纳系膫?cè)鏈能夠結(jié)合到以上口袋中并且形成比較強(qiáng)相互作用的氨基酸稱為錨定殘基，含有這些錨定殘基的多肽序列則稱為多肽基序。

圖1 MHCⅠ類分子及其編碼基因的結(jié)構(gòu)

1987年，HLA-A2的三維晶體結(jié)構(gòu)首次被解析，目前，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(protein databank,PDB)中儲(chǔ)存已測(cè)定的雞MHCⅠ分子結(jié)構(gòu)共有14個(gè)，其中涉及B2、B4、B14和B21單倍型，全部由X線衍射技術(shù)測(cè)定并解析。MHCⅠ分子本身是一個(gè)跨膜蛋白，但由于之前的技術(shù)條件所限，無法制備出X線衍射技術(shù)所需的跨膜蛋白晶體，所以目前PDB中所有生物的MHCⅠ分子都未能包含跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)。

本文從結(jié)構(gòu)免疫學(xué)角度，重點(diǎn)解析雞MHCⅠ類分子三維結(jié)構(gòu)與抗原多肽結(jié)合特征對(duì)MD/RS遺傳抗性的影響，為養(yǎng)禽業(yè)中抗病育種、病毒多肽抗原篩選以及疫苗設(shè)計(jì)提供參考。

1 MHCⅠ分子與脊椎動(dòng)物多種疾病的抗性相關(guān)性研究

1.1 MHCⅠ分子與哺乳動(dòng)物以及禽類多種疾病的抗性相關(guān)

MHC由一組緊密連鎖、高度多態(tài)的基因座位組成，在脊椎動(dòng)物的移植排斥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控等方面起極其重要的作用。不同物種的MHC分子結(jié)構(gòu)有所差異，但在組織分布和功能等方面卻有許多類似的特征。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物和禽類MHC分子的外部整體結(jié)構(gòu)大致相同，大部分高度變異的氨基酸殘基都發(fā)生在其α鏈的抗原結(jié)合區(qū)，且部分高度多態(tài)的殘基位于不同物種的相同位置。這些高度多態(tài)的氨基酸位點(diǎn)，可能更有利于MHC分子空間結(jié)構(gòu)的微調(diào)整，使其參與不同抗原肽的識(shí)別與遞呈[2-4]。由MHC的表達(dá)產(chǎn)物廣泛參與各種病原體抗原的識(shí)別，其遺傳背景的差異可導(dǎo)致不同個(gè)體抗病能力的差異。目前已經(jīng)證實(shí)，MHC與哺乳動(dòng)物以及禽類多種疾病的抗性相關(guān)[5-7]，然而哺乳動(dòng)物MHC的多樣和復(fù)雜性導(dǎo)致其相關(guān)研究較為困難。與哺乳動(dòng)物相比，雞MHC結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且緊密，具有最低限度的功能基本單元。因而，禽類系統(tǒng)被認(rèn)為是研究MHC與疾病關(guān)系的潛力候選載體。

雞MHC(又稱B復(fù)合體)包含B和Y兩個(gè)主要區(qū)域。B區(qū)包括3個(gè)基因群,即BF、BL和BG，其中BF和BL所編碼的抗原在結(jié)構(gòu)和功能上分別與哺乳動(dòng)物MHCⅠ類和MHCⅡ類分子類似。B復(fù)合體也與雞多種疾病的抗性相關(guān)[8-9]，比如馬立克氏病(Marek's disease，MD)、勞氏肉瘤病(Rous sarcoma，RS)、禽白血病(Avian leukosis，AL) 和禽流感病(Avian influenza，AI)等病毒性傳染病。

馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)屬于皰疹病毒，基因組為雙鏈DNA，至少編碼80種蛋白。MDV感染可引起雞的淋巴組織增生性腫瘤病，具有高度傳染性并造成雞只死亡，MD被列為世界養(yǎng)禽業(yè)最重要的疾病之一。Briles W E等[10]對(duì)B復(fù)合體在白來航雞N系和P系中的影響進(jìn)行研究，結(jié)果證明B21單倍型對(duì)MD的抗性遠(yuǎn)高于B19。Briles W E等[10]對(duì)一系列 B單倍型雞影響MD抗性的研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，指出B21具有最強(qiáng)的MD抗性， B2具有中等抵抗力，而B15、B13和B19最為易感，這充分說明B復(fù)合體與MD抗性存在相關(guān)性。Briles W E等[11]報(bào)道了MD抗性品系和易感品系中B復(fù)合體的差異情況，結(jié)果表明MD抗性與B復(fù)合體BF區(qū)相關(guān)，而且很可能與MD抗性相關(guān)的主效基因就存在其中。

勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)是一種基因組較小的反轉(zhuǎn)錄病毒，只編碼4個(gè)基因。雞對(duì)RS的抗性也與B復(fù)合體有關(guān)，B2和B12單倍型表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，而B4、B5和B15則易感[12]。Khare V M等[13]報(bào)道，B2、B21和 B22單倍型表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，而B13、B13.1、 B15、B15.1和 B15.2則易感。研究表明RS的抗性基因也主要位于BF區(qū)。

1.2 MHCⅠ分子結(jié)合抗原譜與禽類多種病毒性傳染病的抗性相關(guān)

Kaufman J等[14-16]對(duì)白來航雞B12單倍型B區(qū)的全部基因進(jìn)行序列測(cè)定。發(fā)現(xiàn)B區(qū)全長(zhǎng)92 kb，包含19個(gè)基因，長(zhǎng)度不足人MHC基因的1/20。其中，BF區(qū)的抗原加工相關(guān)載體(transporter associated with antigen processing，TAP)位于兩個(gè)BF(分別為BF1和BF2)α鏈之間。雖然BF1和BF2分子的核酸序列類似，但二者的功能明顯不同，BF2分子的主要功能是提呈抗原而BF1分子可能是NK細(xì)胞抑制性受體的重要配體[17]。與哺乳動(dòng)物相比，BF2分子是雞唯一能提呈抗原的MHCⅠ分子，也許正是這種原因致使BF分子結(jié)合抗原譜與哺乳動(dòng)物比較很窄(圖2)，這樣就不能對(duì)某些病原微生物抗原進(jìn)行有效遞呈，因此就會(huì)有不同B單倍型雞對(duì)MD和RS等疾病抗性不同的情況。

圖2 雞與哺乳動(dòng)物MHC分子結(jié)合抗原譜的區(qū)別

雞BF2分子核苷酸水平的研究已較為深入，但其基因功能的實(shí)現(xiàn)最終還是要靠蛋白質(zhì)來完成，而且在從DNA到蛋白質(zhì)的過程中還有一些已知和未知的調(diào)控機(jī)制施加影響。因此，對(duì)雞BF2分子三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和研究，并著重分析其與抗原多肽相互作用關(guān)鍵位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu),進(jìn)而從結(jié)構(gòu)免疫學(xué)角度，解析雞BF2分子影響MD/RS遺傳抗性的基礎(chǔ)[18]。

2 雞BF2分子三維結(jié)構(gòu)與抗原多肽結(jié)合特征的研究

2.1 天然BF2分子肽結(jié)合基序的研究

通過體外肽洗脫和測(cè)序的方法， Kaufman J等[19]和Wallny H J等[12]]成功的獲取了B15、B12和 B4單倍型雞天然BF2分子肽結(jié)合基序，它們的多肽基序表現(xiàn)一定的規(guī)律性，且只能結(jié)合少數(shù)幾種抗原肽。而Chappell P等[20-21]和Koch M等[22]在研究B21、B14和B2天然BF2分子肽結(jié)合基序時(shí)發(fā)現(xiàn)，洗脫下來的多肽沒有表現(xiàn)一定的規(guī)律性，非常雜亂。

2.2 非跨膜BF2分子肽結(jié)合基序的研究

Koch M等[22]對(duì)體外構(gòu)建B21非跨膜的BF2分子BF*2101的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，得到2個(gè)結(jié)合不同多肽的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示，BF*2101的多肽結(jié)合槽異常大(平均為1 570 ?3)、入口寬(14.42 ?)，使得Arg9處在一個(gè)相對(duì)中間、突出的位置，活動(dòng)范圍較大，完全可以隨著周圍環(huán)境的變化而改變構(gòu)象，借助鹽鍵形成，以多種可能的形態(tài)發(fā)揮其在抗原多肽結(jié)合過程中的錨定作用。這使得BF*2101有更大的可能性結(jié)合并呈遞多種抗原多肽，引發(fā)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為MD/RS抗性。ZHANG J等[23]對(duì)體外構(gòu)建B4非跨膜的BF2分子BF*0401的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，得到了3個(gè)結(jié)合不同多肽的晶體結(jié)構(gòu)(BF*0401-IE8、BF*0401-P5A和BF*0401-P8D)。結(jié)構(gòu)顯示，該分子的多肽結(jié)合槽體積較小(平均為1 130 ?3)、入口狹窄(10.23 ?)、Arg80的指向具有傾向性以及Arg9、Arg80和Arg111這3個(gè)“口袋”位置的關(guān)鍵氨基酸均為正電荷，這3個(gè)因素導(dǎo)致了B4單倍型BF2分子只能與少數(shù)的錨定殘基結(jié)合，因而其在結(jié)合抗原多肽上有著嚴(yán)格的限制性，引發(fā)免疫反應(yīng)的抗原譜很窄，表現(xiàn)為MD/RS易感。王威等[24]利用PyMol等軟件對(duì)B2非跨膜的BF2分子BF*0201的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，得出了B2單倍型比B4單倍型BF2分子能結(jié)合更多種類的錨定殘基，與之相反，B2單倍型比B21單倍型BF2分子能結(jié)合更少種類的錨定殘基，因而B2單倍型BF2分子在結(jié)合抗原多肽的限制性上介于B4和B21單倍型之間，引發(fā)免疫反應(yīng)的抗原譜也介于二者之間，因此表現(xiàn)為MD中等抗性以及RS強(qiáng)抗性。

2.3 TAP與天然BF2分子肽結(jié)合基序的比較

抗原遞呈中多肽選擇有3個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一是低分子量蛋白酶體對(duì)細(xì)胞漿中多肽前體蛋白的選擇性水解作用，二是TAP對(duì)多肽轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性，三是MHCⅠ分子對(duì)多肽結(jié)構(gòu)的要求。這些選擇作用均決定于對(duì)多肽疏水性羧基端結(jié)構(gòu)和重要位點(diǎn)氨基酸殘基的識(shí)別。雞MHC基因極低水平的重組，使得MHCⅠ、TAP和TAP相關(guān)蛋白這些功能上相互(或單向)影響的基因能夠共同進(jìn)化[14,20]。與人等胎盤類哺乳動(dòng)物相比較，雞的TAP高度多態(tài)[14,25-26]。在將抗原肽輸送到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)時(shí)，雞TAP偏好性使其結(jié)合抗原肽具有特異性，Walker J等[14]研究表明,雞B4和B15單倍型TAP肽結(jié)合基序分別如下，B4：x-(D或E)-x-x-(D或E)-x-x-E；B15：(K或R)-R-x-x-x-x-x-(Y或F或W)。而Wallny H J等[12]]通過體外肽洗脫和測(cè)序方法得到天然的B4和B15單倍型BF2分子肽結(jié)合基序分別如下，B4：x-(D或E)-x-x-(D或E)-x-x-E；B15：(K或R)-R-x-x-x-x-x-Y或者(K或R)-R-x-x-x-x-x-x-Y。比較發(fā)現(xiàn)，雞TAP的這種偏好特異性與BF2分子肽結(jié)合基序特點(diǎn)基本相符，這也許是TAP和BF基因共同進(jìn)化的結(jié)果。其中，對(duì)于B4，二者肽結(jié)合基序完全相同；而對(duì)于B15，TAP肽結(jié)合基序范圍略大于BF2分子。Tregaskes C T等[27]分別對(duì)B21和B15 TAP和BF2分子肽結(jié)合基序研究也表明，TAP肽結(jié)合基序范圍大于BF2分子。綜合以上，TAP肽結(jié)合基序范圍大于等于BF2分子，這也符合抗原遞呈3個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)過程中，抗原多肽選擇范圍應(yīng)該逐步縮小的推測(cè)。

2.4 非跨膜BF2分子與天然BF2分子肽結(jié)合基序的比較

ZHANG J等[23]體外構(gòu)建B4非跨膜BF2分子BF2*0401-P5A和BF2*0401-P8D兩個(gè)晶體結(jié)構(gòu)和2.3這個(gè)推論(TAP肽結(jié)合基序范圍大于等于BF2分子)不符，其BF2*0401分子肽結(jié)合基序P5A(IDWFAGKE)和P8D(IDWFDGKD)竟然超過了TAP肽結(jié)合基序范圍，況且體外肽洗脫和測(cè)序的方法也表明天然BF2分子肽結(jié)合基序也不包括P5A和P8D。所以，雖然非跨膜BF2分子和天然BF2分子結(jié)構(gòu)基本相符[12,23]，但是兩者間還是有差別的。據(jù)此分析，BF2分子的跨膜區(qū)和/或胞質(zhì)尾區(qū)可能對(duì)其結(jié)構(gòu)完整性有一定影響，跨膜BF2分子結(jié)構(gòu)應(yīng)該更接近天然BF2分子。

3 脂立方相技術(shù)體系對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究的現(xiàn)狀

雖然膜蛋白具有重要的生理意義，其結(jié)構(gòu)生物學(xué)的進(jìn)展卻遠(yuǎn)落后于可溶蛋白。一個(gè)主要原因是，膜蛋白在從其天然脂雙層環(huán)境中分離到由去垢劑組成的囊束結(jié)構(gòu)后穩(wěn)定性變差，給結(jié)晶工作造成困難。而脂立方相比囊束結(jié)構(gòu)更接近天然磷脂雙分子層，因而可更好地維持膜蛋白的穩(wěn)定性[28]。脂立方相所解析的膜蛋白結(jié)構(gòu)分辨率一般都較高，在3.0 ?和2.5 ?以上的比率分別為83%和58%，它已經(jīng)成功地解析了多種膜蛋白結(jié)構(gòu)。一般的結(jié)晶過程都是在體外進(jìn)行，與生理環(huán)境條件迥異，因此，晶體結(jié)構(gòu)是否代表功能構(gòu)象?同樣，作為結(jié)晶介質(zhì)，脂立方相是否支持膜蛋白活性、膜蛋白在從去垢劑向脂立方相重構(gòu)的過程中是否有活性喪失等?磷酯酰甘油磷酸合成酶和二酰基甘油激酶在脂立方相中的活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)等研究證明脂立方相支持膜蛋白天然活性。

解析蛋白分子結(jié)構(gòu)的最主要手段是X射線晶體學(xué)技術(shù)，但大小合適的蛋白分子晶體的獲取是X射線晶體學(xué)技術(shù)的難點(diǎn)。盡管小晶體相對(duì)于大晶體較容易獲取，前者容易受到輻射損傷，很難獲得完整的結(jié)構(gòu)信息。利用激光光刻技術(shù)制作用于多顆晶體上樣的芯片，實(shí)現(xiàn)高通量的多顆晶體衍射數(shù)據(jù)收集，將多套數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，獲得無明顯輻射損傷的生物大分子結(jié)構(gòu)信息。基于芯片的晶體上樣技術(shù)為晶體學(xué)研究者提供了一種利用微聚焦光束線站進(jìn)行小晶體衍射數(shù)據(jù)收集并獲得無明顯輻射損傷高質(zhì)量衍射數(shù)據(jù)的高效手段[29-30]。

4 結(jié)語(yǔ)

雞非跨膜BF2分子結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)有了一定程度進(jìn)展，它和天然BF2分子基本相符，而跨膜BF2分子結(jié)構(gòu)似乎更接近天然BF2分子，不過由于之前無法制備出X線衍射所需的跨膜蛋白晶體，截止目前PDB中所有生物的MHCⅠ分子都未能包含跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)。因此，利用分子克隆、蛋白純化以及脂立方相等技術(shù)獲取B4單倍型雞跨膜BF2分子三維結(jié)構(gòu)，然后對(duì)其進(jìn)行如下研究：首先，通過對(duì)比已報(bào)道的B4非跨膜BF2分子，明確其是否更接近天然BF2分子；其次，闡述其結(jié)合抗原多肽的特征；第三，分析B4單倍型雞對(duì)MD/RS易感性的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。為養(yǎng)禽業(yè)中抗病育種、病毒多肽抗原篩選及疫苗設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)，也為鳥類MHC進(jìn)化研究提供線索。