李靜穎，李志偉，肖書奇

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

人類與動物疫病多為流行性急性傳染病，主要包括細(xì)菌性疫病、病毒性疫病、寄生蟲疫病等類型。疫病可造成大范圍的流行和傳播，對人類健康和社會經(jīng)濟造成巨大威脅。目前，抗體已被廣泛應(yīng)用于疫病的診斷與治療中[1]。其中，單克隆抗體藥物在治療性藥物中占據(jù)主導(dǎo)地位[2]。但單克隆抗體較大、穩(wěn)定性低、制備過程復(fù)雜，影響其應(yīng)用效果，難以應(yīng)對突發(fā)性疫病。

1993年，Hamers-Casterman C等[3]在駱駝科動物血清中發(fā)現(xiàn)了一種天然缺乏輕鏈的抗體，稱之為重鏈抗體(heavy chain antibodies，HCAbs)?？寺∑淇勺儏^(qū)可以得到僅由重鏈可變區(qū)構(gòu)成的單域抗體(single domain antibody)，稱為VHH(variable domin of heavychain antibody)抗體。VHH具有與原HCAb相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及抗原結(jié)合活性，是已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位。VHH晶體直徑2.2 nm，長4.8 nm，分子質(zhì)量僅15 ku，因此又名納米抗體(Nanobody,Nb)。納米抗體具有特殊的天然結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)抗體相比，在功能上具有更多優(yōu)勢，拓寬了抗體的應(yīng)用范圍。本文主要針對納米抗體的特殊結(jié)構(gòu)和特性及其在疫病檢測和治療領(lǐng)域的應(yīng)用進行綜述。

1 納米抗體的結(jié)構(gòu)特性

哺乳動物的抗體由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈構(gòu)成，與之相比，駱駝科動物的HCAbs不含輕鏈多肽和重鏈多肽的第1個恒定域。HCAbs的重鏈可變區(qū)構(gòu)成的抗體，即納米抗體，其分子質(zhì)量為15 ku[4]，約為一般抗體的1/10。

與常規(guī)IgG中的重鏈可變區(qū)(variable region of heavy chain，VH)基因相似，駱駝HCAbs中編碼VHH的基因也是由4個相對保守的框架區(qū)(framework regions,FRs)和3個高變區(qū)(hypervariable region,HVR)構(gòu)成。但駱駝VHH與人體VH之間也存在區(qū)別。首先，它們的互補決定區(qū) (complementarity determining region,CDR) 不同。VHH的CDR1和CDR3更長，且CDR3形成凸型結(jié)構(gòu)[5]，一定程度上補償了輕鏈缺乏造成的結(jié)合力下降的問題。在CDR1和CDR3中含有半胱氨酸殘基，可以形成二硫鍵，有助于連接成環(huán)狀。其次，兩者FR2中氨基酸種類不同。普通抗體的Val 37、Gly 44、Leu45和Trp 47共4個氨基酸殘基在納米抗體中被突變?yōu)橛H水性的氨基酸殘基Phe 37、Glu 44、Arg 45和Gly 47[4]，從而增加了納米抗體的水溶性。

VHH的二級結(jié)構(gòu)包含9條β鏈，折疊成兩個β片層；3個高變區(qū)聚集在一側(cè)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，參與抗原的識別[4]。

2 納米抗體的生物學(xué)特性

2.1 高溶解性和穩(wěn)定性

VH結(jié)構(gòu)域單獨表達(dá)時通常形成包涵體，或者暴露的疏水域相互黏附。由于納米抗體FR2中的疏水氨基酸殘基突變?yōu)橛H水殘基，因此其溶解性增加，聚合性減少，提高了藥物的利用率。

研究表明，小鼠單克隆抗體在70℃或以上溫度下暴露2 h后會喪失與抗原結(jié)合的能力，而部分納米抗體在90℃條件下依然能夠結(jié)合抗原[6]。VHH內(nèi)部存在二硫鍵是其耐高溫的主要原因。此外，納米抗體的保存期長，在4℃下可保存數(shù)月，37℃下可長時間保持與抗原結(jié)合的能力，比常規(guī)抗體更易于儲存。在某些條件，例如乙醇溶液中、含蛋白酶的極端pH環(huán)境下(胃和腸道中)和某些變性劑溶液[7]中，納米抗體仍然能夠保持較高的耐受性。

2.2 抗原結(jié)合能力強

納米抗體具有較長的CDR3，可形成穩(wěn)定的凸形結(jié)構(gòu)，更容易進入抗原結(jié)構(gòu)的內(nèi)部結(jié)合隱蔽的位點，從而使其能夠結(jié)合凹形或空間受阻的抗原[5]。而普通抗體只能識別抗原表面的位點。因此，納米抗體具有廣泛的抗原識別范圍，包括小分子、蛋白質(zhì)和病毒等。

2.3 低免疫原性

納米抗體并非人源抗體，但其體積小，且與人VH3基因家族具有較大的序列同源性，因此納米抗體的免疫原性較低，生物相容性較好[7]。為了進一步降低納米抗體的免疫原性，可將特定納米抗體的CDR移植到人源化的支架上[8]，獲得低免疫原性的納米抗體。

2.4 高表達(dá)性

由于納米抗體分子量小、由單一基因編碼且具有親水性，編碼納米抗體的DNA易克隆并在微生物中大量可溶性表達(dá)。利用原核和真核表達(dá)系統(tǒng)可以進行大規(guī)模生產(chǎn)，從而縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。

3 納米抗體在疫病防治中的應(yīng)用

納米抗體自從被發(fā)現(xiàn)以來就受到了研究者的廣泛關(guān)注。2019年2月，美國FDA批準(zhǔn)了法國制藥公司賽諾菲研發(fā)的用于獲得性血栓性血小板減少性紫癜藥物Cablivi，這是FDA首次批準(zhǔn)的納米抗體藥物[9]，但與病原微生物、寄生蟲感染相關(guān)的納米抗體藥物尚在研發(fā)過程中。由于納米抗體結(jié)構(gòu)和功能的特殊性，針對它的研究愈加深入，在人、畜疫病防控方面已有許多研究成果。

3.1 針對病毒的納米抗體

3.1.1 人類疾病 納米抗體可通過吸入方式靶向治療人類呼吸系統(tǒng)感染性疾病[10]?，F(xiàn)階段，嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)所引起的2019冠狀病毒病(coronavirus disease-19，COVID-19)席卷全球，已造成全球超過2 620萬的確診人數(shù)和超過86萬人的死亡。 目前，尋找有效的抗病毒藥物或疫苗已成為亟待解決的難題。單克隆抗體制造過程花費時間長、成本高，在當(dāng)前流行病情況下無法及時生產(chǎn)。相比較而言，納米抗體體積小，可在微生物表達(dá)系統(tǒng)中大量生產(chǎn)，為藥物生產(chǎn)提供一種思路。

SARS-CoV-2表面具有三聚體刺突(S)蛋白，S蛋白受體結(jié)合域(receptor binding domain ，RBD)與2型肺細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme-2，ACE2)結(jié)合，并在細(xì)胞跨膜絲氨酸蛋白酶2幫助下促進病毒進入宿主細(xì)胞[11]。因此，S蛋白被作為納米抗體研制的靶點。Wrapp D等[12]篩選出針對S蛋白的納米抗體。該納米抗體可與SARS-CoV-2的RBD結(jié)合并顯著抑制病毒復(fù)制。其他研究團隊將目光放在了人源化納米抗體上。Wu Y等[13]將全人源的重鏈可變區(qū)骨架進行篩選重構(gòu)，設(shè)計了全人源的噬菌體展示納米抗體庫。以SARS-CoV-2的RBD結(jié)構(gòu)域和S1蛋白作為抗原，在庫中篩選出納米抗體并在大腸埃希氏菌系統(tǒng)中表達(dá)。篩選得到的納米抗體具有較強的中和活性，部分靶向了S蛋白特殊的隱藏表位。Dong J等[14]利用SARS-CoV-2 S1蛋白篩選美洲駝人源VHH庫，得到了VHH基因與人IgG Fc結(jié)構(gòu)域融合納米抗體，以降低免疫原性。產(chǎn)生的VHH-Fc抗體與S蛋白有很好的結(jié)合能力并阻斷S蛋白與其受體ACE2結(jié)合。盡管這些納米抗體的應(yīng)用性還需要進一步的研究，但其有望成為COVID-19有效的防治藥物。

中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome， MERS)是MERS-CoV引發(fā)的人畜共患的冠狀病毒病。迄今為止尚未出現(xiàn)批準(zhǔn)的疫苗或治療性藥物。MERS-CoV S1亞基中的RBD介導(dǎo)病毒進入宿主細(xì)胞。目前出現(xiàn)的納米抗體包括由大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的4株VHH[15]和由酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的NbMS10[16]。NbMS10對不同株系的MERS-CoV具有很強的交叉中和保護作用，擁有廣譜抗MERS-CoV治療潛力。在NbMS10基礎(chǔ)上還開發(fā)了二聚和三聚納米抗體，顯著提高了與RBD的結(jié)合性和交叉中和活性，體現(xiàn)了強大的熱穩(wěn)定性及抗極端條件的能力[17]。

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)被認(rèn)為是導(dǎo)致嬰幼兒急性下呼吸道感染的最重要病毒病原體。ALX-0171是針對RSV的三聚體納米抗體[18]。得益于納米抗體的高溶解度、強穩(wěn)定性和低黏度，ALX-0171被設(shè)計為霧化器溶液，可通過滴鼻給藥來遞送藥物，使其到達(dá)感染部位發(fā)揮作用[10]。現(xiàn)已通過Ⅱ期臨床試驗，具有潛在的抗RSV治療價值。

除了治療呼吸系統(tǒng)感染性疾病之外，納米抗體還可應(yīng)用于疾病的檢測。諾如病毒是造成人類腸胃炎的重要病原體之一，也是造成地方流行性腹瀉的常見病因。靶向諾如病毒的納米抗體Nano-85可以利用ELISA法從臨床樣本中檢測出不同基因型的諾如病毒樣顆粒[19]，此種快速檢測方法有助于減少諾如病毒的傳播。此外，Nano-26和Nano-85可破壞諾如病毒衣殼的完整性，抑制病毒粒子進入細(xì)胞[20]，有望開發(fā)成新的抗諾如病毒的的治療制劑。

3.1.2 家畜和家禽疫病 納米抗體在家畜和家禽的疫病防控研究中應(yīng)用也十分廣泛。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是影響全世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒性疾病之一，每年給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是引起該病的原因，當(dāng)前疫苗無法起到有效控制PRRSV感染的作用。非結(jié)構(gòu)蛋白9(non-structural protein 9，Nsp9)是PRRSV的一種序列保守的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有RNA依賴性RNA聚合酶活性，在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄中起到關(guān)鍵作用。因此，Nsp9可以作為抗病毒的靶標(biāo)。Liu H等[21]針對Nsp9篩選出特異性的納米抗體Nb6，并建立穩(wěn)定表達(dá)Nb6的細(xì)胞系Marc-145。經(jīng)過試驗證明，Nb6可特異性識別Nsp9，并通過抑制病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄來阻斷PRRSV的復(fù)制。在此基礎(chǔ)上，Wang L等[22]將該納米抗體Nb6偶聯(lián)細(xì)胞穿膜肽并進行原核表達(dá)。細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)是一種可以有效進入細(xì)胞的小分子多肽，可攜帶一些大分子穿過細(xì)胞膜進入胞質(zhì)或者胞漿甚至是細(xì)胞核內(nèi)，并對宿主細(xì)胞沒有明顯的毒副作用。人類免疫缺陷病毒1型反式激活蛋白TAT蛋白也是其中一類。TAT和納米抗體Nb6在大腸埃希氏菌中表達(dá)為融合蛋白TAT-Nb6，可以有效進入Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞，具有抑制PRRSV復(fù)制的功能。納米抗體有望成為治療PRRS的新型抗病毒策略。

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)是由BVD病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染引起的病毒病，給全球畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。利用序列保守的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5B免疫雙峰駝，并構(gòu)建VHH文庫。隨后通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到3株特異性強且親和力高的納米抗體。經(jīng)過細(xì)胞試驗表明，其中的Nb1可以強烈抑制BVDV的復(fù)制[23]，具有成為新型抗BVDV制劑的潛力。

納米抗體在動物疫病檢測中也起到重要作用。家禽的新城疫是一種高發(fā)病率和病死率的疫病，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是造成新城疫發(fā)生的病原體。目前，血凝抑制試驗仍然是檢測家禽血清中抗NDV抗體水平的最廣泛的血清學(xué)方法。然而，該檢測方法常產(chǎn)生高假陽性率，并且操作繁瑣。Sheng Y等[24]研制了辣根過氧化物酶與納米抗體的融合蛋白，并開發(fā)了競爭性ELISA方法，稱作cELISA，用于檢測抗NDV抗體水平。經(jīng)過測試，該方法與商業(yè)ELISA試劑比較具有更高的靈敏度。cELISA在新城疫的檢測中具有良好應(yīng)用前景。

3.2 針對細(xì)菌和細(xì)菌毒素的納米抗體

使用抗生素是進行細(xì)菌感染治療的主要途徑。但是抗生素的不合理使用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性問題出現(xiàn)?？贵w治療在耐藥性問題日趨嚴(yán)峻的當(dāng)下顯示出獨特的優(yōu)勢。其中，納米抗體可以高效結(jié)合細(xì)菌表面蛋白或細(xì)菌毒素，具有防治疾病的潛能。此外，以納米抗體為基礎(chǔ)建立的檢測方法可以快速檢測出細(xì)菌并及時阻斷疾病的傳播。

產(chǎn)生志賀毒素大腸埃希氏菌(Shiga-like toxinEscherichiacoli，STEC)是導(dǎo)致食源性疾病的重要原因。STEC菌株可產(chǎn)生志賀毒素1(Shiga toxin-1，Stx1)、志賀毒素2(Shiga toxin-2，Stx2)或其變體。其中，Stx2會擴散到靶器官腎臟，導(dǎo)致腎臟損傷或衰竭[25]。針對Stx2，研究者開發(fā)了用于檢測或治療的納米抗體。Melli L J等[26]篩選出兩種抗Stx2的納米抗體，并開發(fā)了基于雙VHH的生物素-鏈霉素捕獲ELISA和分光光度檢測法。該檢測方法在STEC培養(yǎng)上清液和糞便樣品中均顯示出良好的敏感性，甚至優(yōu)于商品ELISA的敏感性，可以用于感染STEC的臨床檢測。

痢疾志賀氏菌產(chǎn)生的毒素在結(jié)構(gòu)和功能上與Stx相似。志賀氏菌很容易通過糞-口途徑傳播，引起志賀氏菌病，也稱為細(xì)菌性痢疾。該疾病造成人類感染腹瀉[27]。弗氏志賀氏菌的尖端復(fù)合體含有入侵質(zhì)?？乖璂(invasive plasmid antigenD，IpaD)，Barta M L等[27]開發(fā)出針對IpaD的納米抗體，可調(diào)節(jié)志賀氏菌的感染特性，可以減少志賀氏菌的溶血活性，具有針對志賀氏菌感染的治療潛力。

炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)引起的急性人畜共患傳染病。感染炭疽芽胞桿菌的牲畜具有較高病死率。人主要通過接觸病畜或食用其肉類而被感染。臨床上包括皮膚炭疽、肺炭疽和腸炭疽，有時會引起炭疽敗血癥和腦膜炎。炭疽芽胞桿菌細(xì)胞表面受單晶層保護，該單晶層由S層蛋白Sap組成。靶向Sap S層的納米抗體能減弱細(xì)菌增殖。在炭疽病小鼠的模型中，納米抗體通過皮下注射清除了炭疽芽胞桿菌[28]，表現(xiàn)出納米抗體的治療價值和S層作為治療靶標(biāo)的潛力。

3.3 針對寄生蟲的納米抗體

寄生蟲病是由于寄生蟲侵入機體而引發(fā)的疾病。世界各地均有發(fā)生，在衛(wèi)生條件差、經(jīng)濟條件落后的地區(qū)更多見。納米抗體抗寄生蟲的研究起步較晚，目前多集中于非洲錐蟲病的檢測和治療。

人非洲錐蟲病(Human African trypanosomiasis，HAT)也稱為昏睡病，是由布氏錐蟲引起的人畜共患疾病。通過蒼蠅叮咬而傳播給人類。該病的診斷可采用ELISA或間接免疫熒光法。Odongo S等[29]用可溶性血流形式T蛋白免疫美洲駝之后，獲得了識別錐蟲果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(TcoALD)的納米抗體Nb474，基于此開發(fā)了錐蟲特異性抗原檢測同源夾心ELISA(Nb474-ELISA)，能夠在實驗室和自然條件下檢測非洲錐蟲的感染。深入研究發(fā)現(xiàn)， Nb474-TcoALD具有高親和力，此外 Nb474可以特異性結(jié)合非洲錐蟲醛縮酶，但不能結(jié)合其他錐蟲醛縮酶。Pinto Torres J E等[30]用同樣方式獲得靶向丙酮酸激酶的Nb42和Nb44。在小鼠模型中，基于優(yōu)化的異源二價Nb44-Nb44/ Nb42 ELISA在感染后4 d即可檢測到目標(biāo)抗原。

納米抗體除了用于非洲錐蟲病的檢測外，也可在治療中發(fā)揮作用。目前，控制非洲錐蟲病大多使用化學(xué)療法，但是會出現(xiàn)毒性強、療效差、耐藥性等問題。為了改善化學(xué)療法的缺點，研究者設(shè)計了用于治療非洲錐蟲病的多價藥物遞送系統(tǒng)。該系統(tǒng)基于涂有納米抗體NbAn33的聚乙二醇化殼聚糖納米顆粒，可特異性識別寄生蟲表面上保守的抗原決定簇，納米顆粒中裝載錐蟲病藥物戊烷脒[31]。該系統(tǒng)可以降低藥物的最小治療劑量，提高療效，最大限度地降低毒性，并避免與表面轉(zhuǎn)運蛋白突變相關(guān)的耐藥性。

4 結(jié)語

近年來，抗體治療方式受到廣泛關(guān)注。相比于傳統(tǒng)抗體分子，納米抗體具有低分子量、低免疫原性、高溶解性和高穩(wěn)定性等優(yōu)點，能夠使用微生物系統(tǒng)大量生產(chǎn)，靶向傳統(tǒng)抗體到達(dá)不到的抗原表位，這大大拓展了納米抗體應(yīng)用范圍。納米抗體在針對病毒、細(xì)菌、寄生蟲等引發(fā)的疫病的預(yù)防、診斷和治療方面具有巨大的應(yīng)用前景。

然而，將納米抗體廣泛應(yīng)用到臨床還需要克服一定障礙。納米抗體由于分子質(zhì)量小，能夠迅速通過血液循環(huán)排出體外，不利于藥效的發(fā)揮。目前在藥物研發(fā)中，通過開發(fā)多價納米抗體、修飾納米抗體結(jié)構(gòu)等方式可以延長藥物半衰期。

現(xiàn)階段，納米抗體的低免疫原性僅在小鼠中得到證實。為了開發(fā)針對人類疾病的納米抗體藥物，需要進一步降低其免疫原性，并在臨床上驗證。目前，可通過設(shè)計人源化納米抗體在一定程度上降低免疫原性。

總體來說，隨著對納米抗體的深入研究和對其局限性的克服，納米抗體在臨床治療應(yīng)用中會發(fā)揮越來越重要的作用。