李寶紅，凌欣華，辛海云，涂 柯，李劍豪*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所/畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東茂名 525000；3.梅州市農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，廣州梅州 514021)

母豬子宮內(nèi)膜炎是由外界的多種致病微生物入侵母豬子宮黏膜層中，在其黏膜層中定植、生長及繁殖后引起黏液性或化膿性炎癥等，該病是母豬生產(chǎn)中常見的繁殖障礙疾病之一[1]。母豬子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，該病主要引起母豬的不孕不育、繁殖能力下降等，以慢性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率最高[2-3]。母豬子宮內(nèi)膜炎主要由金黃色葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌等病原菌引起的，其中金黃色葡萄球菌是引起母豬子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌[4-6]。

金黃色葡萄球菌是臨床中常見的人獸共患病原菌之一，該菌廣泛分布于空氣、土壤、食品中等，該菌可以引起多種動物和人發(fā)病，臨床以敗血癥、化膿性感染、心內(nèi)膜炎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等常見[7-8]。國內(nèi)關(guān)于金黃色葡萄球菌引起牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的報道較多，但是引起豬子宮內(nèi)膜炎的報道較少。本研究從2018年-2020年采集患子宮內(nèi)膜炎母豬的子宮化膿性分泌物樣品177份進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離鑒定，對其致病性、血清型及耐藥性進(jìn)行檢測，為該地區(qū)規(guī)?；i場子宮內(nèi)膜炎金黃色葡萄球菌的防控提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品來源 2018年-2020年，從廣州地區(qū)規(guī)?；i場中采集經(jīng)臨床診斷患有子宮內(nèi)膜炎，且化膿癥狀明顯的母豬子宮化膿性分泌物177份。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 25 g左右的健康昆明系母鼠480只，均購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.3 主要試劑 甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；營養(yǎng)肉湯，青島海博生物科技有限公司產(chǎn)品； Raid ID 32 STREP陽性菌鑒定試條，法國梅里埃公司產(chǎn)品；臨床中常用的藥敏紙片，北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品； DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，大連普肽生物科技有限公司產(chǎn)品；2×TaqMarker Mix，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品;70 mL/L綿羊血培養(yǎng)基，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所/畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.4 主要儀器 全自動細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)，法國梅里埃公司產(chǎn)品；多功能PCR儀、凝膠成像儀，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；雙人超凈工作臺，博科(BIOBASE)公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，蕪湖華測儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將采集樣品接種于70 mL/L綿羊血培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，挑取典型單個菌落接種于甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基上在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行鑒別培養(yǎng)12 h～18 h，純化培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌株的形態(tài)。

1.2.2 細(xì)菌生化鑒定 分離菌株的生化鑒定試驗(yàn)按照Raid ID 32 STREP陽性菌鑒定試紙條說明書進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)菌的PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[9]，設(shè)計金黃色葡萄球菌特異鑒定引物femB，5′-TCTTCAGTTCCAGTGTG-3′，5′-GTGGGGGTGAGTAA-3′，擴(kuò)增片段大小為651 bp。用水煮法提取分離菌株基因DNA，用梯度PCR進(jìn)行鑒定， 回收PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序，測序結(jié)果用BLAST進(jìn)行同源性對比。

1.2.4 致病性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[10]的方法，將臨床分離的菌株培養(yǎng)至對數(shù)期計數(shù)(108CFU/mL)，每株分離菌株陰道注射5只小鼠，劑量為0.25 mL，對照組注射等量生理鹽水，觀察6 d，觀察其發(fā)病及死亡情況。

1.2.5 細(xì)菌血清鑒定 采用PCR對臨床中分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行血清型鑒定。參考文獻(xiàn)[11]，設(shè)計金黃色葡萄球菌血清型鑒定引物莢膜多糖5型和8型引物序列(表1)，由華大基因公司合成，已提取的分離菌株的基因DNA為模板PCR進(jìn)行鑒定。

表1 血清型鑒定引物序列

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 臨床中分離菌株的藥敏試驗(yàn)參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2017年推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)和結(jié)果判定，進(jìn)行耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

分離菌株在70 mL/L脫纖綿羊血培養(yǎng)基呈現(xiàn)β溶血菌落；在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上長出淺黃色菌落；染色鏡檢可見單個短鏈和成堆的葡萄串狀排列的陽性球菌。經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果顯示，96株分離菌株初步鑒定為金黃色葡萄球菌。分離菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)及生化鑒定與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》金黃色葡萄球菌培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)及生化特性基本上一致。

2.2 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果

初步鑒定的96株金黃色葡萄球菌分離株，用PCR鑒定進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，結(jié)果顯示，由圖1可知，96株分離菌株均擴(kuò)增出大約為651 bp的目的條帶。測序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株的femB基因序列同源性均大于97.9%，表明分離的96株菌株為金黃色葡萄球菌。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～6.分離菌株; 7.空白對照

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

攻毒組的小鼠在攻毒后的2 d～5 d，出現(xiàn)采食量減少、精神沉郁、母鼠陰道中流出膿性分泌物，個別的小鼠沒有表現(xiàn)出急性死亡，死亡的小鼠的體內(nèi)可分離到金黃色葡萄球菌株，對照組小鼠無明顯臨床癥狀。經(jīng)統(tǒng)計96株金黃色葡萄球菌分離菌株中72株能引起小鼠發(fā)病與死亡。

2.4 莢膜血清型鑒定結(jié)果

采用PCR對分離的72株致病性金黃色葡萄球菌分離株進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示，分離的72株致病性金黃色葡萄球菌莢膜5型有38株(52.8%)，莢膜8型有23株(31.9%)，未定型有11株(15.3%)，其中以莢膜5型為該地區(qū)主要流行血清型。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用K-B 藥敏紙片法對分離的72株致病性金黃色葡萄球菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析其耐藥性。由表2可知，分離的72株致病性金黃色葡萄球菌對阿莫西林、氨芐西林、青霉素、慶大霉素、新霉素、強(qiáng)力霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、林可霉素、大觀霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉9種藥物耐藥性較強(qiáng)，耐藥率在58.3%～95.8%之間；對頭孢噻肟、頭孢噻呋、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考5種藥物耐藥率在11.1%～29.3%之間。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

母豬子宮內(nèi)膜炎是養(yǎng)豬業(yè)中常見的生殖系統(tǒng)疾病之一，引起該病的因素眾多，主要包括內(nèi)源性感染和外源性感染，內(nèi)源性感染主要由于母豬內(nèi)源性(病毒、細(xì)菌)感染，抵抗力下降而引起的炎癥，其中胎兒難產(chǎn)、流產(chǎn)及死胎等均對母豬的產(chǎn)道造成一定的損傷從而引起子宮內(nèi)膜炎。因此，內(nèi)源性疾病引發(fā)的感染也是重要誘因之一[2-4]。許多研究表明，在豬的生產(chǎn)中，飼養(yǎng)管理不當(dāng)、人工授精消毒不完全、在配種時與母豬交配的公豬生殖器官有炎癥等外源性感染也可以引起母豬子宮內(nèi)膜炎[4-6]。金黃色葡萄球菌廣泛存在于環(huán)境中，通過多種途徑入侵體內(nèi)引起子宮內(nèi)膜炎，該菌是引起母豬子宮內(nèi)膜炎主要的病原菌[1-2]。尤其在豬生產(chǎn)過程中，飼養(yǎng)管理不當(dāng)、交配、助產(chǎn)及環(huán)境未進(jìn)行消毒等都可能感染金黃色葡萄球菌，引起子宮內(nèi)膜炎，且金黃色葡萄球菌對母豬存在潛在威脅，應(yīng)該注重該病的綜合防控。

相關(guān)研究表明，金黃色葡萄球菌具有11種血清型，其中臨床中奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌以莢膜多糖5型(CP5)和8型(CP8)多見，在不同的地區(qū)流行的血清型具有一定的差異性[12]。本研究結(jié)果表明，該地區(qū)規(guī)?；i場中致子宮內(nèi)膜炎金黃色葡萄球菌以莢膜5型(52.8%)為主要流行血清型。而國內(nèi)未見報道，研究結(jié)果為該地區(qū)母豬子宮內(nèi)膜炎金黃色葡萄球菌流行病學(xué)及防控研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，臨床中金黃色葡萄球菌防治主要依靠抗菌藥物治療，由于豬場抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，其耐藥性也逐年增加，給該菌的防治帶來一定困難[13]。本研究表明，分離得到72株致病性金黃色葡萄球菌對臨床中常用的藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，應(yīng)該引起重視。本研究與李淑紅等[1]、孫龍等[14]報道的母豬子宮內(nèi)膜炎金黃色葡萄球菌耐藥性存在一定差異性，可能與地區(qū)及用藥情況有關(guān)。金黃色葡萄球菌耐藥性已經(jīng)較為普遍，因此，在治療患子宮內(nèi)膜炎的病豬時一定要合理使用藥物，減少耐藥性產(chǎn)生，同時加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注意消毒。本研究為該地區(qū)規(guī)模化豬場致子宮內(nèi)膜炎金黃色葡萄球菌的防控提供了參考。