楊 琴，鄧肖玉，張 歡，易繼海，王 勇，張 倩，王 震，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心,新疆石河子 832000；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000；4.動(dòng)物疫病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

新疆是我國(guó)重要的畜牧基地，也是養(yǎng)殖反芻動(dòng)物的重要省份。2017年，新疆的牛肉產(chǎn)量(43萬(wàn)噸)及羊肉產(chǎn)量(58萬(wàn)噸)分別占全國(guó)牛肉及羊肉總產(chǎn)量的6.8%和12.4%[1-2]。新疆肉牛、羊養(yǎng)殖業(yè)的主要產(chǎn)區(qū)往往在南疆、北疆部分偏遠(yuǎn)地區(qū),畜牧業(yè)作為當(dāng)?shù)氐闹е援a(chǎn)業(yè),是農(nóng)牧民收入的主要來(lái)源[3-4]。布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱“布病”)是一種由布魯氏菌感染引起的人獸共患傳染病，家畜感染后常表現(xiàn)為流產(chǎn)及繁殖障礙，嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能，對(duì)人類健康及畜牧經(jīng)濟(jì)造成極大危害[5-6]。新疆一直是傳統(tǒng)的布病流行區(qū)[7-8]。自20世紀(jì)80年代，有效的防控策略已使布病疫情得到基本控制，但進(jìn)入21世紀(jì)后，布病再次卷土重來(lái)[9]，新疆布病疫情也出現(xiàn)抬頭趨勢(shì)[10-11]，2013年，養(yǎng)殖人員及畜產(chǎn)品銷售加工人員的布病感染率明顯上升[12]，而帶菌動(dòng)物是人類布病的主要傳染源，人往往通過(guò)直接接觸感染動(dòng)物或食用未加工消毒的牛奶及奶制品而感染。人間布病疫情形勢(shì)嚴(yán)峻。病原學(xué)監(jiān)測(cè)顯示，羊種布魯氏菌是誘發(fā)人患布病的主要菌種[13]。

為了解新疆某地牛、羊感染布病的情況，為布病的預(yù)防、控制及凈化提供科學(xué)依據(jù)，本研究通過(guò)布病血清學(xué)診斷(虎紅平板凝集試驗(yàn))、分子生物學(xué)檢測(cè)及分子流行病學(xué)分析，2017年-2018年對(duì)新疆某偏遠(yuǎn)地區(qū)的牛、羊開(kāi)展布魯氏菌流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源及保存 2017年-2018年的春季，在新疆某偏遠(yuǎn)地區(qū)選擇3個(gè)操作便利，且對(duì)當(dāng)?shù)嘏！⒀蝠B(yǎng)殖具有代表性的牧場(chǎng)，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣的方法對(duì)3個(gè)牧場(chǎng)的牛、羊進(jìn)行頸靜脈采血，采集對(duì)象為飼養(yǎng)2周齡以上且未經(jīng)布魯氏菌疫苗接種的牛、羊。共采集有效血液樣本2 996份，其中牧場(chǎng)A采集血液樣本為牛354份，羊351份；牧場(chǎng)B牛342份，羊361份；牧場(chǎng)C牛710份，羊878份，所有血樣置4℃短暫保存，分離血清后置-20℃保存；收集疑似病例的流產(chǎn)胎兒樣本141份，其中包括牛流產(chǎn)胎兒66份、羊流產(chǎn)胎兒75份，置-20℃保存；另收集生鮮乳樣本85份，其中包括牛生鮮乳65份及羊生鮮乳23份，置4℃保存。

1.1.2 主要試劑 基因組提取試劑盒、TaqPCR聚合酶，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker，TaKaRa公司產(chǎn)品；布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原及布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 可調(diào)移液器，德國(guó)艾本德有限公司產(chǎn)品；DYY 6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)、PCR儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠成像儀，美國(guó)伯樂(lè)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 布魯氏菌PCR鑒定引物[14]由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物

1.2.2 血清的制備、病料的處理及DNA提取 采集的血液樣本置于室溫環(huán)境下(18℃～25℃)靜置4 h，使用5 000 r/min離心5 min后分離血清，保存于-20℃?zhèn)錂z；按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取流產(chǎn)胎兒的肝臟、脾臟(均各取一小片組織約0.5 g并充分研磨)及生鮮乳樣本的DNA，樣品置-20℃保存。

1.2.3 布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè) 在玻璃板上標(biāo)記好待檢血清號(hào)，分別加入30 μL相應(yīng)血清和30 μL抗原，混勻后平鋪約2 cm，3 min后肉眼觀察凝集情況，同時(shí)設(shè)定陰、陽(yáng)性對(duì)照。判定標(biāo)準(zhǔn)如下：出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集現(xiàn)象則初步判定為布魯氏菌陽(yáng)性，無(wú)凝集現(xiàn)象判定為陰性。

1.2.4 布魯氏菌的PCR篩查 以上述提取的全基因組DNA為模板，用布魯氏菌鑒定引物omp22進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(10 μL)：TaqPCR聚合酶5 μL，上、下游引物各0.2 μL，高壓滅菌水3.6 μL，模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 40 s，72℃ 40 s，循環(huán)數(shù)35；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，篩選布魯氏菌陽(yáng)性樣本。

1.2.5 布魯氏菌的種屬鑒定 以上述陽(yáng)性樣本的DNA為模板，用布魯氏菌鑒定引物IS711進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(40 μL)：TaqPCR 聚合酶20 μL，上、下游引物各0.8 μL，高壓滅菌水14.4 μL，模板4 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 2 min，55℃ 2 min，延伸72℃ 2 min，循環(huán)數(shù)30；72℃ 10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 取上述IS711擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物約30 μL置于無(wú)菌EP管中，封口膜封閉后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。使用分子進(jìn)化遺傳分析軟件(MEGA)對(duì)引物IS711擴(kuò)增出的基因序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌病的血清學(xué)檢測(cè)

結(jié)果見(jiàn)表2。從新疆某地牧場(chǎng)A、牧場(chǎng)B和牧場(chǎng)C共采集了2 996份血清樣本，其中包括牛血清樣本1 406份及羊血清樣本1 590份，通過(guò)RBPT初步篩選。結(jié)果顯示，3個(gè)牧場(chǎng)RBPT平均陽(yáng)性率為牛6.8%，羊9.5%，其中牧場(chǎng)A陽(yáng)性率為牛7.1%，羊9.1%；牧場(chǎng)B陽(yáng)性率為牛11.7%，羊10.8%；牧場(chǎng)C陽(yáng)性率為牛4.2%，羊9.1%。

表2 虎紅平板凝集檢測(cè)結(jié)果

2.2 布魯氏菌的PCR篩查

結(jié)果見(jiàn)表3。將牛流產(chǎn)胎兒66份、羊流產(chǎn)胎兒75份、牛生鮮乳42份及羊生鮮乳23份經(jīng)DNA提取后以布魯氏菌omp22為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，共檢測(cè)出布魯氏菌PCR陽(yáng)性樣本54份，其中包括牛流產(chǎn)胎兒22份、羊流產(chǎn)胎兒30份、牛生鮮乳1份以及羊生鮮乳1份。流產(chǎn)胎兒布魯氏菌PCR檢出率為牛33.3%，羊40%；生鮮乳檢出率為牛2.4%，羊4.3%。

表3 布魯氏菌的PCR鑒定結(jié)果

2.3 布魯氏菌的種屬鑒定

結(jié)果見(jiàn)圖1(僅展示部分結(jié)果)。用IS711引物對(duì)上述PCR陽(yáng)性樣本進(jìn)行進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增，共檢測(cè)出38份陽(yáng)性樣本，其中包括牛流產(chǎn)胎兒16份、羊流產(chǎn)胎兒20份、牛生鮮乳1份及羊生鮮乳1份。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,1～13和15～17均擴(kuò)增出731 bp的條帶，與羊種布魯氏菌陽(yáng)性對(duì)照條帶大小一致，鑒定為羊種布魯氏菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1～17.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；18.羊種布魯氏菌陽(yáng)性對(duì)照；19.牛種布魯氏菌陽(yáng)性對(duì)照；20.陰性對(duì)照

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

結(jié)果見(jiàn)圖2。取上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和測(cè)序，基于測(cè)序后的IS711基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，已完成測(cè)序的IS711序列已存入GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)(IS711：MK913893-MK913898)。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，本研究所鑒定出的羊種布魯氏菌與內(nèi)蒙古地區(qū)、挪威及印度等國(guó)分離出的羊種布魯氏菌生物3型菌株關(guān)系最為密切。

圖2 布魯氏菌IS711基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

畜牧業(yè)是新疆歷史悠久的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè),也是當(dāng)?shù)剞r(nóng)村經(jīng)濟(jì)的重要組成部分，尤其在新疆部分偏遠(yuǎn)地區(qū)，畜牧養(yǎng)殖往往是其經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的主要來(lái)源。然而，關(guān)于這些地區(qū)布病的流行病學(xué)調(diào)查及病原學(xué)研究較少。研究表明，2014年新疆伊犁地區(qū)的牛、羊布病陽(yáng)性率分別為1.72%和1.95%[15]。據(jù)伊犁市動(dòng)物疾病與預(yù)防控制中心提供的數(shù)據(jù)顯示，2015年該地區(qū)的牛、羊布病陽(yáng)性率分別為6.91%和4.21%，同樣也有調(diào)查顯示，2015年新疆阿勒泰地區(qū)的牛、羊布病陽(yáng)性率分別為4.09%和3.45%[5]。由此可見(jiàn)，雖然國(guó)家已制定了畜群疫苗接種的布病防治規(guī)劃，且將新疆劃為重點(diǎn)布病防控區(qū)，但新疆部分地區(qū)畜群間布病疫情仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。本研究調(diào)查了新疆某偏遠(yuǎn)地區(qū)3個(gè)牧場(chǎng)牛、羊布病感染情況，采用RBPT對(duì)2 996份牛、羊血清進(jìn)行初步篩選。結(jié)果表明，該地區(qū)3個(gè)牧場(chǎng)RBPT平均陽(yáng)性率為牛6.8%，羊9.5%，其中牧場(chǎng)A陽(yáng)性率為牛7.1%,羊9.1%；牧場(chǎng)B陽(yáng)性率為牛11.7%,羊10.8%；牧場(chǎng)C陽(yáng)性率為牛4.2%,羊9.1%。這些數(shù)據(jù)表明，布病極大可能已在該地區(qū)廣泛流行，并可能已經(jīng)感染了該地區(qū)的所有易感牲畜，應(yīng)引起相關(guān)部門(mén)的高度重視。此外，本次篩查結(jié)果顯示，牧場(chǎng)B的RBPT陽(yáng)性率最高達(dá)到11.7%，牧場(chǎng)C最低陽(yáng)性率為4.2%，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于本次試驗(yàn)的采樣點(diǎn)不均勻，且3個(gè)牧場(chǎng)的檢疫和淘汰力度不同，造成陽(yáng)性率出現(xiàn)較大差異。

布病的主要傳染源是患病及帶菌家畜，患病的妊娠母畜是尤其危險(xiǎn)，在流產(chǎn)或分娩的一系列過(guò)程中，胎兒、胎衣及羊水的排出常常摻雜著大量的布魯氏菌[16]，造成草場(chǎng)、畜舍等周邊環(huán)境的污染，易感動(dòng)物和人接觸到以上污染物，就可通過(guò)消化道、呼吸道、生殖道以及損傷的皮膚、黏膜而感染[17]。PCR是常用的布病診斷方法[18-19]。本研究通過(guò)PCR檢測(cè)從牛、羊流產(chǎn)胎兒中篩選出大量布病陽(yáng)性樣本，一方面提示布魯氏菌感染是造成該地區(qū)牛、羊流產(chǎn)的一個(gè)重要因素，帶菌的妊娠母畜及其流產(chǎn)胎兒是污染源和傳染源；另一方面也提示養(yǎng)殖人員在進(jìn)行家畜的接產(chǎn)時(shí)要格外注意做好自身防護(hù)，以防感染。除帶病家畜的分泌物、排泄物及流產(chǎn)胎兒中含有大量的布魯氏菌外，其生鮮乳中同樣帶有相當(dāng)數(shù)量的布魯氏菌，是極其危險(xiǎn)的傳染源之一[20]。陜西發(fā)生多起因飲用未經(jīng)消毒的生鮮羊乳而發(fā)生布病感染的事件[21]，更進(jìn)一步說(shuō)明生鮮乳作為布病的重要傳染源，給人類的健康帶來(lái)了嚴(yán)重隱患。本研究在牛生鮮乳及羊生鮮乳中均鑒定出了羊種布魯氏菌，表明牛、羊感染羊種布魯氏菌已成為我國(guó)一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。患病的牛、羊作為傳染源，可通過(guò)其污染性生鮮乳的流通傳播疾病，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。因此，當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)生鮮乳及各類動(dòng)物產(chǎn)品的布病檢疫，堅(jiān)決杜絕檢疫不合格的產(chǎn)品流向市場(chǎng)。

不同種的布魯氏菌有其一定的寄生宿主，比如羊種菌多寄生在羊只，牛種菌多寄生于牛。但也常發(fā)現(xiàn)有宿主轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，即羊種菌可能轉(zhuǎn)移到牛、豬，或相反[22-23]。有研究表明，新疆伊犁某地牛流產(chǎn)胎兒中可分離出羊種布魯氏菌[24]。本研究通過(guò)PCR檢測(cè)從16份牛流產(chǎn)胎兒、20份羊流產(chǎn)胎兒、1份牛生鮮乳以及1份羊生鮮乳樣本中共鑒定出38份羊種布魯氏菌。有趣的是，16份牛流產(chǎn)胎兒樣本中均擴(kuò)增出了羊種布魯氏菌，而這16份牛流產(chǎn)胎兒樣本中有10份取自牛、羊混養(yǎng)牧場(chǎng)，表明混合飼養(yǎng)的養(yǎng)殖方式可能造成了布魯氏菌寄生宿主的轉(zhuǎn)移，提示當(dāng)?shù)啬撩駪?yīng)適當(dāng)改變傳統(tǒng)飼養(yǎng)方式，加強(qiáng)對(duì)科學(xué)飼養(yǎng)管理模式的學(xué)習(xí)。此外，本研究基于PCR陽(yáng)性樣本基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)羊種布魯氏菌是該地區(qū)牛、羊感染布病的優(yōu)勢(shì)菌種，且與內(nèi)蒙古地區(qū)、印度和挪威等國(guó)分離的羊種布魯氏菌生物3型序列相似度極高，這一方面說(shuō)明羊種布魯氏菌的致病力和侵襲力很強(qiáng)，可能成為世界范圍內(nèi)的流行菌種；另一方面也提示，若需引進(jìn)種畜或補(bǔ)充畜群時(shí)，要避免來(lái)自這些國(guó)家或地區(qū)的家畜。總之，本研究通過(guò)調(diào)查新疆某偏遠(yuǎn)地區(qū)的牛、羊布病流行情況，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)畜間布病疫情形式嚴(yán)峻，羊種布魯氏菌是引起該地區(qū)牛、羊布病的主要菌種。因此，加強(qiáng)該地區(qū)的布病監(jiān)測(cè)及檢疫力度，高效實(shí)施特定疫苗接種計(jì)劃，鼓勵(lì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民學(xué)習(xí)并采用科學(xué)的管理制度是當(dāng)務(wù)之急。