郝 運(yùn) ，周沁怡,李 銳,楊 華,郝力力,唐 標(biāo)*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，浙江杭州 310021；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095)

細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已經(jīng)成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。抗生素治療人和動(dòng)物疾病效果突出，給人和動(dòng)物的健康帶來(lái)巨大福祉。然而,近年來(lái)在養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素，養(yǎng)殖從業(yè)人員過(guò)分依賴(lài)抗生素，甚至出現(xiàn)濫用抗生素的現(xiàn)象。許多養(yǎng)殖農(nóng)戶(hù)對(duì)于細(xì)菌耐藥性問(wèn)題認(rèn)識(shí)不足，認(rèn)為只要大量使用抗生素，延長(zhǎng)其使用時(shí)間就可以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的效果?？股刈鳛榇偕L(zhǎng)劑的大量使用，是導(dǎo)致致病菌出現(xiàn)耐藥性的主因。從國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道來(lái)看，大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌等常見(jiàn)致病菌的耐藥性不斷升高，耐藥基因流行區(qū)域廣，且不斷出現(xiàn)新的變異耐藥基因。一些常見(jiàn)抗生素在動(dòng)物疾病治療中已失去價(jià)值。王丹等[1]對(duì)哈爾濱地區(qū)分離的23株沙門(mén)氏菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高，對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星、慶大霉素等藥物的耐藥率僅為8.7%。Lei C W等[2]從山東、貴州等12個(gè)省份36個(gè)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中分離到208株屎腸球菌和137株糞腸球菌，并從中檢測(cè)到19株有poxtA耐藥基因的菌株，這19株菌均對(duì)氯霉素、氟苯尼考、紅霉素和多西環(huán)素耐藥。另外，據(jù)江婷婷[3]等報(bào)道顯示，我國(guó)西南地區(qū)1999年、2003年、2006年3個(gè)不同時(shí)期豬源大腸埃希氏菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考等10種抗生素的耐藥性逐步增加。有報(bào)道提出，四川省分離的467株大腸埃希氏菌對(duì)阿莫西林和氨芐西林等藥物的耐藥率超過(guò)90%，遠(yuǎn)高于2006年和2009年的報(bào)道6.6%～10.0%，高于2011年報(bào)道的51.4%[4]，這說(shuō)明四川省大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌和腸球菌的耐藥性也呈逐年增加趨勢(shì)，細(xì)菌耐藥問(wèn)題不斷惡化。

對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，可以及時(shí)了解耐藥性的發(fā)生和流行情況。雖然農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性問(wèn)題展開(kāi)研究，但是局部地區(qū)對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性問(wèn)題依然不夠重視。本文旨在總結(jié)四川地區(qū)常見(jiàn)動(dòng)物源細(xì)菌的耐藥水平和耐藥基因的傳播特征，為省內(nèi)繼續(xù)開(kāi)展耐藥監(jiān)測(cè)工作提供數(shù)據(jù)。

1 大腸埃希氏菌的耐藥現(xiàn)狀

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)俗稱(chēng)大腸桿菌，屬于埃希氏菌屬，是革蘭氏陰性菌耐藥性水平指示菌。大腸埃希氏菌是條件致病菌，部分致病性大腸埃希氏菌是引起細(xì)菌性食物中毒的常見(jiàn)病原菌[5]。大腸埃希氏菌不僅可引起消化系統(tǒng)感染，還能導(dǎo)致腸道外其他臟器感染。研究表明，四川地區(qū)動(dòng)物源大腸埃希氏菌廣泛被分離到，諸明欣[6]對(duì)四川阿壩州的牦牛源大腸埃希氏菌的分離率為19.17%(74/386)；徐俊杰[7]等對(duì)四川遂寧市的鴨源大腸埃希氏菌的分離率為96.67%(29/30)。

養(yǎng)殖場(chǎng)在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中通過(guò)飼喂抗生素來(lái)達(dá)到促生長(zhǎng)的作用，在選擇壓力下，耐藥菌株不斷出現(xiàn)。根據(jù)研究報(bào)道總結(jié)四川地區(qū)大腸埃希氏菌的耐藥狀況如表1所示，其中阿莫西林、復(fù)方新諾明等藥物均出現(xiàn)耐藥率為100%的情況，氨芐西林、四環(huán)素等耐藥率也超過(guò)90%。其中對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松等藥物的耐藥率最低，這可能與禁止對(duì)動(dòng)物使用第三代頭孢類(lèi)藥物有關(guān)，但是動(dòng)物源大腸埃希氏菌對(duì)第三代頭孢類(lèi)藥物仍具有耐藥性，這可能與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的交叉耐藥性有關(guān)。但就2006年至2018年而言，大腸埃希氏菌對(duì)不同抗菌藥物的耐藥率普遍上升。

表1 四川省大腸埃希氏菌的耐藥率狀況

產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是大腸埃希氏菌重要的耐藥表現(xiàn)之一，臨床上常見(jiàn)的有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、碳青霉烯酶和頭孢菌素水解酶(AmpC)[9]。另外，近年來(lái)由于黏菌素大量使用，導(dǎo)致耐藥性迅速增高，黏菌素耐藥基因mcr除了mcr-1以外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8個(gè)變異型mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5、mcr-6、mcr-7、mcr-8[10]和mcr-9。2018年Liu L等[11]通過(guò)PCR測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一株人源攜帶blaNDM耐藥基因的大腸埃希氏菌，與blaNDM-5相比，只有1個(gè)核苷酸差異(G205A)，并命名為blaNDM-21。該基因具有與blaNDM-5相同的抗碳青霉烯類(lèi)抗生素活性，還發(fā)現(xiàn)該耐藥基因由IncX3類(lèi)型質(zhì)粒攜帶。2015年Kong L H等[12]從四川某豬場(chǎng)分離出105株大腸埃希氏菌，對(duì)其中耐藥基因研究結(jié)果顯示，16株同時(shí)攜帶blaNDM-5和mcr-1耐藥基因。2010年-2016年楊承霖等[13]分離到444株大腸埃希氏菌，對(duì)其耐藥基因的檢測(cè)率分別為blaTEM-1(63.3%)、blaTEM-52(32.1%)、blaCTX-M-55(42.2%)、blaCTX-M-65(27.8%)、blaCTX-M-14(21.1%)。2019年Bai L等[14]從四川分離得到的23株豬源大腸埃希氏菌中分離到2株tet(X4)陽(yáng)性菌，并通過(guò)MLST分析鑒定出兩個(gè)屬于ST101基因型的菌株。2016年-2018年彭珂楠等[8]分離到豬源大腸埃希氏菌22株，并對(duì)其耐藥基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sul2耐藥基因的陽(yáng)性率最高為95.54%，其次是tet(B)(四環(huán)素類(lèi))陽(yáng)性率為86.36%、tet(A)(四環(huán)素類(lèi))陽(yáng)性率為81.82%、floR(酰胺醇類(lèi))陽(yáng)性率為81.82%，blaOXA(β內(nèi)酰胺類(lèi))和blaSHV(β內(nèi)酰胺類(lèi))耐藥基因的陽(yáng)性率最低，都是9.09%。2015年-2016年Chen D Y等[15]從四川省野生大熊貓的糞便樣本中分離到82株大腸埃希氏菌，有40%的菌株表現(xiàn)為多重耐藥，耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示strB耐藥基因陽(yáng)性率為32%，aph(3′)-IIa耐藥基因陽(yáng)性率28%，ant(3″)-Ia耐藥基因的陽(yáng)性率為23%，aadA1耐藥基因的陽(yáng)性率為21%。aac(3)-Iia耐藥基因的陽(yáng)性率為5%。綜上所述，四川省大腸埃希氏菌中流行耐藥基因較多，blaNDM、blaCTX、mcr-1等耐藥基因，四環(huán)素tet(A)、tet(M)、tet(B)耐藥基因，以及blaOXA、blaSHV、strB、aph(3′)-IIa等耐藥基因都有被檢出，其中部分耐藥基因可通過(guò)質(zhì)粒傳播，對(duì)公共衛(wèi)生安全具有潛在威脅。

2 沙門(mén)氏菌的耐藥現(xiàn)狀

沙門(mén)氏菌(Salmonella)屬于腸桿菌科，具有多種血清型。按生化反應(yīng)本屬菌可分為4個(gè)亞屬：①亞屬Ⅰ是具典型生化反應(yīng)的和最常見(jiàn)的沙門(mén)氏菌；②亞屬Ⅲ是亞利桑那沙門(mén)氏菌；③亞屬Ⅱ和Ⅳ是不具典型生化反應(yīng)的沙門(mén)氏菌[16]。由于沙門(mén)氏菌有超過(guò)2 000種的血清型，對(duì)于沙門(mén)氏菌的防治較為復(fù)雜，每年沙門(mén)氏菌對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成的危害較大。據(jù)李晚霞等[17]研究，從四川邛崍、樂(lè)至、金堂、廣漢、新津、眉山和彭州等7個(gè)地區(qū)的養(yǎng)雞場(chǎng)可分離到沙門(mén)氏菌。楊丹等[18]對(duì)甘孜地區(qū)的藏雞源沙門(mén)氏菌的分離率為21.43%(42/196)，也同樣說(shuō)明沙門(mén)氏菌在四川地區(qū)的分布非常廣泛。

沙門(mén)氏菌不僅是四川地區(qū)重要的動(dòng)物源致病菌，也是食源性致病菌中重要的耐藥性監(jiān)測(cè)指標(biāo)。從目前發(fā)表的論文來(lái)看，四川省不同年份不同株沙門(mén)氏菌的耐藥率具有明顯的差異。四川省沙門(mén)氏菌的耐藥狀況如表2所示，彭峻烽[19]從四川省肉鴨屠宰場(chǎng)分離得到156株沙門(mén)氏菌，其藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)萘啶酸的耐藥率最高，達(dá)到94.2%，對(duì)阿莫西林/克拉維酸和慶大霉素耐藥率最低，只有14.7%和14.1%。其多重耐藥性也相當(dāng)嚴(yán)重，有63.5%的菌株對(duì)至少3種抗菌藥物耐藥。楊丹等[18]對(duì)藏雞沙門(mén)氏菌進(jìn)行耐藥性分析，結(jié)果顯示沙門(mén)氏菌對(duì)阿莫西林的耐藥率超過(guò)90%，而對(duì)慶大霉素、氨芐西林的耐藥率較低，此外該論文中97.62%的沙門(mén)氏菌表現(xiàn)為對(duì)4種以上抗菌藥物耐藥的多重耐藥性。與之前的研究相比，Ma S等[20]研究結(jié)果的耐藥率普遍較低，這可能與采樣的隨機(jī)性有關(guān)。

表2 四川省沙門(mén)氏菌的耐藥率狀況

近年來(lái)，隨著沙門(mén)氏菌耐藥性的不斷增高，沙門(mén)氏菌已出現(xiàn)了由質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因。有研究發(fā)現(xiàn)IncN質(zhì)粒中攜帶有blaCTX-M-1耐藥基因[21]，并且IncI1質(zhì)?？梢院虸ncN質(zhì)粒共同參與blaCTX-M-1耐藥基因的轉(zhuǎn)移。盛煥精等[22]發(fā)現(xiàn)，IncI1質(zhì)粒陽(yáng)性菌株比IncN質(zhì)粒陽(yáng)性菌株的耐藥譜更寬，對(duì)頭孢類(lèi)抗生素的耐受水平更高；IncN質(zhì)粒陽(yáng)性菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的抗性相對(duì)更高。YANG Y Q等[23]通過(guò)分析病雞中ESBLs陽(yáng)性沙門(mén)氏菌中含有mcr-1和blaCTX-M-55基因的IncI2型接合質(zhì)粒的全序列，發(fā)現(xiàn)mcr-1和blaCTX-M-55基因可共存于同一個(gè)質(zhì)粒上，將該質(zhì)粒提取出來(lái)，并對(duì)其基因文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒具有包含mcr-1和tnpA基因的ISApl1轉(zhuǎn)座元件。Carroll L M等[24]在2019年首次報(bào)道了沙門(mén)氏菌中檢測(cè)到新耐藥基因mcr-9，發(fā)現(xiàn)mcr-9的基因序列與mcr-3和mcr-7最接近，但是卻對(duì)黏菌素不產(chǎn)生耐藥性，然而，將mcr-9導(dǎo)入大腸埃希氏菌DH5α后會(huì)對(duì)黏菌素產(chǎn)生耐藥性。楊丹等[18]檢測(cè)42株沙門(mén)氏菌的耐藥基因，其中blaTEM(β內(nèi)酰胺類(lèi))耐藥基因陽(yáng)性率最高(90.48%)，其次是addA2(氨基糖苷類(lèi))和tet(A)(四環(huán)素類(lèi))耐藥基因，陽(yáng)性率分別是85.71%和83.33%。Li R等[25]對(duì)四川省食品動(dòng)物源(雞、豬和鴨)沙門(mén)氏菌的耐藥基因分析結(jié)果顯示，25株IntI1陽(yáng)性沙門(mén)氏菌含有5組抗性基因，分別是dfrA12-aadA2、dfrA1-aadA1、dfrA1、blaPSE-1和dfrA1/aadA2。檢測(cè)出β內(nèi)酰胺酶基因分別為blaOXA-1、blaTEM-1、blaPSE-1和blaCMY-2，含β內(nèi)酰胺酶基因菌株均對(duì)氨芐西林耐藥，且blaCMY-2基因是國(guó)內(nèi)首次報(bào)告，這對(duì)國(guó)內(nèi)沙門(mén)氏菌病的治療和公共衛(wèi)生安全具有潛在影響。Ma S等[20]對(duì)四川省養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)分離到的雞源沙門(mén)氏菌、豬源沙門(mén)氏菌進(jìn)行耐藥基因分析顯示，28株氨基糖苷類(lèi)耐藥菌株中，1株攜帶armA，27株攜帶rmtB，在70個(gè)氨芐西林耐藥菌株中有57個(gè)存在blaTEM-1，在36個(gè)第3代頭孢菌素耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)blaCTX-M-55、blaCTX-M-164、blaCTX-M-79、blaCTX-M-15、blaCTX-M-65和blaCTX-M-14，mcr-1存在于22株耐多黏菌素B菌株中，20株同時(shí)具有ESBLs基因。67株強(qiáng)力霉素耐藥菌株中分別檢測(cè)出tet(A)耐藥基因49株和tet(M)耐藥基因1株。馮蘭等[26]從四川紅原的牦牛糞便樣本中分離到16株ST71沙門(mén)氏菌，這些菌株對(duì)氨芐西林、頭孢噻呋、四環(huán)素和氯霉素的耐藥率全部為100%。綜上所述，四川省動(dòng)物養(yǎng)殖中受沙門(mén)氏菌污染嚴(yán)重，且沙門(mén)氏菌攜帶多種重要耐藥基因，這些耐藥基因廣泛傳播并且可能存在人和動(dòng)物之間的交叉?zhèn)鞑?，?duì)公共衛(wèi)生健康造成嚴(yán)重影響。

3 腸球菌的耐藥現(xiàn)狀

腸球菌屬(Enterococcus)包括糞腸球菌(E.faecalis)、屎腸球菌(E.faecium)、鳥(niǎo)腸球菌(E.avium)、耐久腸球菌(E.durans)、雞腸球菌(E.gallinarum)、酪黃腸球菌(E.casselipavus)和病臭腸球菌(E.malodoratus)等50多個(gè)種。腸球菌也被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)重要的臨床病原體，且越來(lái)越多的耐藥表型出現(xiàn)。在歐洲，9.8%的感染與腸球菌屬有關(guān)，其中10.2%的分離株對(duì)萬(wàn)古霉素具有耐藥性[27]。而四川省2015年-2018年從無(wú)菌體液分離得到的腸球菌中有2.2%(40株)是萬(wàn)古霉素耐藥菌株[28]。腸球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌的耐藥性水平指示菌，腸球菌耐藥性問(wèn)題的日益嚴(yán)重，對(duì)全球范圍內(nèi)動(dòng)物和人的健康具有潛在威脅。目前四川省對(duì)于人源腸球菌的報(bào)道較多，但是對(duì)于動(dòng)物和食品源腸球菌的報(bào)道較少。目前已知的報(bào)道中，四川省動(dòng)物源腸球菌感染豬較多，也有關(guān)于林麝等野生動(dòng)物中分離腸球菌的報(bào)道。另外，郝中香等[29]從成都、雅安、平武和涼山地區(qū)的大熊貓繁殖基地中分離到11種腸球菌。

腸球菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制有很多，而獲得性耐藥基因的傳播是腸球菌獲得耐藥性的重要途徑。張平等[30]從四川某規(guī)模豬場(chǎng)中分離到50株腸球菌，MIC測(cè)定結(jié)果顯示，50株菌的MIC50為32 μg/mL，MIC90為64 μg/mL，對(duì)于氟苯尼考的耐藥率為68%。50株分離菌僅檢測(cè)出fexA和fexB基因。該研究首次發(fā)現(xiàn)了325 bp的正向重復(fù)序列，由于其可形成環(huán)化結(jié)構(gòu)的中間過(guò)渡態(tài)，從而以類(lèi)似于質(zhì)粒的方式在菌株間水平轉(zhuǎn)移，大大促進(jìn)了fexA基因水平傳播的可能性。Yang J等[31]通過(guò)對(duì)尿液、分泌物和血樣本進(jìn)行檢測(cè)，得到了43株耐萬(wàn)古霉素腸球菌，其耐藥率為5.47%，并從中檢測(cè)到了vanR、vanS、vanH、vanA、vanX、vanY和vanZ耐藥基因。Kang Z Z等[32]從四川25個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)分離出的93株糞腸球菌和65株屎腸球菌進(jìn)行研究，分別檢測(cè)到可轉(zhuǎn)移的噁唑烷酮耐藥基因cfr(0株)、optrA(6株)、poxtA(1株)。所有菌株對(duì)氯霉素、氟苯尼考和紅霉素耐藥，對(duì)氨芐西林、萬(wàn)古霉素敏感，其中E.faecalisC25菌株含有2個(gè)optrA基因。張明國(guó)等[33]從198份健康奶牛糞便中分離到腸球菌105株，并做藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示所有分離腸球菌對(duì)多西環(huán)素和紅霉素耐藥率最高，分別是50%和42.3%，沒(méi)有分離到萬(wàn)古霉素耐藥菌株。Cai J等[34]推測(cè)optrA突變、optrA的遺傳環(huán)境、細(xì)菌宿主和其他因素可能調(diào)節(jié)optrA的表達(dá)，并導(dǎo)致不同程度的利奈唑胺類(lèi)耐藥。龔永平等[35]從四川省死亡林麝內(nèi)臟中分離出1株屎腸球菌LS170308，并對(duì)其分離菌做藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示屎腸球菌LS170308對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、多西環(huán)素等13種藥物具有耐藥性，并發(fā)現(xiàn)該菌株攜帶PRI1和PRI4耐藥基因島。PRI1包括ant(9)、ermA和aac(6′)-le-aph(2″)-la耐藥基因，PRI4攜帶dfrG耐藥基因。綜上所述，四川省動(dòng)物源腸球菌耐藥譜廣，耐藥基因復(fù)雜，多重耐藥性較嚴(yán)重。

4 展望

大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌和腸球菌均為動(dòng)物源以及食源性重要的致病菌，對(duì)人和動(dòng)物的健康都有巨大的威脅。根據(jù)現(xiàn)有的論文總結(jié)來(lái)看，四川省大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌和腸球菌的耐藥狀況嚴(yán)重，耐藥率普遍較高，對(duì)阿莫西林、四環(huán)素等一些常見(jiàn)抗生素耐藥性最為嚴(yán)重，多數(shù)菌株呈現(xiàn)多重耐藥性。此外，四川省大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌和腸球菌攜帶多種對(duì)公共衛(wèi)生安全具有重要威脅的耐藥基因。四川省細(xì)菌耐藥問(wèn)題不容小覷，當(dāng)?shù)貞?yīng)督促養(yǎng)殖場(chǎng)在臨床上規(guī)范使用抗生素，防止細(xì)菌耐藥情況進(jìn)一步惡化，出現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”。目前國(guó)家已經(jīng)開(kāi)展了對(duì)動(dòng)物源耐藥細(xì)菌的監(jiān)測(cè)，但省級(jí)層面監(jiān)測(cè)力量仍不足。建議省級(jí)層面應(yīng)將研究工作落實(shí)到各個(gè)地(市)，并加強(qiáng)對(duì)大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌和腸球菌耐藥性的篩查和檢測(cè)力度，深入研究其耐藥基因和耐藥表型。