朱向蕾，王瑛瑩，周立晨

(上海動物園，上海 200335)

環(huán)尾狐猴(Lemurcatta)也稱節(jié)尾狐猴，分布在非洲馬達(dá)加斯加島，在森林中生活。近些年來，狐猴的棲息地遭受嚴(yán)重破壞，種群數(shù)量減少[1-3]，國際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)專家評估，94%狐猴瀕臨滅絕，其中就包括環(huán)尾狐猴，因此環(huán)尾狐猴的保護(hù)遺傳研究刻不容緩[4-6]。

對血液參數(shù)的檢測有助于對動物機(jī)體進(jìn)行臨床檢查，解讀動物的生理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)和病理學(xué)狀態(tài)[7-8]。另一方面，開展血液學(xué)檢測有助于理解血液參數(shù)與動物生存環(huán)境之間的關(guān)系[9]，從而進(jìn)一步評估動物個體對特定疾病和環(huán)境條件的抵抗力[10]。血常規(guī)作為血液檢查最基礎(chǔ)的部分，是判斷機(jī)體是否處于正常狀態(tài)的重要標(biāo)準(zhǔn)，意義重大。

目前，檢測血常規(guī)常用方法有兩種，一種是人工鏡檢法，另一種是儀器檢驗(yàn)法。國外有應(yīng)用手工方式進(jìn)行環(huán)尾狐猴的血液學(xué)檢驗(yàn)，白腳絹毛猴采用手動方法進(jìn)行白細(xì)胞分類，對紅細(xì)胞、白細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行了儀器測定[11]，對一些獼猴類的血常規(guī)，如食蟹猴的，直接采用儀器進(jìn)行測定[12]。國內(nèi)有關(guān)環(huán)尾狐猴的血常規(guī)指標(biāo)檢驗(yàn)大多依賴于儀器，并未對其可靠性進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。目前獸用血細(xì)胞分析儀種類型號很多，具有快速、穩(wěn)定的特點(diǎn)，但環(huán)尾狐猴屬于原始靈長類，其外形、生活習(xí)性、生長環(huán)境等均不同于普通實(shí)驗(yàn)猴，也有著不同于實(shí)驗(yàn)猴的生理生化特性。因此，常規(guī)血液分析儀檢驗(yàn)環(huán)尾狐猴血常規(guī)的適用性有待進(jìn)一步探索。

本研究以原始低等靈長類動物環(huán)尾狐猴為研究對象，通過兩種檢驗(yàn)方法對其血液參數(shù)進(jìn)行測定，驗(yàn)證以猴血液為標(biāo)本類型的儀器檢驗(yàn)法針對環(huán)尾狐猴的可靠性和準(zhǔn)確性，整合得出最佳檢驗(yàn)方法，以便為圈養(yǎng)環(huán)尾狐猴的科學(xué)飼養(yǎng)和健康管理以及其疾病的臨床診斷和治療提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 樣本采集自上海動物園圈養(yǎng)的10只健康環(huán)尾狐猴，雌雄各半，空腹靜脈采集血液2 mL～4 mL，分裝至有EDTA-K2抗凝劑和肝素-Li抗凝劑的抗凝管中，手動搖勻后冷藏待測。

1.1.2 主要試劑 血細(xì)胞分析用溶血劑(M-52DIFF溶血劑、M-52LH溶血劑)、探頭清潔液，深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司產(chǎn)品；20 mL/L冰醋酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；9 g/L NaCl溶液，浙江都邦藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；甲醇，上海泰坦科技股份有限公司產(chǎn)品；瑞氏-吉姆薩染液，珠海貝索生物有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 獸用全自動血液分析儀(BC-5000 Vet)，深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司產(chǎn)品；顯微鏡(CX31)，奧林巴斯有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)(Centrifuge 5424R)、移液槍(Eppendorf)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，德國Marienfeld公司產(chǎn)品；機(jī)械分類計(jì)數(shù)器，新康醫(yī)療有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

所有血液樣本的處理分析與生理參數(shù)值測定均在上海動物園完成。

1.2.1 血液常規(guī)參數(shù)值儀器測定 將血液樣本(EDTA-K2抗凝劑保存)放置室溫，手動顛倒搖勻后，經(jīng)獸用全自動血液分析儀檢測血液生理指標(biāo)，包括白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞(red blood cell ，RBC)計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞(monocyte，Mon)比率(Mon%)、中性粒細(xì)胞(neutrophil，Neu)比率(Neu%)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte，Lym)比率(Lym%)、嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，Eos)比率(Eos%)和嗜堿性粒細(xì)胞(basophil，Bas)比率(Bas%)共7項(xiàng)[13]，檢驗(yàn)選用的標(biāo)本類型為與環(huán)尾狐猴較為接近的獼猴，儀器測定前經(jīng)過技術(shù)人員校正，以確保其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[14]。

1.2.2 血液常規(guī)參數(shù)值手工計(jì)數(shù) 將血液樣本(EDTA-K2抗凝劑保存)放置室溫30 min，手動搖勻后，進(jìn)行7項(xiàng)血液常規(guī)指標(biāo)的測定[15]。

1.2.2.1 白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 20 mL/L冰醋酸將血液樣本40倍稀釋，振蕩混勻后，取10 μL混合液滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)并測算白細(xì)胞密度。

1.2.2.2 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 用9 g/L NaCl溶液將血液樣品400倍稀釋，充分混勻后吸取10 μL混合液滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)并測算紅細(xì)胞密度。

1.2.2.3 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)方法 吸取2.5 μL環(huán)尾狐猴血液用載玻片制成6 cm×2.5 cm血涂片，經(jīng)甲醇固定后，進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色，油鏡觀察計(jì)數(shù)100個白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理分析 對環(huán)尾狐猴血液生理生化參數(shù)進(jìn)行分析，計(jì)量結(jié)果以平均值(Mean)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，對測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)(樣本量不足50，采用Shapiro-Wilk test)。在血液生理參數(shù)人工計(jì)數(shù)和儀器計(jì)數(shù)兩種方法的比較過程中，均符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用配對樣本T檢驗(yàn)(Paired t-test)比較差異性，否則應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)(兩個相關(guān)樣本：Wilcoxon signed-rank test)比較差異性。符合正態(tài)分布的采用pearman進(jìn)行相關(guān)性分析，不符合正態(tài)分布的采用Spearman進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS Statistics 23.0軟件完成，顯著水平設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 人工計(jì)數(shù)法與儀器檢測法穩(wěn)定性比較

根據(jù)采集環(huán)尾狐猴樣本的細(xì)胞密度選取高、中、低值3組數(shù)據(jù)進(jìn)行人工計(jì)數(shù)和儀器檢測的穩(wěn)定性分析，每組測定10個數(shù)據(jù)，測定其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞人工鏡檢的高、中、低值普遍高于儀器測定值，紅細(xì)胞則相反，整體平均值差異不大，但是每組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)，儀器檢測法的低于人工鏡檢的，表明儀器檢測穩(wěn)定性及重復(fù)性較好。

表1 環(huán)尾狐猴血液樣本兩種方法測定低中高密度樣本結(jié)果

2.2 人工鏡檢法與儀器法檢測環(huán)尾狐猴血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

應(yīng)用人工計(jì)數(shù)和儀器計(jì)數(shù)兩種方法對收集的環(huán)尾狐猴血液樣本進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)，判定其差異性。兩種方法檢測WBC差異不顯著(P>0.05)，RBC差異顯著(P<0.05)(表2)。表明人工鏡檢法與儀器法應(yīng)用于環(huán)尾狐猴的WBC結(jié)果基本一致，而RBC結(jié)果有顯著差異。

表2 人工鏡檢和儀器檢測血細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 人工鏡檢法與儀器法進(jìn)行環(huán)尾狐猴的白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

環(huán)尾狐猴血細(xì)胞在顯微鏡下觀察形態(tài)如圖1所示。在環(huán)尾狐猴白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果中，兩種方法測得環(huán)尾狐猴L(fēng)ym%、Mon%、Eos%的數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布(P>0.05)，Neu%、Bas%的數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，其中Lym%(P>0.05)、Neu%(P>0.05)兩種方法測定結(jié)果無顯著性差異,Mon%(P<0.05)、Eos%(P<0.05)和Bas%(P<0.05)兩種方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果為差異性顯著(表3)。

表3 儀器法與人工鏡檢法檢測白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的比較

1.紅細(xì)胞；2.血小板；3.分葉核中性粒細(xì)胞；4.桿狀核中性粒細(xì)胞；5.分葉核嗜酸粒細(xì)胞；6.桿狀核嗜酸粒細(xì)胞；7.淋巴細(xì)胞；8.單核細(xì)胞。放大倍數(shù)1 000×

2.4 人工鏡檢法與儀器法檢測環(huán)尾狐猴血細(xì)胞結(jié)果的相關(guān)性分析

分析兩種環(huán)尾狐猴血細(xì)胞檢測方法的相關(guān)性，結(jié)果見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WBC(r=0.971，P=0)、Lym%(r=0.967,P=0)、Mon%(r=0.887,P=0.001)、Neu%(r=0.879,P=0.001)兩種檢測方法結(jié)果相關(guān)性顯著，RBC(r=0.493,P=0.148)、Eos%(r=0.256，P=0.476)的結(jié)果呈弱相關(guān)或極弱相關(guān)，Bas%人工檢測為常量，未作相關(guān)性分析。

圖2 人工鏡檢法與儀器法檢測結(jié)果的線性相關(guān)分析

3 討論

血液參數(shù)能夠提供有關(guān)動物營養(yǎng)、生理健康狀況及免疫機(jī)能的參考信息，與動物機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝水平直接相關(guān)，在一定程度上受環(huán)境因素、營養(yǎng)狀態(tài)及疾病等因素的影響[16]。因此，準(zhǔn)確快速的測定動物血液參數(shù)值，并理解其內(nèi)涵對于判定動物的健康狀況，開展飼養(yǎng)管理等具有十分重要的指導(dǎo)意義。

本研究在一定程度上得出了環(huán)尾狐猴血常規(guī)指標(biāo)的參數(shù)值，其中WBC結(jié)果均低于易剛等[17]、韓飛[18]對環(huán)尾狐猴血常規(guī)指標(biāo)的檢測值，而白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)差異不大，RBC與其結(jié)果相比，人工檢驗(yàn)法較低，儀器檢驗(yàn)法較高。與Singleton C L等[19]的檢測結(jié)果相比，Lym%和Mon%檢測值偏高，而Neu%檢測值偏低，造成差異的原因可能是地域、飼料、環(huán)境、應(yīng)激、不同季節(jié)飼養(yǎng)管理等因素的影響[20]，也可能是不同檢測儀器之間的差異，例如動物營養(yǎng)不良或飼料中微量元素缺乏可能造成RBC或血紅蛋白降低，應(yīng)激時(shí)會引起動物WBC增高，炎熱夏季時(shí)，動物飲水較多，使得血液濃度變低，繼而相應(yīng)血液指標(biāo)也可能降低。

本研究通過人工鏡檢和儀器檢測兩種方法對環(huán)尾狐猴的血常規(guī)參數(shù)進(jìn)行測定，通過穩(wěn)定性測試發(fā)現(xiàn)儀器檢測快速、穩(wěn)定且重復(fù)性好，其中兩種方法檢測的WBC、Lym%及Neu%差異不顯著，說明人工和儀器兩種檢驗(yàn)方法對3種血液指標(biāo)的檢測結(jié)果是一致的，進(jìn)一步通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，WBC、Lym%和Neu%的結(jié)果也具有很好的相關(guān)性，說明儀器檢測在這些指標(biāo)上與人工鏡檢法差異不顯著且相關(guān)性較好，可在一定程度上代替人工鏡檢。然而，兩種檢驗(yàn)方法的RBC和Eos%結(jié)果差異顯著且呈弱相關(guān)或極弱相關(guān)，表明二者結(jié)果的不一致性，儀器檢測不能很好的進(jìn)行以上指標(biāo)的檢測，必須結(jié)合人工鏡檢。RBC結(jié)果差異大的原因可能在于低等靈長類的節(jié)尾狐猴與一般實(shí)驗(yàn)性獼猴在紅細(xì)胞形態(tài)及大小上的不同，獼猴的范圍較大，造成計(jì)數(shù)結(jié)果偏高。因?yàn)锽as%很低，一般小于1%，這可能是人工鏡檢時(shí)均為零的原因，必要時(shí)可通過增加計(jì)數(shù)量來進(jìn)一步分析其差異性和相關(guān)性。對白細(xì)胞分類結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，顯著性差異大或相關(guān)性差的指標(biāo)為所占比率較低的細(xì)胞，細(xì)胞比率低可能為其中差異性顯著或相關(guān)性差的原因之一。

環(huán)尾狐猴屬于原始靈長類，且屬于珍稀野生動物，參考指標(biāo)缺乏，因此儀器檢測選用的標(biāo)本類型為相近的猴，但考慮到其不同于普通實(shí)驗(yàn)性獼猴，用儀器進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)以實(shí)驗(yàn)猴數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，這可能是在一些指標(biāo)上結(jié)果差異顯著的原因。因此，以猴為標(biāo)本類型對環(huán)尾狐猴進(jìn)行儀器檢測并不能完全體現(xiàn)其真實(shí)情況，而且野生動物形態(tài)復(fù)雜，一些異常細(xì)胞儀器無法正確判斷，必要時(shí)需要進(jìn)行人工顯微鏡檢[21]，比如一些異形淋巴細(xì)胞，需要與白血病幼稚和原始淋巴細(xì)胞進(jìn)行仔細(xì)鑒別，人工鏡檢能及時(shí)發(fā)現(xiàn)血小板或紅細(xì)胞凝集、異常細(xì)胞、寄生蟲感染、染色質(zhì)著色及細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化等情況并加以識別[22]，以便為臨床獸醫(yī)提供準(zhǔn)確有效的判斷根據(jù)。即使在相對成熟的人類醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，血細(xì)胞分析作為最常用的項(xiàng)目之一，目前普遍使用儀器檢測，大大提高了臨床檢驗(yàn)質(zhì)量和效率，但是對一些貧血、白血病、感染等疾病診斷時(shí)仍需進(jìn)行血涂片鏡檢。因此，目前對環(huán)尾狐猴血常規(guī)的臨床檢驗(yàn)，仍以儀器和人工鏡檢結(jié)合檢驗(yàn)更為有效。