劉勃興，趙安奇，張雪佳，王利麗，吳同壘，馮 嶺，史秋梅*，張志強(qiáng)*

(1.河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066004；2.樂(lè)亭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北唐山 063000)

我國(guó)毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)最早可追溯至1956年，并經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展已成為世界毛皮動(dòng)物第一飼養(yǎng)大國(guó)[1]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模和數(shù)量的擴(kuò)大，毛皮動(dòng)物相關(guān)疾病的報(bào)道也逐漸增多，尤其是細(xì)菌性疾病，嚴(yán)重制約我國(guó)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2]。狐沙門(mén)氏菌病又稱狐副傷寒，是由致病性沙門(mén)氏菌感染引起的一種急性或慢性傳染病，臨床癥狀可見(jiàn)發(fā)熱、下痢、敗血癥、母畜流產(chǎn)等，并常侵害幼畜致死[3-5]。沙門(mén)氏菌的毒力強(qiáng)弱與毒力基因密切關(guān)，有研究表明沙門(mén)氏菌的致病力是由眾多毒力基因共同作用的結(jié)果，而這些毒力基因存在于菌毛、毒力島和毒力質(zhì)粒等[6-8]。國(guó)內(nèi)外沙門(mén)氏菌病主要通過(guò)抗生素類(lèi)藥物治療，但由于耐藥菌株的出現(xiàn)，部分抗生素類(lèi)藥物的治療效果欠佳，因此，亟需對(duì)致病性沙門(mén)氏菌的耐藥性進(jìn)行研究調(diào)查，篩選對(duì)當(dāng)?shù)亓餍芯昃哂凶罴芽咕Ч乃幬镏笇?dǎo)臨床用藥。

本試驗(yàn)從秦皇島地區(qū)分離的23株狐源沙門(mén)氏菌的致病性和耐藥性進(jìn)行研究，旨在為秦皇島地區(qū)狐源沙門(mén)氏菌的致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)用菌株 23株狐源沙門(mén)氏菌(編號(hào)HLS1～23)，從秦皇島地區(qū)病死銀狐和藍(lán)狐肝臟、心臟、脾臟等實(shí)質(zhì)臟器分離，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析等試驗(yàn)鑒為沙門(mén)氏菌。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，體重20 g±2 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.3 主要試劑 HE瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物公司產(chǎn)品；藥敏紙片，杭州天和微生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，中科瑞泰科技有限公司產(chǎn)品；2×TaqMaster Mix、細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(C1000 TOUCH)，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)(YT-CJ-1D)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司產(chǎn)品；隔水式培養(yǎng)箱(GSP-9080MBE)，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡(IX73)，奧林巴斯公司產(chǎn)品；瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-31DN)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；50 L全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(GI54DWS)，致微(廈門(mén))儀器有限公司產(chǎn)品；自動(dòng)化微生物鑒定系統(tǒng)(ATB)，法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品。

1.1.5 引物合成 參照文獻(xiàn)[8-9]合成沙門(mén)氏菌毒力基因引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 將凍存的23株沙門(mén)氏菌分別接種于HE瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。挑取有黑色中心且菌落為藍(lán)綠色的單菌落接種于LB培養(yǎng)基，在37℃、180 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶100比例轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后備用。

1.2.2 沙門(mén)氏菌的致病性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[10]方法，以昆明系小鼠為動(dòng)物模型進(jìn)行致病性試驗(yàn)。將1.2.1中制備的菌液以3 000 r/min離心5 min，棄掉上清，用無(wú)菌PBS重懸菌泥并調(diào)整濃度至1.0×107CFU/mL。試驗(yàn)設(shè)置23組試驗(yàn)組，每株狐源沙門(mén)氏菌為1個(gè)試驗(yàn)組，每組5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.1 mL調(diào)整濃度后的菌液。設(shè)置對(duì)照組1組，每只小鼠注射0.1 mL無(wú)菌的PBS緩沖液，其余試驗(yàn)條件與試驗(yàn)組相同。注射后觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，剖檢死亡的小鼠并分離其肝臟、脾臟、心臟等實(shí)質(zhì)器官細(xì)菌。

1.2.3 沙門(mén)氏菌的毒力基因檢測(cè) 以1.2.2中提取的23株沙門(mén)氏菌DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系：模板、上游引物、下游引物各1 μL，2 ×TaqMaster Mix 10μL，ddH2O 7μL。PCR結(jié)束后用10 g/L瓊脂糖凝膠跑膠驗(yàn)證，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.2.4 沙門(mén)氏菌的藥物敏感性試驗(yàn) 藥物敏感性試驗(yàn)采取KB法，試驗(yàn)操作以及判定標(biāo)準(zhǔn)按照美國(guó)臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)的抗菌藥物有：β內(nèi)酰胺類(lèi)藥物氨芐西林、頭孢曲松和阿莫西林；氨基糖苷類(lèi)藥物阿米卡星、新霉素和卡那霉素；四環(huán)素類(lèi)藥物多西環(huán)素和土霉素；氟喹諾酮類(lèi)藥物環(huán)丙沙星和恩諾沙星；氯霉素類(lèi)藥物氟苯尼考；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物替米考星；磺胺類(lèi)藥物磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明。該7類(lèi)15種抗菌藥物是獸醫(yī)臨床使用頻率較高的藥物。

PCR模板的制備，參照細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取23株狐源沙門(mén)氏菌的DNA，置-20℃冰箱備用(表1)。

表1 沙門(mén)氏菌毒力基因引物

2 結(jié)果

2.1 沙門(mén)氏菌的致病性試驗(yàn)

分離的狐源沙門(mén)氏菌感染小鼠后，小鼠出現(xiàn)精神沉郁、肌肉痙攣的神經(jīng)癥狀，個(gè)別小鼠出現(xiàn)腹瀉、糞便稀軟不成型、呼吸急促、深而沉等癥狀。24 h后出現(xiàn)死亡，持續(xù)觀察2周，死亡率為20%～100%(表2)。對(duì)照組小鼠狀態(tài)良好，無(wú)明顯病征，無(wú)死亡。分離試驗(yàn)組死亡小鼠的肝臟、心臟、脾臟等實(shí)質(zhì)臟器細(xì)菌，經(jīng)鑒定為沙門(mén)氏菌，生化鑒定指標(biāo)與分感染菌株基本一致。

表2 23株分離菌的毒力基因檢測(cè)結(jié)果與小鼠死亡情況

2.2 沙門(mén)氏菌的毒力基因檢測(cè)

結(jié)果見(jiàn)圖1。沙門(mén)氏菌的毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，除菌株HLS6和HSL10，其余狐源沙門(mén)氏菌分別檢出出2個(gè)～8個(gè)毒力基因。毒力基因sseC和sseL未檢出，其余基因檢出率為4.35%～65.22%，其中spvA、hisJ和stn基因檢出率較高。

圖1 23株分離菌各毒力基因檢測(cè)

2.3 沙門(mén)氏菌的藥物敏感性試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的狐源沙門(mén)氏菌分別對(duì)6種～15種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥，對(duì)6種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥菌株1株，占比4.35%；對(duì)7種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥菌株1株，占比4.35%；對(duì)8種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥菌株1株，占比4.35%；對(duì)10種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥菌株2株，占比8.70%；對(duì)11種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥菌株3株，占比13.04%；對(duì)12種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥菌株2株，占比8.70%；對(duì)13種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥菌株4株，占比17.39%；對(duì)14種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥菌株6株，占比26.09%；對(duì)15種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥菌株3株，占比13.04%。15種抗菌藥物中，分離的沙門(mén)氏菌對(duì)土霉素、替米考星和復(fù)方新諾明耐藥率高達(dá)100%，對(duì)阿米卡星敏感率最高，為30.43%(7/23)。

圖2 23株分離菌的耐藥情況

圖3 23株分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

沙門(mén)氏菌(Salmonella)是一種重要的人畜共患病源，可感染多種家禽家畜發(fā)病，同時(shí)也是重要的人食源性菌[11-12]。由于我國(guó)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展相對(duì)較晚，因此，狐源沙門(mén)氏菌相關(guān)的報(bào)道及研究較少，沙門(mén)氏菌的致病力在臨床診治狐相關(guān)疾病過(guò)程中經(jīng)常不引起重視。本研究通過(guò)小鼠致病性發(fā)現(xiàn)，秦皇島地區(qū)狐源沙門(mén)氏菌均具有一定的致病力，可致小鼠死亡，且不同菌株的致病力不同，揭示了沙門(mén)氏菌是引起狐發(fā)病的重要病原。

為了解試驗(yàn)的23株狐源沙門(mén)氏菌的毒力基因攜帶情況，本文采用PCR方法檢測(cè)了19種沙門(mén)氏菌的毒力基因。結(jié)果顯示，SPI2毒力島的分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白基因sseC和sseL基因未檢出，其余基因均有檢出，毒力質(zhì)粒的效應(yīng)基因spvA、組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子hisJ和腸毒素stn基因檢出率較高。在某些沙門(mén)氏菌存在一條約50 kb～90 kb的質(zhì)粒，該質(zhì)粒與沙門(mén)氏菌的毒力密切線管，被稱為沙門(mén)氏菌毒力質(zhì)粒(Salmonellaplasmid virulence，SPV)[9,13]。毒力質(zhì)粒存在一段高度保守的spv基因(大小約為8 kb)，由spvA、spvB、spvC、spvD和orfE基因構(gòu)成，spv基因與細(xì)沙門(mén)氏菌的黏附、定植及血清抗生等毒力表現(xiàn)型密切相關(guān)[14-15]。hisJ基因常用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)[16]。stn腸毒素基因是鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染機(jī)制中重要的毒力因子，有報(bào)道非鼠傷寒沙門(mén)氏菌也存在stn基因，該基因可誘發(fā)小鼠腔體分泌反應(yīng)，并且與細(xì)菌的耐藥性存在一定的關(guān)系[14,17]。spvA、hisJ和stn基因檢出率較高說(shuō)明在秦皇島地區(qū)狐源沙門(mén)氏菌該3個(gè)毒力基因在分子水平較為流行，為進(jìn)一步對(duì)狐源沙門(mén)氏菌致病機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)參考。

有研究報(bào)道，人和動(dòng)物源沙門(mén)氏菌的耐藥性呈上升趨勢(shì)，并且人源沙門(mén)氏菌和動(dòng)物源沙門(mén)氏菌存在一定的相關(guān)性[18-20]。本研究中23株沙門(mén)氏菌均具有多重耐藥性，其中對(duì)14種抗菌藥物耐藥菌株占比最大，15種抗菌藥物中阿米卡星敏感率最高，但敏感率僅為30.43%(7/23)，耐藥情況十分嚴(yán)重。孫娜等[21]分離的狐源沙門(mén)氏菌同樣出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，結(jié)合本研究結(jié)果，表明狐源沙門(mén)氏菌的耐藥情況不容樂(lè)觀。致病性沙門(mén)氏菌的多重耐藥性給臨床治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，并對(duì)人類(lèi)和其他動(dòng)物的公共衛(wèi)生安全造成威脅。針對(duì)狐源沙門(mén)氏菌耐藥現(xiàn)狀，建議在臨床治療時(shí)可先通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選出抗菌效果最佳的藥物，制定合理的給藥方案，采用聯(lián)合用藥等方法緩解致病菌耐藥問(wèn)題，同時(shí)定期對(duì)地方流行致病菌株耐藥情況進(jìn)行調(diào)查分析以指導(dǎo)臨床用藥。

本文對(duì)從秦皇島地區(qū)分離的23株狐源沙門(mén)氏菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)分離菌株均具有一定的致病力，并且具有嚴(yán)重的耐藥性。研究結(jié)果為該地區(qū)狐沙門(mén)氏菌病的防治以及沙門(mén)氏菌的致病和耐藥機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。