楊澤曉,曾紅梅,涂 騰,桑杰益西,李 敏,任永軍,羅 燕,姚學(xué)萍,王 印*,陳 斌
(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川成都 611130;2.成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川成都 610041;3.四川省畜牧科學(xué)研究院,四川成都 610066;4.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川成都 610041)
兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)又稱兔瘟,是由嵌杯病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起家兔的一種急性、高度致死性傳染病。該病典型病變特征以呼吸系統(tǒng)出血,實(shí)質(zhì)器官淤血、腫大、出血和肝臟壞死為主。RHD因其潛伏期短、發(fā)病急、病程短、傳播快,病死率可高達(dá)100%,被我國列為二類動(dòng)物疫病[1]。兔瘟包括兔瘟1型(RHD1)和兔瘟2型(RHD2)。RHD1出現(xiàn)較早,自我國1984年報(bào)道以后世界很多國家相繼出現(xiàn)RHD的發(fā)生和流行[1-2],由于免疫接種等防控措施的實(shí)施,RHD1的流行得到基本控制,但偶爾有疑似病例或疫情發(fā)生的報(bào)道[2-3],并且不同基因型和抗原型的RHDV變異株不斷被發(fā)現(xiàn)[4-5]。
RHD2于2010年由法國首次報(bào)道,由一種由RHDV新變異毒株兔出血癥病毒2型引起的新型兔病毒性出血癥(new rabbit hemorrhagic disease,nRHD)即RHD2[6]。RHD2與經(jīng)典兔瘟病理變化相似,雖然感染試驗(yàn)顯示平均病死率只有20%左右,但是感染范圍更廣,包括一些野兔屬品種,可感染致死30日齡以內(nèi)的家兔和傳統(tǒng)兔瘟滅活苗免疫過的家兔[7-9]。
2020年5月初,四川省成都市某獺兔養(yǎng)殖場的獺兔1 200只(母兔300只商品兔和仔兔900只),陸續(xù)出現(xiàn)不同生長階段獺兔包括母兔、商品兔和仔兔急性死亡病例,癥狀和病變與兔瘟相似。為確定病情,通過對(duì)送檢兔場兔群的發(fā)病情況調(diào)查、送檢病死兔只臨床剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與鑒別診斷進(jìn)行確診,現(xiàn)報(bào)告如下。
1.1.1 病例 四川省某獺兔養(yǎng)殖場送檢發(fā)病死亡獺兔9只,其中母兔1只,商品兔3只,仔兔5只。
1.1.2 試劑與菌株 DNA Marker DL 2 000、RNAiso Plus Kit,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液試劑盒(AG11706),艾科瑞生物有限公司產(chǎn)品;通用型基因組DNA提取試劑盒(9ZEL15),構(gòu)菲特生物有限公司產(chǎn)品;2×TaqPCR Master Mix,成都飛克(天泰)科技有限公司產(chǎn)品;兔巴氏桿菌17株,四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.3 引物 采用文獻(xiàn)[10-11]中RHDV、RHDV2和巴氏桿菌檢測(cè)引物(表1),送往成都擎科生物工程有限公司合成,按照合成說明書將其稀釋至10 μmol/L,置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>
表1 實(shí)驗(yàn)室診斷檢測(cè)引物
1.1.4 主要儀器 臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5418R),德國艾本德(Eppendorf)公司產(chǎn)品;PCR儀(T100TM)和紫外凝膠成像系統(tǒng)(Universal HoodⅡ),美國伯樂(Bio-Rad)公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-2C型),北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。
1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 詢問了解兔場飼養(yǎng)管理、兔群發(fā)病情況及免疫用藥情況,發(fā)病臨床癥狀、死亡率等。
1.2.2 病理剖檢 按常規(guī)方法對(duì)送檢病死獺兔進(jìn)行剖檢,觀察主要臟器的病理變化,并按無菌采取病料進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)和鑒別診斷。
1.2.3 RT-PCR檢測(cè)
1.2.3.1 RHDV和RHDV2的檢測(cè) 取采集肝、脾等病變組織混合采用RNAiso Plus Kit進(jìn)行RNA提取,然后按照EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液試劑盒說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系為EVO M-MLV RT Master Mix 2 μL,RNA5 μL, ddH2O 3 μL;反應(yīng)條件為37℃ 15 min, 85℃ 5 s。參照文獻(xiàn)[10]中反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行兔瘟病毒基因的檢測(cè),同時(shí)做陽性對(duì)照(RHDV和RHDV2的靶片段重組質(zhì)粒為模板)和陰性對(duì)照(ddH2O為模板)。2×TaqPCR Master Mix 25μL, P1、P2、P3和P4 各1μL,cDNA 3μL,ddH2O 18 μL,混勻后按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:95℃ 5 min;95℃ 40 s,56.5℃ 30 s,72℃ 30 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。
1.2.3.2 巴氏桿菌PCR檢測(cè) 取采集肝、脾等病變組織采用通用型基因組DNA提取試劑盒(9ZEL15)按照說明書進(jìn)行DNA提取,然后參照文獻(xiàn)[12]反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行巴氏桿菌KMT1基因檢測(cè),同時(shí)做陽性對(duì)照(兔巴氏桿菌17株為模板)和陰性對(duì)照(ddH2O為模板)。2×TaqPCR Master Mix 25 μL, P5和P6各1 μL,模板1 μL,ddH2O 22 μL,混勻后按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:95℃ 5 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 60 s,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。
1.2.3.3 PCR產(chǎn)物序列分析 將PCR陽性反應(yīng)產(chǎn)物送成都有康生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定,然后進(jìn)行BLAST分析進(jìn)行同源性比較。
兔場發(fā)病兔群陸續(xù)出現(xiàn)母兔、商品兔和乳兔急性死亡病例,母兔和商品兔死亡率15%左右,乳兔死亡率高達(dá)50%以上,嚴(yán)重者乳兔出現(xiàn)整窩死亡;兔場免疫過經(jīng)典兔瘟疫苗和巴氏桿菌疫苗,發(fā)病后抗生素治療無效。發(fā)病兔一般無明顯臨床癥狀突然死亡,死亡前呼吸困難,尖叫,抽搐,有的可見鼻孔出血(圖1A和圖1B),一般情況下糞便干結(jié)(圖1C),少數(shù)病例表現(xiàn)拉稀(圖1D)。
A、B.口鼻部位的異常變化;C、D.排除糞便的異常變化
剖檢病變與經(jīng)典兔瘟相似,主要以呼吸道出血病變和全身實(shí)質(zhì)性器官水腫和淤血、出血為特征變化。剖檢一般可見病死兔膀胱積尿(圖2A);氣管環(huán)狀充血、出血(圖2B和圖2C),個(gè)別有大量泡沫出現(xiàn);肺臟點(diǎn)狀或片狀出血(圖2D),嚴(yán)重者可見心肌出血(圖2E);肝臟質(zhì)脆,淡黃色(圖2F)或瘀血呈紫紅色,嚴(yán)重者可見壞死灶(圖2G);脾臟淤血腫大紫紅色(圖2H);腎臟淤血腫大(圖2I),嚴(yán)重者可見點(diǎn)狀出血(圖2J)。
對(duì)采集的心臟、肝、脾等病變組織混樣后提取RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行進(jìn)行RHDV和RHDV2的PCR檢測(cè),同時(shí)抽提樣品DNA進(jìn)行巴氏桿菌的PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見圖3,RHDV和RHDV2鑒別RT-PCR陽性對(duì)照(泳道1)、陰性對(duì)照(泳道2)、與巴氏桿菌PCR檢測(cè)陽性對(duì)照(泳道4)、陰性對(duì)照(泳道5)均成立,檢測(cè)樣品的巴氏桿菌擴(kuò)增陰性(泳道6),僅有RHDV2擴(kuò)增出約435 bp預(yù)期大小的特異性DNA條帶(泳道3)。
陽性PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見圖4,經(jīng)BLAST分析顯示,擴(kuò)增基因核苷酸序列與GenBank(登錄號(hào)MN061492)RHDV2(RHDV2-NL2016毒株)的核酸同源性最高為98.39%。最終確診送檢病兔為RHDV2感染。
圖4 RHDV2陽性RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果
A.膀胱積尿;B、C.氣管充血、出血;D.肺臟出血;E.心肌出血;F、G.肝臟腫大質(zhì)脆;H.脾臟淤血腫大;I、J.腎臟瘀血、出血
確診后上報(bào)疫情,按照國家疫病防治技術(shù)的相關(guān)處理規(guī)范與要求,進(jìn)行同群兔撲殺,并做無害化處理和消毒等處置。
M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.RHDV-RHDV2復(fù)合RT-PCR 陽性對(duì)照;2.RHDV-RHDV2復(fù)合RT-PCR 陰性對(duì)照;3.樣品RT-PCR產(chǎn)物;4.巴氏桿菌檢測(cè)陽性對(duì)照;5.巴氏桿菌檢測(cè)陰性對(duì)照;6.樣品PCR產(chǎn)物
經(jīng)典兔瘟自1984年我國報(bào)道以后相繼在世界很多國家出現(xiàn),也伴隨著陸續(xù)出現(xiàn)不同基因型和抗原型的RHDV變異株(RHDVa株)。2010年由法國首次報(bào)道發(fā)生RHD2,即出現(xiàn)了RHDV新變異毒株兔出血癥病毒2型(RHDV2)[6]。繼而,RHD2也呈現(xiàn)出向外蔓延趨勢(shì),意大利、西班牙、德國、葡萄牙、英國、挪威等多數(shù)西歐國家和亞速爾群島,以及北非和南非一些國家陸續(xù)報(bào)道了該病的發(fā)生[10,13-14]。截止2020年5月底,美國和墨西哥均通報(bào)了RHD2疫情,尤其在美國,2019年7月出現(xiàn)RHD2疫情以來又已連續(xù)發(fā)生15起RHD2疫情,呈現(xiàn)出國內(nèi)擴(kuò)散勢(shì)態(tài)[15]。2020年5月21日,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了近日四川省金堂縣養(yǎng)兔場的RHD2疫情[16],此前我國從未有過該病發(fā)生的報(bào)道。RHD2作為我國新發(fā)生動(dòng)物疫病,目前我國除四川省外其他區(qū)域尚無該病的發(fā)生,加之該病國內(nèi)尚無商業(yè)化疫苗可以用,無有效預(yù)防措施,這應(yīng)該引起人們的高度重視和關(guān)注。一方面要追溯發(fā)生RHD2疫情的原因,總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn),積極開展RHD2風(fēng)險(xiǎn)分析,加強(qiáng)檢疫,嚴(yán)防RHD2等外來病的傳入和RHD2疫情在國內(nèi)的蔓延;另一方面通過科研立項(xiàng)積極進(jìn)行RHD2防控技術(shù)等方面的科技攻關(guān)。
本次病例診斷的報(bào)告從RHD2在送檢兔場成年兔和乳仔兔發(fā)病死亡情況,臨床癥狀、病理剖檢以及實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷的情況和方法進(jìn)行了全面翔實(shí)的介紹,以期能為我國養(yǎng)兔場RHD2疑似病例的發(fā)現(xiàn)和診斷提供參考,進(jìn)而做到RHD2的及早發(fā)現(xiàn)、及早診斷和有效控制蔓延。