李 博，張 雨，朱燕麗，孫 璐，黃恩霞，莫重輝，路 浩*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016)

烏頭屬(AconitumL)是一類兼具藥用價值和極強毒性的毛茛科(Ranunculaceae)一年至多年生草本植物。廣布于北半球溫帶地區(qū)，主要分布于亞洲、歐洲、北美洲，其中亞洲分布最廣，尤以我國物種資源最為豐富，主要分布于四川、云南、西藏等西南省區(qū)。烏頭屬種類繁多，全球約有350種，我國有200多種，約76種可供藥用[1-2]，例如白喉烏頭、草烏、川烏、北烏頭、黃花烏頭、鐵棒錘等。隨著氣候變化、過度放牧、不合理開發(fā)等自然和人為因素的影響，草地嚴(yán)重退化，烏頭等毒草迅速大量滋生繁衍，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)牧草的產(chǎn)量進一步降低，加重了草原荒漠化，加大了放牧動物毒草中毒的概率[3]。烏頭被各種家畜誤食后均可引起中毒，表現(xiàn)流涎、嘔吐、腹痛、腹瀉，瞳孔散大、呼吸困難、運動中樞和感覺麻痹等特征，最終因心臟麻痹和呼吸衰竭而死亡[4]，可對草原畜牧業(yè)造成較大經(jīng)濟損失。

目前，有關(guān)烏頭的研究主要集中在強心[5]、鎮(zhèn)痛[6]、抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗衰老[9]及抗病毒[10]等藥理作用方面，而對其毒理作用方面研究相對較少。已有研究表明，烏頭屬植物含有90多種生物堿[11]，主要有烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等，其中以烏頭堿(aconitine)毒性最強，為二萜類生物堿，是烏頭的主要毒性成分[12]。國內(nèi)外學(xué)者有關(guān)烏頭堿的研究主要集中在烏頭堿的神經(jīng)毒性和心臟毒性方面。Zhao Y等[13]發(fā)現(xiàn)烏頭堿能夠顯著觸發(fā)多巴胺釋放、通過氧化應(yīng)激損傷PC12細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)毒性。Peng C等[14]從SD大鼠體內(nèi)獲得皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞并進一步研究表明，烏頭堿對大腦具有明顯神經(jīng)毒性作用，其機制可能是通過抑制Na+-K+-ATP的活性從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，造成大腦形態(tài)和功能的破壞。Sandeep T等[15]報道了人烏頭中毒導(dǎo)致心律不齊和心室震顫的病例。張碩峰等[16]通過動態(tài)觀察烏頭堿的心臟毒性與強心作用發(fā)現(xiàn)，中毒量的烏頭堿能夠?qū)е滦穆蕼p慢、心室震顫，最終死亡，具有明顯的心臟毒性。Gao X T等[17]研究了烏頭堿在H9c2心肌細(xì)胞凋亡中的作用，揭示了烏頭堿通過介導(dǎo)線粒體通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

截至目前，有關(guān)烏頭堿中毒模型研究較少[18-19]，且其在小鼠產(chǎn)生的病理組織學(xué)變化尚不清楚。鑒于此，本研究擬通過復(fù)制小鼠烏頭堿亞急性中毒試驗?zāi)Ｐ停接憗喖毙詾躅^堿中毒對小鼠病理組織學(xué)變化的影響，為烏頭堿毒性作用機制研究及動物烏頭中毒病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 7日齡健康昆明小鼠120只，購自成都達碩實驗動物有限公司。飼養(yǎng)溫度20℃～25℃，相對濕度40%～70%，12 h～12 h晝夜交替。飼養(yǎng)期間給予充足的全價鼠糧和飲水。

1.1.2 主要試劑及儀器 98.86%烏頭堿，成都曼思特公司產(chǎn)品；甲醛等有機溶劑均為國產(chǎn)分析純，四川西隴化工有限公司產(chǎn)品；BL6100電子天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品；精密轉(zhuǎn)輪切片機，美國AO公司產(chǎn)品；熒光正置顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠亞急性烏頭堿中毒模型的復(fù)制 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機分為對照組(生理鹽水組)、低劑量組0.14 μmol/L、中劑量組0.28 μmol/L、高劑量組0.56 μmol/L，每組30只。連續(xù)灌胃30 d。

1.2.2 臨床癥狀觀察 每天觀察并記錄各組小鼠的飲食狀況、精神狀態(tài)、行為活動及臨床表現(xiàn)等。

1.2.3 病理組織切片制作及染色觀察 攻毒30 d時，將心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、大腦、小腦固定于100 mg/mL甲醛溶液中24 h以上。沖洗組織，隨后修剪成3 mm～5 mm的組織塊，注意腦組織作橫切。然后依次在700、800、850、900、950 mL/L、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中分別進行脫水處理50 min。在無水乙醇脫水后，置于無水乙醇與二甲苯混合液中30 min，再依次入純二甲苯Ⅰ、純二甲苯Ⅱ各10 min，置換出脫水劑并使組織呈半透明狀態(tài)。組織透明后，入熔化的石蠟內(nèi)浸蠟2 h后用包埋專用框進行組織包埋。將蠟塊固定在切片機上進行切片，單張切片的厚度為3 μm～5 μm，并進行展片處理后進行染色。在染色缸內(nèi)依次進行脫蠟(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15 min)、脫苯(無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、950、900、800、700 mL/L乙醇各1 min)、水洗1 min、染蘇木精1 min后自來水沖洗兩次2 min～3 min，10 mL/L鹽酸乙醇中分化30 s后，浸入常水2 min～3 min。10 mg/mL伊紅染色2 min～3 min，加入蒸餾水快洗3 s～5 s。染色結(jié)束后，再進行一次脫水、透明處理，最后在組織切片上滴加1滴～2滴中性樹膠封片劑。

切片制備完成后，利用熒光正置顯微鏡(10×20倍)，觀察主要臟器的病理組織學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

對照組小鼠試驗中未見明顯異常。灌胃第3天，低劑量組未見明顯異常，中劑量組及高劑量組均有小鼠出現(xiàn)精神沉郁、發(fā)汗，高劑量組還表現(xiàn)出輕度的皮膚震顫及腹瀉現(xiàn)象。灌胃第5天，高劑量組有小鼠出現(xiàn)嘔吐。灌胃第6天，低劑量組和中劑量組排帶有黏液的軟便。灌胃第15天，高劑量組部分小鼠表現(xiàn)行走不穩(wěn)、步態(tài)左右搖晃等神經(jīng)癥狀。灌胃第20天，高劑量組小鼠除眼瞼水腫，尾部體溫偏低，口鼻、尾部及四肢皮膚發(fā)黑外，還出現(xiàn)頭頸及四肢震顫，共濟失調(diào)，盲目運動等明顯神經(jīng)癥狀，且伴有間歇性躁動不安。

2.2 病理組織學(xué)變化

2.2.1 腦病理組織學(xué)變化

2.2.1.1 大腦 對照組大腦結(jié)構(gòu)清晰，無明顯變化(圖1A)。低劑量組大腦間質(zhì)無明顯變化(圖1B)。中劑量組病理變化可見部分神經(jīng)細(xì)胞水腫，有輕微噬神經(jīng)現(xiàn)象(圖1C)。高劑量組大腦中部分皮質(zhì)細(xì)胞腫脹、變性、壞死，有明顯的噬神經(jīng)現(xiàn)象。間質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，血管擴張，充滿紅細(xì)胞(圖1D)。

2.2.1.2 小腦 對照組小腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)無肉眼可見病理變化(圖1E)。低、中劑量組可見浦肯野細(xì)胞出現(xiàn)輕微空泡變性(圖1F,G)。高劑量組小腦浦肯野細(xì)胞腫脹、變性、壞死，胞漿內(nèi)有數(shù)量不等的空泡，細(xì)胞空泡化嚴(yán)重(圖1H)。

2.2.2 心臟和肺臟的病理組織學(xué)變化

2.2.2.1 心臟 對照組心肌纖維排列規(guī)則、整齊，間質(zhì)無明顯病理變化(圖2A)。低劑量組未見明顯心肌斷裂、變性(圖2B)。中、高劑量組可見心肌纖維腫脹、壞死、斷裂，呈凝固性壞死。間質(zhì)靜脈血管充血，結(jié)締組織細(xì)胞增生(圖2C和圖2D)。

2.2.2.2 肺臟 對照組肺臟各級小管無明顯病理變化(圖2E)。低劑量組小鼠肺臟輕微淤血，肺臟各級小管比較正常(圖2F)。中劑量組少數(shù)肺泡壁增厚，充血、出血現(xiàn)象較高劑量組輕微，未見上皮脫落(圖2G)。高劑量組可見肺泡壁增厚，肺泡壁相互融合形成腔體，肺泡腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤。肺間質(zhì)毛細(xì)血管擴張充血，有出血現(xiàn)象，細(xì)支氣管上皮有細(xì)胞脫落現(xiàn)象(圖2H)。

2.2.3 肝臟、脾臟和腎臟病理組織學(xué)變化

2.2.3.1 肝臟 對照組肝細(xì)胞索排列整齊，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常(圖3A)。低劑量組中央靜脈輕微充血，肝細(xì)胞質(zhì)少量空泡化(圖3B)。中劑量組中央靜脈充血，肝細(xì)胞索凌亂，肝竇隙內(nèi)有大量枯否氏細(xì)胞。部分肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)顆粒變性、壞死，肝細(xì)胞質(zhì)空泡化(圖3C)。高劑量組匯管區(qū)有血管效應(yīng)，肝細(xì)胞索凌亂，肝竇隙擴張，充滿紅細(xì)胞。肝細(xì)胞廣泛性腫脹，出現(xiàn)顆粒變性、壞死，肝細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化(圖3D)。

2.2.3.2 脾臟 對照組脾組織結(jié)構(gòu)致密，無明顯病理學(xué)變化(圖3E)。低劑量組有輕微病變，可見少量巨核細(xì)胞(圖3F)。中劑量組病變較高劑量組輕微，巨核細(xì)胞明顯多于高劑量組(圖3G)。高劑量組脾臟白髓萎縮，脾血竇擴張、充滿紅細(xì)胞，脾臟可見大量巨核細(xì)胞；淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，部分淋巴細(xì)胞變性深染、核濃縮(圖3H)。

A～D.依次為對照組、低劑量組(輕微水腫)、中劑量組(輕微噬神經(jīng)現(xiàn)象)和高劑量組大腦(部分皮質(zhì)細(xì)胞腫脹、變性、壞死)；E～H.依次為對照組、低劑量組(輕微神經(jīng)細(xì)胞損傷)、中劑量組(血管套現(xiàn)象)和高劑量組小腦(明顯噬神經(jīng)現(xiàn)象)

2.2.3.3 腎臟 對照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)組織致密(圖3I)。低劑量組腎臟腎小球、腎小管均無明顯變化，但腎間質(zhì)嚴(yán)重充血、出血(圖3J)。中劑量組腎小球無明顯病變，腎小管上皮細(xì)胞胞漿渾濁、顆粒變性、胞核即將消失，腎小管遠(yuǎn)曲小管、近端小管管腔上皮有脫落并有滲出物，間質(zhì)充血、出血現(xiàn)象減輕(圖3K)。高劑量組腎臟中有的腎小球腫脹或固縮，腎小管病變與中劑量組一致。腎小管間質(zhì)充血、出血明顯，尚存的腎小管內(nèi)有管型(圖3L)。

A～D.依次為對照組、低劑量組、中劑量組(心肌纖維腫脹)和高劑量組心臟(心肌纖維斷裂)；E～H.依次為對照組、低劑量組(輕微淤血)、中劑量組(肺泡壁增厚)和高劑量組肺臟(炎性細(xì)胞浸潤)

A～D.依次為對照組、低劑量組(輕微空泡化)、中劑量組(肝細(xì)胞索腫脹變性)和高劑量組肝臟(廣泛空泡化)；E～H.依次為對照組、低劑量組(輕微出血)、中劑量組(巨核細(xì)胞增加)和高劑量組脾臟(嚴(yán)重出血)；I～L.依次為對照組、低劑量組(輕微腫脹)、中劑量組(顆粒變性)和高劑量組腎臟(管型尿)

3 討論

有資料表明，烏頭堿主要表現(xiàn)為心臟毒性，可通過抑制心肌細(xì)胞膜上調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運相關(guān)ATP酶活性、電壓門控Na+離子通道開放導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載和離子水平紊亂，或者通過興奮迷走神經(jīng)釋放的乙酰膽堿直接抑制房室結(jié)或興奮異位起搏點，進而引起心律失常[20-21]，還可破壞線粒體等細(xì)胞器及心肌細(xì)胞膜，引起心肌細(xì)胞死亡，乙酰膽堿釋放增加可引起大量NO產(chǎn)生，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[22]，造成心臟組織損傷，小鼠表現(xiàn)口鼻、尾尖及四肢末端發(fā)黑，尾尖發(fā)涼等循環(huán)系統(tǒng)癥狀。

此外，烏頭堿在體內(nèi)可通過胃腸道及肝臟代謝[23]，相應(yīng)的代謝產(chǎn)物可在這些器官被吸收通過腎臟隨尿液排出[24]，心臟受損引起的缺血、缺氧加上烏頭堿及其代謝產(chǎn)物的毒性作用，使小鼠消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)器官受損。烏頭堿還可通過影響神經(jīng)細(xì)胞離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)濃度及神經(jīng)細(xì)胞能量代謝，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[25]，影響P-糖蛋白表達[26]等機制對中樞神經(jīng)產(chǎn)生毒性作用。本試驗中各攻毒組小鼠均不同程度表現(xiàn)中毒癥狀，尤其是高劑量組小鼠表現(xiàn)大量出汗、腹瀉、嘔吐，并伴有明顯的神經(jīng)癥狀。

在獸醫(yī)臨床上，由于動物疾病種類繁多，發(fā)病原因及發(fā)病機制復(fù)雜，除臨床癥狀觀察外，對組織器官進行病理學(xué)檢查有助于動物疾病的診斷，此外，病理組織學(xué)變化也是藥物毒性對機體可能產(chǎn)生損傷的重要依據(jù)[27]。劉剛等[28]對兔進行灌胃染毒制備急性草烏中毒模型并采集心室肌、肝臟、大腦皮質(zhì)，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)消失；心室肌細(xì)胞水腫，血管充血；肝臟組織可見匯管區(qū)血管效應(yīng)及大量淋巴細(xì)胞浸潤。Ji B L等[29]在研究烏頭堿對人胰腺癌細(xì)胞生長和凋亡的影響時，對腫瘤組織進行HE染色并觀察發(fā)現(xiàn)，烏頭堿能抑制胰腺腫瘤組織的生長，且烏頭堿濃度越高，腫瘤生長受抑制越明顯。Prasanta P K等[30]在用硼砂處理烏頭堿進行減毒研究中對烏頭堿攻毒組大鼠多種組織器官進行病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞且有嚴(yán)重出血，睪丸中精子發(fā)生急劇減少，子宮上皮細(xì)胞脫落。本試驗結(jié)果與前人報道基本一致，同時高劑量組小鼠主要臟器均發(fā)生不同程度的變性、壞死，間質(zhì)組織充血、出血等病理學(xué)變化，相比病變更為嚴(yán)重，這可能與試驗動物品種、攻毒濃度不同等有關(guān)。值得一提的是，本試驗中中劑量組脾臟中巨核細(xì)胞明顯多于高劑量組，表明中劑量烏頭堿可激活并增強小鼠機體免疫功能，而高劑量組則呈現(xiàn)明顯免疫抑制作用。

本試驗探討了亞急性烏頭堿中毒對小鼠主要臟器的病理組織學(xué)變化的影響，結(jié)果表明不同濃度烏頭堿對小鼠各組織臟器具有明顯毒性作用，其中以心臟和神經(jīng)毒性損傷最為明顯。本試驗結(jié)果可為后續(xù)烏頭堿毒性作用機制研究及動物烏頭中毒病防治提供理論依據(jù)。