李雙男 ， 張賀楠 ， 何至遠 ， 王振豹 ， 郝霖雨 ， 張釗偉 ， 王洪海 ， 牛建祁

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犬四聯(lián)弱毒活疫苗可以預防犬瘟熱、犬細小病毒性腸炎、犬副流感、犬腺病毒(犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎)感染癥。

犬瘟熱 (Canine distemper，CD) 是由犬瘟熱病毒 (Canine distemper virus，CDV) 引起的一種以鼬科、犬科、海豹科、部分浣熊科等為主的食肉動物急性、烈性、高度接觸性傳染病[1-2]。犬瘟熱患病動物的康復依賴于機體的抗體水平，對于犬瘟熱的治療目前無特效藥物，最有效的預防方法仍是接種疫苗。血凝蛋白(H)是CDV囊膜表面主要糖蛋白之一，CDV通過H蛋白吸附到細胞受體上來啟動病毒感染過程，因此H蛋白決定了CDV的宿主特異性和組織嗜性。犬細小病毒病(Canine parvovirus disease,CPD)又稱犬傳染性腸炎或犬病毒性腸炎，是由犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的犬的一種急性、接觸性、致死性傳染病。CPV屬于細小病毒科細小病毒屬，衣殼蛋白VP2在確定CPV的抗原性和宿主范圍方面起著重要作用[3-4]。

本試驗以PCR的方法對犬瘟熱病毒H基因、犬細小病毒VP2基因進行序列擴增，利用生物軟件參照國內(nèi)流行毒株序列，對A廠和B廠疫苗毒株序列進行分析，比較疫苗毒株間差異及疫苗毒與流行毒之間差異。

1 材料與方法

1.1 材料 A廠家：犬瘟熱、犬副流感、犬腺病毒與犬細小病毒病四聯(lián)活疫苗，批號：1901001；B廠家：犬瘟熱、腺病毒2型、副流感、細小病毒病四聯(lián)活疫苗，批號：320966B；DNA 提取試劑盒、RT-PCR試劑盒，均購自北京全式金生物技術有限公司；引物由北京新時代(三博遠志)科技有限公司合成。

1.2 引物設計 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的犬瘟熱病毒H基因、犬細小病毒VP2基因序列設計2對引物：P1:CDV-H-F 5′-ATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTG-3′；P2:CDV-H-R 5′-GTCAGGGATTTGAACGGTTACATG-3′；P3:CPV-VP2-F 5′-TACAGGATCTGGGAACGGGT-3′；P4:CPV-VP2-R 5′-TGGATTCCAAGTATGGGAGGC-3′，預測CDV和CPV的PCR產(chǎn)物大小為1.7 bp。

1.3 基因組的提取及PCR/RT-PCR的檢測 取A廠和B廠的疫苗稀釋液200 μL，用DNA/RNA提取試劑盒提取DNA/RNA樣本。分別用P1和P2擴增CDV基因片段，P3和P4擴增CPV基因片段，PCR反應體系：模板 DNA 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Rmix 25 μL，Emix 1 μL,ddH2O 12 μL。CDV反應條件:45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預變性5 min； 94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 100 s,共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。CPV同上述反應條件，無需反轉(zhuǎn)錄過程。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存，取5 μL進行凝膠電泳。

1.4 各疫苗毒株的序列測定與分析 PCR產(chǎn)物送北京新時代(三博遠志)科技有限公司進行序列測定，從NCBI的數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的我國CDV與CPV流行毒株的序列，并下載保存，將2個廠家測序結果與我國流行毒株利用MEGA 6和Megnalign軟件進行序列分析比對，繪制進化樹，分析同源性，并對主要蛋白的突變點進行差異分析。

2 結果

2.1 各基因序列的PCR擴增 提取基因組經(jīng)PCR/RT-PCR 擴增，測序表明，獲得CDV的PCR產(chǎn)物大小為1 763 bp，CPV的PCR產(chǎn)物大小為1 754 bp，結果與預期大小一致(圖1)。

圖1 不同廠家疫苗毒CDV的H基因與CPV的VP2基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of the H gene of CDV and VP2 gene of CPV from different vaccine manufacturersM：DL 2 000 plus marker； 1： A廠疫苗CDV的PCR產(chǎn)物; 2： B廠疫苗CDV的PCR產(chǎn)物; 3: A廠疫苗CPV的PCR產(chǎn)物; 4: B廠疫苗CPV的PCR產(chǎn)物M: DL 2000 plus marker; 1: PCR product of CDV vaccine from manufacturer A; 2: PCR product of CDV vaccine from manufacturer B; 3: PCR product of CPV vaccine from manufacturer A; 4: PCR product of CPV vaccine from manufacturer B

2.2 CDV疫苗H基因序列分析 A廠家和B廠家2個廠家疫苗提取的CDV疫苗毒H基因和我國已發(fā)表的部分毒株序列構建分子進化樹與核苷酸序列同源性結果見圖2。2個廠家CDV疫苗毒株核苷酸序列同源性為92.9%，與國內(nèi)流行毒株核苷酸序列同源性均在89.6%以上，相似性高，其中B廠家的CDV毒株與國內(nèi)流行毒株的核苷酸序列同源性在92.5%～95.6%，A廠家的CDV毒株與國內(nèi)流行毒株的核苷酸序列同源性在89.6%～96.2%。

圖2 CDV疫苗毒H基因分子進化樹與核苷酸序列同源性分析Fig.2 Molecular evolution tree and nucleotide sequence homology analysis of H gene of CDV vaccine virus

2.3 CPV疫苗VP2基因序列分析 A廠家和B廠家2個廠家疫苗的CPV疫苗毒VP2基因和我國已發(fā)表的部分毒株序列構建分子進化樹與核苷酸序列同源性比較結果見圖3。2個廠家CPV疫苗毒株核苷酸序列同源性為98.6%，與國內(nèi)流行毒株核苷酸序列同源性均在98.1%以上，相似性高，其中B廠家的CPV毒株與國內(nèi)流行毒株的核苷酸序列同源性在98.7%～99.5%，A廠家的CPV毒株與國內(nèi)流行毒株的核苷酸序列同源性在98.1%～98.6%。

圖3 CPV疫苗毒VP2基因分子進化樹與核苷酸序列同源性分析Fig.3 Molecular evolution tree and nucleotide sequence homology analysis of VP2 gene of CPV vaccine virus

2.4 CDV與CPV疫苗毒重要結合位點差異分析 CDV H蛋白作為重要的膜蛋白，主要通過與宿主體內(nèi)信號淋巴細胞激活因子(SLAM受體)的結合進行復制。研究表明，H蛋白個別氨基酸位點改變會影響與SLAM受體的結合能力。文獻報道這些位點集中在第525、526、529、530位和第549位等位點。分析發(fā)現(xiàn)，A廠家的疫苗株的這幾個位點氨基酸與國內(nèi)流行毒株在第530位和第549位氨基酸差異明顯。B廠家的疫苗株的這幾個位點氨基酸與國內(nèi)流行毒株在第530位氨基酸差異明顯。

CPV的VP2基因長1 755 bp，編碼584個氨基酸，在MegAlign軟件中將由本試驗擴增得到的疫苗毒株VP2基因的氨基酸推導序列進行差異比較后，與GenBank中我國境內(nèi)分離到的流行毒株進行氨基酸比對分析，共發(fā)現(xiàn)了5個主要位點的差異，分別是第44、219、375、386位和第418位氨基酸。見表1。

表1 CDV與CPV疫苗毒重要結合位點差異分析Table 1 Difference analysis of important binding sites of CDV and CPV vaccine virus

3 討論

同源性是指在進化過程中源于同一祖先的分支之間的關系，疫苗毒株與流行毒株的同源性越高，從某種程度上來講越能提供更高的保護力。本試驗通過比較不同廠家疫苗毒株序列與國內(nèi)流行毒株的序列的差異，對其同源性進行分析，A廠和B廠生產(chǎn)的犬四聯(lián)活疫苗比較，兩者犬瘟熱、犬細小毒株序列同源性均較高，分別為CDV 92.9%和CPV 98.6%，但B廠家的CDV和CPV毒株序列與國內(nèi)已發(fā)表的流行毒株相比同源性略高于A廠家。毒株關鍵蛋白的幾個關鍵位點堿基、氨基酸的變化就會影響病毒的生物學特征，決定病毒抗原特性及宿主范圍的改變。而本試驗針對的CDV的H蛋白和CPV的VP2蛋白正是起決定作用的關鍵蛋白。CDV的H蛋白個別氨基酸位點改變會影響與SLAM受體的結合能力，從而影響免疫機制的工作，本試驗選取的A廠家和B廠家2個廠家在H蛋白的關鍵位點氨基酸均有不同程度的變化，理論上來說，免疫效果也有略微差異，而宿主的免疫機制以及身體因素也是免疫效果的重要方面。

據(jù)文獻報道，CPV的變異主要存在于第323、426、440位。第323位氨基酸可以影響病毒與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結合[5]；第426位決定CPV的突變株類型，CPV-2a為天冬酰胺(N)，CPV-2b為天冬氨酸(D)。2000年，CPV-2c的出現(xiàn)則是VP2基因上第426位氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?E)。這種新的變異株在美國、意大利、巴西、印度等地都有出現(xiàn)過。第440位氨基酸位于GH LOOP區(qū)，相關報道指出，第440位氨基酸(Thr→Ala)的高突變與抗原的不斷變異有關，進一步表明該位點具有高突變性[6]。而本試驗的2個 廠家的疫苗在幾個主要變異位點上均一致，可以推測，在細小病毒的防控方面2個廠家差異不大。目前CPV在全球的防控仍較嚴峻，有文獻報道免疫過細小病毒疫苗的犬仍有患病的風險[7-8]。

犬四聯(lián)疫苗的選擇需要考慮以下幾個因素:毒株匹配度、抗原含量、佐劑等。綜合分析，想要給予飼養(yǎng)犬只更好的保護，接種疫苗無疑是最好的選擇，但疫苗產(chǎn)品與廠家的選擇要從多方面來綜合考慮，不能單憑一個方面來下結論。