王 旭 ， 王可洲 ， 胡 軍 ， 李方正 ， 王冬冬 ， 郭中坤 ， 雷 戰(zhàn) ， 楊宗統(tǒng) ， 齊昊南 ， 原昆鵬 ， 齊佳欣 ， 胡靜雷 ， 時啟琳 ， 尹 月 ， 王建琳 ， 尹燕博

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109 ； 2. 山東省實驗動物中心 ， 山東 濟南 250002 ； 3. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 上海 楊浦 201699 ； 4. 青島博隆實驗動物有限公司 ， 山東 青島 266200 ； 5. 山東省中醫(yī)藥研究院 ， 山東 濟南 250031 ； 6.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 吉林 延吉 133000)

無特定病原(Specific pathogen free,SPF)犬是指除普通級實驗犬應(yīng)排除的病原外，還不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學(xué)實驗干擾大的病原的實驗犬，是生物醫(yī)學(xué)特別是獸醫(yī)學(xué)研究的重要基礎(chǔ)支撐。1946年，Glimstedt 首次培育成無菌犬，隨后 Reece 等在 1968年培育并建立了SPF犬種群[1]。1992年，上海醫(yī)科大學(xué)實驗動物部利用剖腹產(chǎn)技術(shù)培育出6只 SPF 級比格犬[2]，此后未見相關(guān)報道。到目前為止，我國尚無SPF犬核心種群，未能實現(xiàn) SPF 級實驗用比格犬的持續(xù)、批量生產(chǎn)。本研究參照培育 SPF 豬所用的無菌接產(chǎn)技術(shù)，獲得仔犬轉(zhuǎn)移至無菌隔離器繼續(xù)飼養(yǎng)，成功培育出3批共128 只 SPF 級比格犬。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級種母比格犬24只，年齡2～6歲， 來源于青島博隆實驗動物有限公司[SCXK(魯)20170006]。實驗犬飼養(yǎng)在青島博隆實驗動物有限公司 SPF 動物房內(nèi)[SYXK(魯)20180026]，溫度：23～25 ℃，濕度：50%～65%，12 h 光照 12 h 黑暗。所有操作均符合實驗動物福利要求，并給予實驗動物人道關(guān)懷。

1.2 試劑、物品與儀器 犬細小病毒抗體(CPV-Ab)、犬瘟熱病毒抗體(CDV-Ab)、犬腺病毒抗體(CAV-Ab)、犬冠狀病毒抗體(CCV-Ab)、犬副流感病毒抗體(CPIV-Ab)、犬皰疹病毒抗體(CHV-Ab)ELISA 檢測試劑盒，均購自美國 XpressBio 公司；狂犬病毒抗體(RV-Ab)、弓形蟲抗體(TOX-Ab)ELISA 檢測試劑盒，均購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；鉤端螺旋體抗體(LEP-Ab)ELISA 抗體檢測試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；布魯氏菌試管凝集抗原，購自中國疾病預(yù)防控制中心。HT-1505A 型正壓隔離器為深圳市泓騰生物科技有限公司產(chǎn)品；LDZM-80L-Ⅲ型高壓蒸汽滅菌器為上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。復(fù)合微生物 B 粉、維生素 C 粉為濟南新星飼料有限公司產(chǎn)品；全價配方奶粉為美國PetAg 公司產(chǎn)品。

1.3 種犬選擇、病原微生物檢測及孕期管理 種犬的選擇標(biāo)準(zhǔn)：備選種犬遺傳背景清楚，母犬年齡2～6歲，公犬年齡2～7歲，中小體型，無難產(chǎn)史。歷史平均窩產(chǎn)仔數(shù)不少于 6 只，且健康成活。通過檢測，不攜帶《實驗動物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.2—2011)和《實驗動物 寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.1—2001)中規(guī)定的病原[3-4]，臨床健康且品相較好。

種犬采用碩騰公司生產(chǎn)的衛(wèi)佳捌?疫苗進行免疫，通過自然交配進行配種，種母犬轉(zhuǎn)入屏障環(huán)境之前檢測病原。檢測合格的種母犬懷孕后，轉(zhuǎn)到經(jīng)過徹底消毒的欄舍單獨飼養(yǎng)，并保持嚴(yán)格消毒。預(yù)產(chǎn)期前5天，轉(zhuǎn)移至屏障環(huán)境中適應(yīng)環(huán)境。

1.4 隔離器、屏障環(huán)境及用具消毒 由青島博隆實驗動物有限公司與深圳市泓騰生物科技有限公司聯(lián)合研制的新型 SPF 犬專用飼養(yǎng)隔離器，為雙箱體構(gòu)造，每個箱體可飼養(yǎng) 4～8 只幼犬，且箱體之間互不連通。隔離器上、下連接部分采用水封的方式密閉，內(nèi)置網(wǎng)床、料盆，四周帶有長臂軟質(zhì)膠手套。使用前先清潔各組件，按照正確的順序組裝隔離器。采用甲醛高錳酸鉀熏蒸方式對隔離器及屏障環(huán)境進行消毒，消毒之前先對隔離器的密閉性進行檢查[5]。將所需物品全部放入屏障環(huán)境后，每立方米用甲醛42 mL、高錳酸鉀21 g混勻熏蒸24 h后通風(fēng)3 d備用[6]。保溫轉(zhuǎn)運箱用1%過氧乙酸溶液噴霧消毒60 min，奶瓶、料盆、手套、洗耳球、手術(shù)剪等用2%過氧乙酸浸泡消毒30 min后通風(fēng)24 h備用[7]。所需墊布和衣物等經(jīng)121 ℃、110 kPa高壓滅菌20 min后烘干備用。

1.5 無菌接產(chǎn) 母犬轉(zhuǎn)入屏障環(huán)境之前，用0.2%新潔爾滅對其進行全身清洗消毒。母犬轉(zhuǎn)移到屏障環(huán)境后每天用1%聚維酮碘帶犬消毒欄舍1次。母犬有分娩預(yù)兆前再次對母犬進行消毒，尤其注意會陰部及后軀、口腔消毒。用開殖器打開母犬陰道，再用麥?zhǔn)香Q夾住經(jīng)0.1%新潔爾滅浸泡過的海棉反復(fù)幾次消毒陰道。用硫酸卡那霉素噴鼻，每側(cè)鼻孔3 mL[8]。接產(chǎn)人員事先用消毒液浸泡雙手，待母犬分娩時迅速將仔犬放置在消毒好的墊巾上，用洗耳球吸出仔犬口腔及鼻腔內(nèi)液體并結(jié)扎、消毒臍帶，隨后將仔犬浸泡在 0.1%新潔爾滅溶液中浸泡消毒。仔犬消毒體表后用滅菌墊布擦干，涂布接生粉后即放入保溫轉(zhuǎn)運箱中并盡快通過氣閘轉(zhuǎn)移到無菌隔離器中[9-11]，每個隔離器飼養(yǎng) 4～8 只，不同母犬所生仔犬不能混合放置。

1.6 仔犬的飼養(yǎng)管理 隔離器內(nèi)溫度第1周為34～35 ℃， 以后每周降低 2 ℃，到 24～26 ℃為止[12]。隔離器內(nèi)壓力維持在 100～120 Pa,濕度在 40%～70%，換氣次數(shù)為30次/h。采用全人工哺乳的方式喂養(yǎng)仔犬，奶粉濃度按照說明書調(diào)配。仔犬自出生6 h后開始哺乳，哺乳量根據(jù)仔犬的食欲及腹圍確定，不能喂至全飽。仔犬不同日齡每日哺乳次數(shù)及哺乳量見表1。哺乳期內(nèi)每次哺乳后用滅菌棉球擦拭犬的肛門及外陰，促使其排便、排尿，并且每日稱重，測量體長。仔犬 30 日齡開始飼喂高壓滅菌的全價顆粒犬糧，飼喂時將犬糧搗碎并配合適量復(fù)合維生素 B 及維生素 C。仔犬 35 日齡開始斷奶，之后每日飼喂 4 次，同時給予煮沸滅菌的溫水。仔犬飼喂過程嚴(yán)格按照程序操作，飼喂結(jié)束后對傳遞倉、奶瓶等物品進行消毒，切斷病原傳播途徑，確保仔犬健康成活。

表1 SPF 仔犬不同日齡哺乳次數(shù)及每次哺乳量Table 1 Breastfeeding frequency and breastfeeding volume of SPF puppies at different ages

1.7 病原檢測種類及方法 除《實驗動物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.2—2011)和《實驗動物 寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.1—2001)中規(guī)定的 SPF 犬需凈化的15種病原之外[3-4]，對規(guī)?；B(yǎng)殖犬廠危害較大的犬冠狀病毒、犬皰疹病毒、犬副流感病毒、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌進行檢測。

采集24只所選種母犬的毛發(fā)、糞便拭子及口鼻拭子，無菌采集種母犬血清。于仔犬 2月齡時采集毛發(fā)、糞便拭子及口鼻拭子，無菌采集仔犬血清[2]。將待檢樣本送至山東省實驗動物中心，按照《實驗動物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.2—2011)和《實驗動物 寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.1—2001)中規(guī)定的檢測方法進行檢測[3-4]，對于國標(biāo)規(guī)定之外的病原自行檢測。病原檢測方法見表2。病毒檢測引物見表3。

表2 SPF 仔犬和種母犬病原及抗體檢測方法Table 2 Pathogens and antibody detection methods of SPF puppies and breeding dogs

表3 病毒檢測引物Table 3 Primers for virus detection

2 結(jié)果

2.1 種母犬及SPF犬病原檢測 對符合標(biāo)準(zhǔn)的24只 種母犬進行無菌接產(chǎn)，共獲得仔犬 141 只，1月齡仔犬成活個數(shù)為 128 只，成活率為 90.78%。種母犬及仔犬病原檢測結(jié)果均為陰性，見表4。

表4 種母犬及 SPF 仔犬抗原檢測結(jié)果Table 4 Pathogen test results of breeding female dogs and SPF puppies

2.2 隔離器飼養(yǎng)與普通飼養(yǎng)比格犬生長指標(biāo)對比分析 分別測量 20 只普通環(huán)境飼養(yǎng)的與128只無菌接產(chǎn)隔離器飼養(yǎng)的比格犬 0、10、20、30、40、50、60日齡 生長發(fā)育各項指標(biāo)，結(jié)果如表5所示。

表5 隔離器飼養(yǎng)與普通飼養(yǎng)的比格犬生長指標(biāo)對比Table 5 Comparison of growth indicators of beagle dogs fed in isolators and in ordinary environment

3 討論

早在 20 世紀(jì) 60年代，人們就普遍認識到 SPF 動物對于生物醫(yī)學(xué)研究的重要性[20]，美國、日本、荷蘭等國家先后培育出 SPF 犬核心種群[21-23]。我國 SPF 犬培育工作起步較晚，直到 1992年才開始探索[2]。目前國際上獲得初代 SPF 犬的方法，僅見剖腹取胎法。而初代SPF 豬的獲取方法，則有自然分娩、早期隔離式斷奶技術(shù)(SEW)、子宮切開、子宮切除、胚胎移植、無菌接產(chǎn)等[11,24]。自然分娩和早期隔離式斷奶方式操作簡單，對母犬損傷小，但是不能完全切斷來自母犬的污染。子宮切開、子宮切除可以較好地控制來自環(huán)境和母犬的污染，但是對母犬損傷太大，不符合動物福利要求，且切除子宮的母犬不能再利用，成本較高。無菌接產(chǎn)法操作相對簡單，對母犬損傷小，且母犬可以重復(fù)利用，更加符合動物福利要求。無菌接產(chǎn)操作過程需注意以下兩點：一是母犬分娩的時間不易準(zhǔn)確判斷，一旦接產(chǎn)人員錯過接產(chǎn)時間，母犬所產(chǎn)仔犬則不能利用;二是母犬產(chǎn)程較長，對母犬和屏障環(huán)境的消毒及接產(chǎn)人員素質(zhì)要求較高。一旦消毒不徹底，容易造成來自環(huán)境和母犬的污染。本研究最終選擇無菌接產(chǎn)方式獲得 SPF 仔犬。研究結(jié)果表明，無菌接產(chǎn)隔離飼養(yǎng)的比格犬可以排除國標(biāo)規(guī)定的15種病原，以及犬冠狀病毒、犬皰疹病毒、犬副流感病毒、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌等本研究項目規(guī)定的病原。

SPF級動物生產(chǎn)過程中，質(zhì)量控制最為關(guān)鍵。本研究采用新型研制的 SPF 犬專用飼養(yǎng)隔離器，隔離器內(nèi)各項參數(shù)由電腦自動監(jiān)控。隔離器外部亦為屏障環(huán)境，其建造要求和參數(shù)符合GB50447—2008《實驗動物設(shè)施建設(shè)技術(shù)規(guī)范》及 GBl4925—2010《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》的規(guī)定[25-26]。設(shè)施設(shè)備啟用前進行嚴(yán)格的消毒，檢測合格之后方可投入使用。日常生產(chǎn)管理中需要建立、健全各項管理制度和操作規(guī)程，進入設(shè)施內(nèi)物品須嚴(yán)格消毒，定期對內(nèi)外屏障環(huán)境進行消毒。此外，還要對動物定期進行檢測，及時淘汰病原或抗體陽性犬只。

仔犬的生長發(fā)育與生產(chǎn)方式、乳品質(zhì)量、斷奶日齡、飼養(yǎng)管理、飼料營養(yǎng)成分、生活環(huán)境等諸多因素有關(guān)。本研究通過無菌接產(chǎn)獲得仔犬，由于缺乏初乳及哺乳時間較長，加之仔犬生活在潔凈環(huán)境中，難以建立起普通環(huán)境中的腸道菌群，導(dǎo)致SPF仔犬生長發(fā)育各項指標(biāo)均低于普通環(huán)境下飼養(yǎng)的仔犬。此外，SPF仔犬生活空間狹小，缺乏有效的鍛煉，這也是其較之普通環(huán)境下飼養(yǎng)的仔犬體型小的原因。

目前為止，我國尚無一家單位可穩(wěn)定、批量提供SPF級比格犬，這種狀況嚴(yán)重影響了犬疫病研究、疫苗研發(fā)及評價工作，對人獸共患病的防制極為不利。本研究通過對母犬進行高強度免疫凈化病原，通過無菌接產(chǎn)獲得SPF仔犬，將其飼養(yǎng)在正壓屏障系統(tǒng)中的無菌隔離器中，同時對環(huán)境、用具、飼料、飲水等進行嚴(yán)格的控制。病原及抗體檢測結(jié)果表明，本方法生產(chǎn)的SPF仔犬，完全達到并優(yōu)于國標(biāo)要求，可用于SPF犬的批量生產(chǎn)及SPF犬核心種群的建立。本研究所建立的配套技術(shù)及生產(chǎn)的產(chǎn)品，不僅為我國重大動物疫病防控所急需，還將在人類醫(yī)學(xué)研究特別是新藥研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。