隋春紅 ， 吳沚蒙 ， 耿澤男 ， 姚 璐 ， 羅 軍 ， 安 英 ， 張 巍 ， 王 程

(吉林醫(yī)藥學院藥學院 ， 吉林 吉林 132013)

在臨床治療2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)過程中發(fā)現(xiàn)，多種中藥均能提取到有效的降糖活性成分，來源廣泛、種類豐富[1]。中藥降糖活性成分具有良好的降糖作用，不僅對人體產生的副作用小，而且可發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多靶點的綜合作用，具有獨特優(yōu)勢[2]。刺五加苷提取物(Acanthopanaxsenticosusglycosides extract,ASGE)主要含有刺五加苷B(紫丁香苷)、刺五加苷E和三萜皂苷等化合物，具有降低空腹血糖，緩解胰島素抵抗及防治糖尿病并發(fā)癥的功效[3]，其作用機制與多方面因素有關。ASGE可通過調節(jié)機體氧化還原平衡，抵御糖尿病引起的氧化應激損傷[4]，ASGE亦可通過調控物質和能量代謝，糾正糖尿病導致的物質代謝紊亂[5]和能量代謝障礙[6]，ASGE還能通過改善血液流動性以減少組織細胞的耗氧量，緩解糖尿病發(fā)生過程中胰島素B細胞的損傷[7]?；诰W絡藥理學深入研究其分子機制發(fā)現(xiàn)，ASGE發(fā)揮降糖作用可能與絲裂原蛋白激酶信號通路、環(huán)磷酸腺苷信號通路、酪氨酸蛋白激酶信號通路等多種信號轉導途徑有關[8]。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,PKB/Akt)信號通路是胰島素發(fā)揮作用的主要信號通路之一，與糖尿病密切相關。PI3K是胰島素受體(Insulin receptor,IR)的重要下游分子，與胰島素受體底物(Insulin receptor substrate,IRS)結合并被活化，催化產生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇并使Akt激活，Akt發(fā)揮蛋白激酶活性磷酸化叉頭框蛋白1(Forkhead box O1,FoxO1)等下游分子，進而調節(jié)多種糖代謝相關酶類及葡萄糖轉運體(Glucose transporters,GLUT)，發(fā)揮調節(jié)糖代謝的作用[9]。故此，為明確ASGE通過調控PI3K/Akt信號通路對糖尿病小鼠糖代謝的作用及其分子機制，本試驗利用鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)致T2DM小鼠模型為研究對象，以二甲雙胍(Metformin)為陽性藥物對照，初步探討ASGE通過PI3K/Akt信號通路降低血糖的分子機制，為刺五加在糖尿病治療方面的應用提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ASGE由課題組自制，采用超聲波輔助乙醇提取，正丁醇萃取后AB-8大孔樹脂純化，經高效液相色譜分析鑒定其主要成分為刺五加苷B和刺五加苷E，并含有少量吡喃阿洛糖苷、齊墩果烯糖苷、羅盤草苷等其他苷類物質[10]。二甲雙胍、STZ(美國Sigma公司，批號分別為BCBT7573和WXBC3087V)；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、血糖含量檢測試劑盒、考馬斯亮藍G-250、糖代謝相關酶(HK、PFK、CS、GS、PEPCK)活力測定試劑盒、蘇木素-伊紅(H.E.)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20181107、20190301、20181026、20190213、20190319、20190218、20190330、20190305和20201021)；動物組織總RNA提取試劑盒和一步法熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號分別為Q5919和Q5310)；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；兔抗鼠p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt抗體、山羊抗兔β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國CST公司，批號分別為201904、201812、201905、201810和201901)；兔抗鼠p-FoxO1、FoxO1、GLUT-2抗體和山羊抗兔HRP-IgG抗體(上海艾博抗貿易有限公司，批號分別為GR3192627-1、GR319251-1、GR3193674-2和GR3192836-1)；ECL發(fā)光液(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號180903-1)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、TBST封閉洗滌緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為 072219191228、101519191116和091419191124)。

1.2 主要儀器 590型血糖儀(江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司)；BMC500數(shù)碼生物顯微鏡(鳳凰光學股份有限公司)；ABI7500熒光定量PCR儀(美國AB公司)；JY-SCZ2+型垂直電泳槽、JY-ZY5型轉移電泳槽、JY300C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；680型酶標儀、Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗動物 近交系C57BL/6J雄性小鼠，SPF級，8周齡，由長春億斯實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號:SCXK(吉)2011—0004。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±1)℃，濕度(55±5)%，12 h光/暗循環(huán)，自由飲水，基礎飼料喂養(yǎng)。

1.4 試驗方法

1.4.1 糖尿病小鼠的制備 雄性C57BL/6J小鼠50只，高脂飼料喂養(yǎng)4周。禁食12 h后首次按40 mg/(kg·bw)劑量腹腔注射現(xiàn)用現(xiàn)配的50 mmol/L STZ(4 ℃預冷0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液配制，避光，pH4.5)，隨后每隔24 h注射1次，每次注射前4 h禁食不禁水，共注射5次，期間給予小鼠喂飼高脂飼料和飲用10%蔗糖水，末次注射后恢復為基礎飼料和普通飲用水[11]，此后連續(xù)3 d尾尖采血，空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)濃度>11.1 mmol/L的小鼠判定為T2DM模型小鼠[12]。另設基礎飼料喂養(yǎng)的正常小鼠10只，按3 mL/(kg·bw)腹腔注射0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液作為平行對照。

1.4.2 分組及給藥 選取基礎飼料喂養(yǎng)的正常小鼠10只為空白對照(BC)組。選取造模成功的T2DM小鼠40只，隨機分為糖尿病模型(DM)組、二甲雙胍對照[MC,150 mg/(kg·bw)]組[13]、刺五加苷提取物低劑量[ASGE-L,200 mg/(kg·bw)]組、高劑量[ASGE-H,400 mg/(kg·bw)]組[14]，每組各10只。BC組和DM組小鼠給予生理鹽水灌胃，DC組小鼠給予7.5 g/L的二甲雙胍灌胃，ASGE-L組和ASGE-H組小鼠分別給予10 g/L和20 g/L的 ASGE灌胃。各組小鼠灌胃體積均為20 mL/(kg·bw)，每日灌胃1次，連續(xù)28 d。

1.4.3 體重測量 每2天測量小鼠體重1次。

1.4.4 血糖變化和葡萄糖耐受性測定 每3天尾尖采血測定1次FBG，觀察小鼠血糖變化。末次給藥后，小鼠禁食不禁水6 h，然后用400 g/L葡萄糖溶液，按2.5 g/(kg·bw)劑量灌胃，測定0、0.5、1 h和2 h時血糖，進行口服葡萄糖耐量試驗(Oral glucose tolerance test,OGTT)[15]。

1.4.5 胰島素抵抗指數(shù)和敏感性指標測定 小鼠禁食18 h，10%水合氯醛[4 mL/(kg·bw)]麻醉，眼球取血，3 000 r/min離心15 min，取血清。葡萄糖氧化酶法測定血清FBG，酶聯(lián)免疫法測定血清胰島素(Insulin,INS)，采用梅斯醫(yī)學胰島素敏感性在線評分系統(tǒng)(http://m.medsci.cn/scale/)計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA of insulin resistance,HOMA-IR)。

1.4.6 葡萄糖代謝相關酶活力測定 取小鼠肝組織剪碎稱重后，加9倍組織重量的生理鹽水勻漿，勻漿液在冰水浴下超聲破碎后4 ℃下12 000 r/min離心30 min，取上清液即為肝組織總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。按試劑盒說明書取肝組織總蛋白分別加入己糖激酶(Hexokinase,HK)、磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK)、檸檬酸合酶(Citrate synthase,CS)、糖原合成酶(Glycogen synthase,GS)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)的酶反應體系中，測定反應體系吸光度值，并根據肝組織總蛋白濃度計算酶活力。

1.4.7 組織病理學檢查 取小鼠肝組織固定于10%中性福爾馬林緩沖液，經常規(guī)組織脫水、透明、包埋、切片，然后進行H.E.染色，樹脂封片，顯微鏡下觀察并記錄病理變化。

1.4.8 胰島素信號相關基因表達檢測 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應法測定肝組織中IRS-1、IRS-2基因和IR基因mRNA的相對表達量。提取小鼠肝組織總RNA，紫外分光光度法測定260 nm波長下吸光度值并計算總RNA濃度。將1 μg總RNA逆轉錄成cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因為內參，檢測肝組織中IR、IRS-1、IRS-2的mRNA表達水平，引物序列由PrimerBank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)查詢，見表1。25 μL反應體系包含cDNA 1 μL(≤100 ng)、上下游引物各0.5 μL、12.5 μL反應液和10.5 μL雙蒸水。反應程序為50 ℃ 預熱2 min，95 ℃預變性10 min，之后為40個循環(huán)的3步反應：95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 退火30 s，反應結束后，通過熔解曲線分析確定PCR產物是否單一，獲得PCR反應臨界循環(huán)數(shù)Ct值，用2-ΔΔCt計算待測基因mRNA的相對表達量。ΔΔCt=ΔCt試驗處理組-ΔCt對照組，各組ΔCt=Ct待測基因-Ct內參基因。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Real-time PCR primer

1.4.9 胰島素信號相關蛋白磷酸化水平和GLUT-2蛋白表達的檢測 免疫印跡法檢測p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-FoxO1、FoxO1和GLUT-2的蛋白相對表達量。取小鼠肝組織總蛋白加5×上樣緩沖液，煮沸10 min。配制10%的分離膠和5% 的濃縮膠，每孔加50 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE后電轉印到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000稀釋 的p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-FoxO1、FoxO1、GLUT-2和β-Actin一抗，4 ℃孵育14 h，TBST漂洗后加1∶2 000稀釋的HRP-IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST充分漂洗后加ECL試劑顯影，用Quantity One軟件對蛋白條帶進行分析，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1比值為蛋白磷酸化水平，GLUT-2/β-actin比值為蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 對小鼠體重變化的影響 試驗期間BC組小鼠體重呈生理性增長。給藥前第33天(造模前)，各組小鼠體重無顯著差異(P>0.05)；給藥第1天，DM組、MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠體重無顯著差異(P>0.05)，但較BC組小鼠顯著增加(P<0.01)； 給藥第28天，DM組、MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠體重均呈負增長(P<0.01)，但MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠體重較DM組小鼠顯著增加(P<0.01)，見表2。

表2 ASGE對STZ 誘導糖尿病小鼠體重的影響Table 2 Effect of ASGE on body weights in STZ-induced diabetic mice

2.2 對小鼠空腹血糖的影響 給藥第1天，DM組小鼠FBG顯著高于BC組(P<0.01)，且>11.1 mmol/L，說明糖尿病小鼠模型建模成功，MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠FBG與DM組無顯著性差異(P>0.05)；給藥第28天，BC組和DM組小鼠FBG較給藥第1天無顯著變化(P>0.05)，MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠FBG較給藥第1天顯著降低(P<0.01)，并且較DM組小鼠FBG也顯著降低(P<0.01)，見表3。

表3 ASGE對STZ 誘導糖尿病小鼠空腹血糖的影響Table 3 Effect of ASGE on FBG in STZ-induced diabetic mice

2.3 對小鼠葡萄糖耐量的影響 OGTT過程中，BC組小鼠0 h血糖<6.1 mmol/L，2 h血糖<7.8 mmol/L，為正常糖耐量；各組糖尿病組小鼠在0、0.5、1 h和2 h血糖均顯著高于BC組(P<0.01)，0 h 血糖≥7.0 mmol/L，2 h血糖≥11.1 mmol/L，均為糖尿病性糖耐量；但與DM組相比，MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠血糖顯著下降(P<0.01)，見表4。

表4 ASGE對STZ 誘導糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影響Table 4 Effect of ASGE on glucose tolerance in STZ-induced diabetic mice

2.4 對小鼠血清胰島素含量和胰島素抵抗指數(shù)的影響 給藥第28天，各組糖尿病小鼠血清INS較BC組均顯著升高(P<0.01)，HOMA-IR出現(xiàn)較大差異(P<0.01)。與DM組相比，MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠血清INS均顯著降低(P<0.01)，HOMA-IR也均顯著下降(P<0.01)，見表5。

表5 ASGE對STZ誘導糖尿病小鼠血清胰島素含量和胰島素抵抗指數(shù)的影響Table 5 Effect of ASGE on serum insulin level and insulin resistance index in STZ-induced diabetic mice

2.5 對小鼠葡萄糖代謝相關酶活力的影響 與BC組相比，各組糖尿病小鼠肝HK、PFK、CS、GS活力顯著降低(P<0.01)，PEPCK活力顯著增高(P<0.01)。與DM組相比，MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠肝HK、PFK、CS、GS活力顯著增高(P<0.01)，PEPCK活力顯著降低(P<0.01)，見表6。

表6 ASGE對STZ誘導糖尿病小鼠葡萄糖代謝相關酶活力的影響Table 6 Effect of ASGE on activities of enzymes related to glucose metabolism in STZ-induced diabetic mice

2.6 對小鼠肝組織病變的影響 BC組小鼠肝小葉結構完整，無變性或壞死肝細胞，匯管區(qū)血管、肝中央小靜脈及膽管均為正常結構，間質無結締組織增生。DM組小鼠肝小葉輪廓不清，組織結構松散，肝細胞重度腫脹、增大并呈濁狀改變,可見大量空泡，即脂滴所占據的胞內空間，與DM組相比，MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠上述病變均不同程度減輕，其中ASGE-H組小鼠改善效果較為明顯，肝小葉結構相對完整，肝細胞腫脹程度減輕，空泡數(shù)量減少變小，見中插彩版圖1。

圖1 小鼠肝臟組織病理學檢測(H.E.染色，上：100×，下：400×)Fig.1 Mice liver tissues detected by histopathology (H.E. staining,up:100×,down:400×)A：空白對照組； B：糖尿病模型組； C：二甲雙胍對照組； D：刺五加苷提取物低劑量組； E：刺五加苷提取物高劑量組A:Blank control (BC) group; B:Diabetes model (DM) group; C:Metformin control (MC) group;D:ASGE-Low dose (ASGE-L) group; E:ASGE-High dose (ASGE-H) group

2.7 對小鼠胰島素信號通路相關基因表達的影響 與BC組相比，各組糖尿病小鼠肝IRS-1、IRS-2和IR基因mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。與DM組相比，MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠肝IRS-1、IRS-2基因和IR基因mRNA表達水平顯著增高(P<0.01)。見表7。

表7 ASGE對STZ誘導糖尿病小鼠胰島素信號通路相關基因mRNA表達的影響Table 7 Effect of ASGE on mRNA expression of genes related to insulin signaling pathway in STZ-induced diabetic mice

2.8 對小鼠胰島素信號通路相關蛋白磷酸化水平和GLUT-2蛋白表達的影響 與BC組相比，DM組小鼠肝p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值和GLUT-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，p-FoxO1/FoxO1比值顯著升高(P<0.01)，MC組小鼠肝p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著降低(P<0.01)，p-FoxO1/FoxO1比值和GLUT-2蛋白表達水平顯著增高(P<0.01)，ASGE-L組和ASGE-H組小鼠肝p-PI3K/PI3K、p-FoxO1/FoxO1比值和GLUT-2蛋白表達水平顯著增高(P<0.01)，p-Akt/Akt比值顯著降低(P<0.01)。與DM組相比，MC組、ASGE-L組和ASGE-H組小鼠肝p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值和GLUT-2蛋白表達水平顯著增高(P<0.01)，p-FoxO1/FoxO1比值顯著降低(P<0.01)，見圖2和圖3。

圖2 小鼠胰島素信號通路相關蛋白的免疫印跡Fig.2 Immunoblotting of proteins related to insulin signaling pathway in mice1：空白對照組； 2：糖尿病模型組； 3：二甲雙胍對照組；4：刺五加苷提取物低劑量組； 5：刺五加苷提取物高劑量組1:Blank control (BC) group; 2:Diabetes model (DM) group;3:Metformin control (MC) group; 4:ASGE-Low dose (ASGE-L) group； 5:ASGE-High dose (ASGE-H) group

圖3 小鼠胰島素信號通路相關蛋白的表達量Fig.3 The relative expression of proteins related to insulin signaling pathway in mice注：與空白對照組比較，*:P<0.01; 與糖尿病模型組比較， #:P<0.01Note:Compared with blank control group,*:P<0.01; compared with diabetes model group, #:P<0.01

3 討論

中藥活性部位可發(fā)揮有效降糖作用，延緩并發(fā)癥的發(fā)生，且毒副作用小，因此具有抗糖尿病作用中藥活性成分具有較大開發(fā)潛力[16]。刺五加中含有大量的苷類化合物，可發(fā)揮降血糖作用[3]。本試驗采用STZ為誘導劑構建T2DM小鼠模型，研究ASGE對糖代謝的作用及其分子調節(jié)機制。試驗發(fā)現(xiàn)，模型小鼠在高脂飲食和STZ誘導下出現(xiàn)T2DM的典型病癥，血糖顯著升高，葡萄糖耐受能力下降，血清INS代償性分泌過多，發(fā)生以高胰島素血癥為重要標志[17]的胰島素抵抗。而ASGE可有效降低T2DM小鼠血糖，提高葡萄糖耐受能力，說明ASGE可以控制T2DM小鼠血糖異常，緩解胰島素抵抗，提高肝細胞的胰島素敏感性。同時，ASGE可調節(jié)INS分泌，降低T2DM小鼠血清INS，說明ASGE可在一定程度上恢復糖尿病小鼠受損的胰島β細胞。糖代謝紊亂是糖尿病重要病理基礎，肝臟是調控糖代謝的主要器官，為進一步探索ASGE調控糖代謝的機制，本試驗選擇肝組織作為研究對象。ASGE可減少高脂高糖代謝條件下肝細胞的脂肪堆積，維持糖尿病小鼠正常肝組織結構。肝內還含有多種糖代謝相關酶類，可體現(xiàn)肝功能狀態(tài)，在糖尿病發(fā)病過程中起重要作用[18]。通過測定肝中多種關鍵酶的活性發(fā)現(xiàn)，T2DM小鼠糖酵解、三羧酸循環(huán)及糖原合成的關鍵酶HK、PFK、CS、GS的活性被顯著抑制，糖異生關鍵酶PEPCK活性顯著升高，而ASGE可提高HK、PFK、CS、GS的活性，降低PEPCK活性。說明ASGE可有效恢復糖尿病小鼠肝功能，促進糖的分解代謝及肝糖原的合成，減弱糖異生，在降低血糖過程中發(fā)揮明顯作用。另一方面，PI3K/Akt信號轉導通路是INS對糖代謝調節(jié)的主要通路之一[19]，信號轉導過程中IRS(主要為IRS-1和IRS-2)作為INS與IR結合后的重要樞紐蛋白，發(fā)揮偶聯(lián)作用[20]。其下游與肝細胞糖代謝關系最為密切的蛋白FoxO1在糖尿病發(fā)生過程中磷酸化水平升高，并能夠刺激糖異生關鍵酶PEPCK表達從而激活糖異生[21]。肝細胞膜表面GLUT-2是PI3K/Akt信號轉導通路調節(jié)糖代謝最重要的效應蛋白之一，參與肝細胞對葡萄糖攝取[22]。通過測定肝PI3K/Akt信號轉導通路相關基因和蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠肝IRS-1、IRS-2基因和IR基因mRNA表達顯著降低，PI3K、Akt蛋白磷酸化水平降低，F(xiàn)oxO1蛋白磷酸化水平升高，GLUT-2蛋白表達顯著降低，而ASGE可有效恢復蛋白的磷酸化水平和表達水平，使其趨于正常。說明ASGE在轉錄水平即可有效調控IR基因mRNA表達量，進而增加蛋白表達，促發(fā)受體自身磷酸化，進而引起IRS的酪氨酸磷酸化，活化PI3K激活Akt，調控下游蛋白FoxO1和效應蛋白GLUT-2。各項試驗指標綜合分析，說明ASGE可促進IR基因和IRS基因的轉錄，上調IR蛋白和IRS蛋白表達，激活PI3K/Akt信號轉導通路并活化FoxO1蛋白，促進效應蛋白GLUT-2在肝細胞膜上的表達和轉位，提高肝細胞對葡萄糖的攝取，同時調節(jié)糖代謝相關酶類的活性，促進糖原合成并抑制糖異生，多方面協(xié)調控制減少葡萄糖合成，最終起到降低血糖，恢復葡萄糖耐受能力，改善胰島素抵抗的作用。

綜上所述，本試驗證實了ASGE具有降低T2DM小鼠血糖和血清INS濃度的作用，可緩解胰島素抵抗，提高葡萄糖耐受能力，達到了改善病情的治療效果。初步揭示ASGE通過激活胰島素效應信號傳導的主要途徑PI3K/AKT信號通路調控T2DM小鼠糖代謝的作用機制，豐富了刺五加苷類化合物治療糖尿病的試驗依據，為傳統(tǒng)中藥刺五加在防治糖尿病方面的開發(fā)和利用提供理論基礎。