劉海霞 ， 鄔雨倩 ， 詹澤強(qiáng) ， 黃雪歡 ， 瞿孝云 ， 馬葉本 ， 葉存棟 ， 廖 明 ， 張建民

(1.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)林學(xué)院 ， 廣東 廣州 511365 ； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 人獸共患病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 廣東 廣州 510642)

沙門(mén)菌(Salmonella)是一種寄生在腸道的革蘭陰性菌，在國(guó)內(nèi)是引起細(xì)菌性食源性疾病的主要病原菌。據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)數(shù)據(jù)顯示，沙門(mén)菌每年造成美國(guó)大約120萬(wàn)人感染患病，超過(guò)400人死亡[1]。在我國(guó)每年大概有3億人因沙門(mén)菌感染而患病，占我國(guó)病原菌型食源性疾病總數(shù)的70%～80%[2]。腸炎和鼠傷寒沙門(mén)菌是造成人源感染和食品污染的沙門(mén)菌中的優(yōu)勢(shì)血清型[3]?？仆呃股抽T(mén)菌(Salmonellacorvallis)在過(guò)去比較少見(jiàn)，但近幾年逐漸成為優(yōu)勢(shì)血清型之一。2016年，廖興廣等[4]發(fā)現(xiàn)科瓦利斯血清型在河南省市售生禽肉中成為優(yōu)勢(shì)菌型。2018年，Zhang等[5]對(duì)廣東省農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉中的沙門(mén)菌分離鑒定的檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，雞肉中共鑒定出27種血清型，其中科瓦利斯血清型排名第二。門(mén)診腹瀉病例監(jiān)測(cè)中，科瓦利斯沙門(mén)菌感染比例逐年上升[6]。禽類(lèi)在養(yǎng)殖過(guò)程中，由于自身特點(diǎn)極易受到沙門(mén)菌的感染，所以禽類(lèi)成為沙門(mén)菌食源性疾病的重要傳染源[7]。廣州市作為雞肉的消費(fèi)和生產(chǎn)大市，雞肉產(chǎn)品的供應(yīng)和安全性直接關(guān)系到人民群眾的健康和社會(huì)穩(wěn)定。但目前，有關(guān)雞肉中科瓦利斯沙門(mén)菌的相關(guān)報(bào)道較少，缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)和信息。

因此，本試驗(yàn)通過(guò)藥敏試驗(yàn)、耐藥基因攜帶情況及脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)分子分型等試驗(yàn)方法，探究廣州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)所售的雞肉中科瓦利斯沙門(mén)菌的分子流行病學(xué)特征，為雞肉中科瓦利斯沙門(mén)菌的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 21株科瓦利斯沙門(mén)菌分離于2016年5—7月廣州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的現(xiàn)屠宰生鮮雞檔口樣品。大腸埃希菌質(zhì)控菌株ATCC25922和標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 藥敏紙片，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；木糖賴(lài)氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、緩沖蛋白胨水(BPW)和氯化鎂-孔雀綠(RVS)增菌液，均購(gòu)自美國(guó)Becton公司；MH瓊脂、LB瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沙門(mén)菌屬診斷血清，購(gòu)自S&A公司；PFGE專(zhuān)用瓊脂糖(SeaKem gold agarose)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；細(xì)胞裂解緩沖液(Cell lysis buffer,CLB)、細(xì)胞懸浮緩沖液(Cell suspension buffer, CSB)、0.5×TBE電泳緩沖液、TE緩沖液、蛋白酶K緩沖液、Gelred染色液、蛋白酶K、限制性內(nèi)切酶XbaI、DNA marker DL1 000、rTaqDNA聚合酶(PremixTaq)，均購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂稀釋法測(cè)定科瓦利斯沙門(mén)菌的藥物敏感性 采用瓊脂稀釋法對(duì)21株科瓦利斯沙門(mén)菌進(jìn)行14種臨床常用抗菌藥的藥物敏感性試驗(yàn)，藥敏測(cè)定過(guò)程中的質(zhì)控菌株選擇由實(shí)驗(yàn)室保存的大腸埃希菌ATCC25922，測(cè)定最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)值，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.2.2 多重耐藥科瓦利斯沙門(mén)菌耐藥基因的PCR檢測(cè) 制備DNA模板，對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性7 min，94 ℃變性60 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s。擴(kuò)增后產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，將 PCR結(jié)果送往廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定突變點(diǎn)和突變種類(lèi)。具體信息參照表1、表2，引物合成參照文獻(xiàn)[9]。

表1 喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)(QRDR)基因的PCR擴(kuò)增序列Table 1 PCR amplification sequences of quinolone resistantce determination zone (QRDR) genes

表2 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥(PMQR)基因的PCR檢測(cè)序列Table 2 PCR detection sequences of plasmid mediated quinolone resistant (PMQR) genes

1.2.3 PFGE分子分型 PFGE標(biāo)準(zhǔn)化分型方法參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行,沙門(mén)菌地方菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812(Marker)的分型檢測(cè)步驟包括“制樣、包埋、裂解、洗滌、酶切、加樣、電泳、染色、讀膠”。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)藥敏試驗(yàn)的判定結(jié)果可知：21株 科瓦利斯沙門(mén)菌對(duì)磺胺異噁唑(95.2%)耐藥率最高，其次為萘啶酸(90.5%),然后依次為四環(huán)素(66.7%)、氟苯尼考(61.9%)、氯霉素(52.4%)、鏈霉素(28.6%)、環(huán)丙沙星(19.0%)、氨芐西林(9.5%)，對(duì)頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、多黏菌素B完全敏感，對(duì)亞胺培南的敏感性為90.5%，見(jiàn)表3。

表3 21株科瓦利斯沙門(mén)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of drug susceptibility test of 21 Salmonella corvallis (%)

2.2 科瓦利斯沙門(mén)菌的多重耐藥情況 基于21株科瓦利斯沙門(mén)菌的藥敏結(jié)果得出多重耐藥情況，通過(guò)計(jì)算得到21株科瓦利斯沙門(mén)菌中多重耐藥菌檢出率為81%(耐3類(lèi)及其以上的抗菌藥)，6株(28.6%)可抗1～3種抗菌藥，15株(71.4%)可抗4～7種抗菌藥。耐藥種數(shù)最多有7種，耐藥譜為SUL+NA+FFC+C+TE+STR最多(28.6%)，其次是SUL+NA+FFC+C(14.3%)、SUL+NA+FFC+TE (9.5%)、SUL+NA+CIP+TE(9.5%)、AMP+SUL+NA+CIP+FFC+C+TE(4.8%)，見(jiàn)表4。

表4 21株科瓦利斯沙門(mén)菌多重耐藥情況Table 4 Multidrug resistance of 21 strains of Salmonella corvallis

2.3 喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)(QRDR)與質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥(PMQR)基因的測(cè)定 21株科瓦利斯沙門(mén)菌都存在parC突變，第57位氨基酸蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸(Thr57→Ser)，并且在質(zhì)粒中檢出了qnrS、aac(6′)-Ib-cr和qnrB，檢出率分別為90.5%、23.8%和9.5%，見(jiàn)表6。分析存在QRDRparC單突變同時(shí)攜帶PMQR對(duì)環(huán)丙沙星和萘啶酸耐藥性影響，結(jié)果顯示，所有parC氨基酸突變菌株中，不攜帶PMQR和攜帶2個(gè)PMQR的菌株對(duì)CIP不存在耐藥性，攜帶1個(gè) 和3個(gè)PMQR的CIP耐藥菌株分別占75%和25%。不攜帶PMQR的菌株對(duì)NAL不存在耐藥性，攜帶PMQR的菌株對(duì)NAL都耐藥。見(jiàn)表5。

表5 21株科瓦利斯沙門(mén)菌耐藥情況與基因檢測(cè)情況Table 5 Drug resistance and gene testing of 21 strains of Salmonella corvallis

2.4 多重耐藥科瓦利斯沙門(mén)菌PFGE分型 21株科瓦利斯沙門(mén)菌經(jīng)PFGE分型后,結(jié)果顯示其可分為7個(gè)血清型，5個(gè)基因簇分別是C簇、D簇、E簇、F簇和G簇，分別包含菌株數(shù)為2株、11株、2株、2株 和2株。C簇2株菌含有1個(gè)基因型，D簇11株菌含有6個(gè)基因型，E簇2株菌含有2個(gè)基因型，F(xiàn)簇 2株菌含有2個(gè)基因型，G簇2株菌含有2個(gè)基因型。2個(gè)單一的基因型分別是A型和B型，僅包含了1株菌(圖1)。在基因簇中優(yōu)勢(shì)基因簇是D簇。 試驗(yàn)結(jié)果顯示，編號(hào)為25、257和37這3個(gè)菌株分別來(lái)自廣州市白云區(qū)、越秀區(qū)和海珠區(qū)3個(gè)不同區(qū)域，但同源性100%。

圖1 科瓦利斯沙門(mén)菌PFGE分型結(jié)果Fig.1 The result of Salmonella corvallis PFGE typing

3 討論

沙門(mén)菌廣泛存在于動(dòng)物體本身、動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境和動(dòng)物性食品中，在國(guó)內(nèi)是引起細(xì)菌性食源性疾病的主要病原菌。我國(guó)70%～80%的細(xì)菌性食物中毒是由沙門(mén)菌引起的[10]?？仆呃惯@個(gè)血清型在過(guò)去比較少見(jiàn)，在國(guó)外，Dickinson最早于1949年從感染腸炎的家禽的盲腸內(nèi)容物中分離出科瓦利斯沙門(mén)菌[11]；在國(guó)內(nèi)，2012年劉杰等[12]首次在肉雞養(yǎng)殖和屠宰加工環(huán)節(jié)分離到該型菌株。但是近幾年科瓦利斯逐漸成為優(yōu)勢(shì)血清型[4]，因此需要加強(qiáng)對(duì)流行菌株的監(jiān)測(cè)。通過(guò)對(duì)21株科瓦利斯沙門(mén)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)藥物耐藥嚴(yán)重，這與國(guó)內(nèi)外有關(guān)報(bào)道基本一致[13-14]，由此推測(cè)可能在長(zhǎng)期的畜禽養(yǎng)殖中，這些傳統(tǒng)抗菌藥物長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛應(yīng)用和不規(guī)范的用藥方法有密切關(guān)系。喹諾酮類(lèi)作為目前臨床上治療沙門(mén)菌感染的一線藥物[15]，具有較好的治療效果，可本試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株中已出現(xiàn)對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥菌株，對(duì)環(huán)丙沙星、萘啶酸的耐藥率分別為19%和90.5%。但分離株對(duì)頭孢類(lèi)、多黏菌素B和亞胺培南都不耐藥，與以往的研究報(bào)告結(jié)果相一致[16]。本次試驗(yàn)的菌株多重耐藥菌檢出率達(dá)81%，耐藥譜型繁多，多重耐藥株的主要耐藥表型為SUL+NA+FFC+C+TE+STR。結(jié)果表明，廣州地區(qū)肉雞沙門(mén)菌耐藥情況比較嚴(yán)重，提示在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中要科學(xué)合理地使用抗菌藥物。

沙門(mén)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性主要與其細(xì)胞中喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)(QRDR)的parC和gyrA基因突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥(PMQR)基因有關(guān)[9]。本試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)QRDR基因的檢測(cè)，所有的菌株在parC基因上都發(fā)生了第57位氨基酸蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸(Thr57→Ser)，QRDR突變結(jié)果與菌株對(duì)萘啶酸的耐藥率均為90.5%，結(jié)果具有一致性。有研究表明，基因parC的QRDR中的點(diǎn)突變可以減少對(duì)喹諾酮類(lèi)的易感性[17-18]。PMQR被認(rèn)為可通過(guò)外排泵等機(jī)制介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥[19]，試驗(yàn)中攜帶PMQR基因[qnrS、aac(6′)-Ib-cr、qnrB]的菌株對(duì)NAL都耐藥。以上結(jié)果表明，QRDRparC單突變菌株攜帶PMQR基因與沙門(mén)菌對(duì)萘啶酸耐藥之間存在一定的聯(lián)系，PMQR基因可增強(qiáng)菌株對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性。

目前PFGE是國(guó)內(nèi)外常用的分子分型及溯源技術(shù)，本試驗(yàn)的21株科瓦利斯沙門(mén)菌PFGE分子分型分為7個(gè)血清型，呈現(xiàn)遺傳多樣性。超過(guò)一半的菌株分布在D簇，說(shuō)明D簇是1個(gè)優(yōu)勢(shì)基因簇，D簇菌株25、257、37來(lái)源于同一采樣市不同采樣點(diǎn)，但帶型相似度卻達(dá)到了100%，提示肉雞間可能存在共同來(lái)源或者交叉污染，若存在共同來(lái)源，本次試驗(yàn)的樣本可能來(lái)源于同一養(yǎng)殖場(chǎng)；若存在交叉污染，則需要加強(qiáng)衛(wèi)生管理和污染監(jiān)測(cè)，降低食源致病菌污染，減少食源性致病菌的發(fā)生。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，廣州市各大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)肉雞中科瓦利斯沙門(mén)菌高耐藥性，多重耐藥嚴(yán)重，喹諾酮耐藥決定區(qū)基因(QRDR)普遍存在parC突變，PFGE 分子型別呈多態(tài)性,有同源菌株的存在,提示存在共同來(lái)源或者交叉污染，提示為降低沙門(mén)菌引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加強(qiáng)市場(chǎng)衛(wèi)生管理以及重視養(yǎng)殖場(chǎng)沙門(mén)菌的凈化工作。