李禮斌，魏旻俊，李洪玉，余 平

(浙江省立同德醫(yī)院·浙江 杭州 310012)

我國幅員遼闊、自然環(huán)境復雜、條件優(yōu)越，分布著極其豐富的中藥材資源，而中藥材往往會因為地域、氣候、水質(zhì)及栽培方式等差異，藥效有所不同，對于疾病的治療效果存在差異[1-2]。野生中藥材資源的銳減促進了中藥材人工種植業(yè)的快速發(fā)展，然而只有在道地產(chǎn)區(qū)種植的中藥材，藥用活性成分含量才較高，藥用效果好[3]。

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDielset Gilg)，又名石猴子、金絲吊葫蘆、雷膽子等，具有清熱解毒、活血止痛、祛風化痰等功效，常用于治療高熱驚厥、肺炎、肝炎、風濕、瘰疬、癰疔瘡癤、月經(jīng)不調(diào)等；隨著其良好抗腫瘤效果的發(fā)現(xiàn)，三葉青被廣泛地應(yīng)用于各種腫瘤的臨床治療，同時，體內(nèi)外腫瘤抑制實驗研究發(fā)現(xiàn)其對于各種腫瘤細胞或組織具有良好的抑制效果[4-5]。三葉青主要分布于我國長江以南地區(qū)，如浙江、江西、福建、廣西、湖南、湖北及云南等省份[6]。同樣，受產(chǎn)地、種質(zhì)、氣候及種植條件等因素影響，三葉青在植物學特征特性、地下塊莖產(chǎn)量以及有效活性成分含量存在顯著差異[7-8]。浙江和廣西是我國三葉青兩大主要產(chǎn)區(qū)，兩區(qū)域所產(chǎn)三葉青在市面及臨床上應(yīng)用較廣；同樣，兩產(chǎn)地三葉青因較遠的物理距離導致其在生物學性狀及藥效方面存在較大差異[9-10]。本研究對浙江與廣西兩產(chǎn)地三葉青水提物進行抗肺癌效果的對比分析，為三葉青質(zhì)量標準制定、道地藥材標定及臨床合理應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 實驗藥物 浙江產(chǎn)三葉青2018 年12 月采自浙江臺州溫嶺市；廣西產(chǎn)三葉青 2018 年12 月采自廣西河池天峨縣；由浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心李洪玉研究員鑒定為葡萄科崖爬藤屬Tetrastigmahemsleyanum三葉青的塊莖。新鮮三葉青塊莖洗凈后晾干，切片后于55 ℃ 下烘干備用。水煎液制備：取上述兩產(chǎn)地三葉青切片各200 g，置于 10 倍量水(2 000 mL)浸泡30 min 后，武火煮沸后文火煎煮 1.5 h，共煎煮 2 次，合并兩次煎液，紗布過濾后，濾液在水浴鍋上濃縮至 400 mL，使成為0.5 g生藥/mL濃度，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞株及動物 人肺腺癌細胞株 A549：購自中國醫(yī)學科學院上海細胞庫。SPF級BALB/c裸鼠，雄性，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自上海斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號為SCXK(滬)2017-0005。以裸鼠專用飼料、滅菌水，于25 ℃室溫條件下喂養(yǎng)，自由取食飲水，1 周后取用。

1.3 實驗試劑及儀器 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白抗體：艾博抗上海貿(mào)易有限公司；PBS、DAB、蘇木精、多聚甲醛：武漢博士德生物工程有限公司。SQP 十萬分之一電子分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；游標卡尺：上海永準電子科技有限公司；BX63 熒光顯微鏡：日本Olympus公司；RM2235石蠟切片機：德國萊卡儀器有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備與分組給藥 取對數(shù)生長期A549 細胞，以PBS 液調(diào)節(jié)成濃度為2×107/mL 的單細胞懸液，35只小鼠按每只0.2 mL接種于裸鼠前肢右腋下，構(gòu)建 A549小鼠腫瘤移植瘤模型。小鼠接種2 周待腫瘤生長至 60～140 mm3后，取成模的 30 只裸鼠隨機分為5 組：模型對照組、10 g/L 浙江產(chǎn)三葉青水煎液組、50 g/L浙江產(chǎn)三葉青水煎液組、10 g/L廣西產(chǎn)三葉青水煎液組、50 g/L廣西產(chǎn)三葉青水煎液組，每組6只。各組每日灌胃 1 次，對照組給予同實驗組等體積的生理鹽水，各組每隔2 d稱量體質(zhì)量1 次并進行記錄。給藥期間密切關(guān)注小鼠體質(zhì)量、活動能力及攝食飲水等情況；連續(xù)給藥1 周。

2.2 觀察指標及檢測方法

2.2.1 移植瘤體積、瘤重及抑瘤率 給藥1 周后，頸椎脫臼處死小鼠，小心剝離瘤體，稱重、測量體積并拍照，計算腫瘤平均瘤重量、平均瘤體積及抑瘤率。

抑瘤率=(對照組瘤體體積-實驗組瘤體體積)/對照組瘤體體積×100%

抑瘤率=(對照組瘤體重量-實驗組瘤體重量)/對照組瘤體重量×100%

2.2.2 TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡 將腫瘤組織用 4% 多聚甲醛固定，制成切片后，采用 TUNEL 法檢測A549 肺癌裸鼠皮下移植瘤內(nèi)細胞凋亡情況。經(jīng)顯色、復染、脫水、透明與封片后于熒光顯微鏡下觀察，以細胞核中出現(xiàn)綠色熒光顆粒者為陽性，即為凋亡的細胞。每張切片至少觀察 5 個以上高倍視野，每個視野在熒光顯微鏡下用 520 nm 波長拍照1 次，使用 Image-Pro Plus 6.0 進行熒光分析。計數(shù)500 個以上完整癌細胞，計算每 100 個癌細胞內(nèi)陽性細胞數(shù)，即為凋亡指數(shù)(apoptopic index，AI)，即凋亡細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比。

2.2.3 免疫組化檢測瘤組織Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達 PBS 作為漂洗液，Bcl-2、Bax、Caspase3和 Caspase9 一抗工作濃度分別為1∶150、1∶150、1∶100和1∶100。一抗孵育 4 ℃ 過夜，鏡下控制染色，DAB 顯色，蘇木精復染。判斷標準以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，無染色反應(yīng)者為陰性。使用 Image-Pro Plus 6.0軟件以陽性細胞所占百分率和顯色強度為標準，計算蛋白的陽性率。

3 結(jié)果

3.1 兩產(chǎn)地三葉青水煎液對A549 肺癌裸鼠移植瘤生長抑制效果比較 結(jié)果見表1。

表1 各組裸鼠抑瘤效果比較

3.2 兩產(chǎn)地三葉青水煎液對肺癌 A549 裸鼠移植瘤體內(nèi)腫瘤細胞凋亡的影響 結(jié)果見表2。

表2 各組裸鼠肺癌 A549 移植瘤體內(nèi)腫瘤 細胞凋亡的比較

3.3 兩產(chǎn)地三葉青水煎液對 A549 肺癌裸鼠移植瘤Bax、Bcl-2、Caspase-3 和 Caspase-9 蛋白表達的影響 見圖1，表3。

圖1 各組裸鼠A549 肺癌移植瘤組織Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達的免疫組化檢測(×200)

表3 各組裸鼠A549 肺癌移植瘤Bax、Bcl-2、Caspase-3 和 Caspase-9 蛋白表達的比較

4 討論

三葉青以其優(yōu)良的清熱解毒、消腫止痛、化痰等特性，常用于癌癥、結(jié)節(jié)、各類炎癥、肝病等疾病的治療，同時還具有增強人體免疫力的功效[11]。就藥效與品質(zhì)而言，很多報道以浙江所產(chǎn)三葉青為最佳，但相關(guān)報道缺少足夠的實際臨床療效對比及有效研究數(shù)據(jù)支撐。本研究通過三葉青水煎液處理A549肺癌移植瘤裸鼠的方法于體內(nèi)就浙江產(chǎn)三葉青與廣西產(chǎn)三葉青肺癌抑制效果進行了對比研究。研究結(jié)果可見：兩產(chǎn)地三葉青水煎液對小鼠A549 肺癌移植瘤均有增長抑制作用且呈現(xiàn)劑量依賴性；但浙江產(chǎn)三葉青水煎液對肺癌腫瘤組織增長抑制效果顯著，抑制作用優(yōu)于廣西產(chǎn)三葉青水煎液。誘導腫瘤組織細胞凋亡實驗結(jié)果顯示：三葉青水煎液腫瘤抑制作用與其誘導腫瘤細胞凋亡的作用存在密切關(guān)系，且浙江產(chǎn)三葉青水煎液誘導腫瘤細胞凋亡效果顯著，細胞凋亡誘導作用優(yōu)于廣西產(chǎn)三葉青水煎液?？鼓[瘤藥物誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的機制與其上調(diào)促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9表達及下調(diào)抑制凋亡因子 Bcl-2存在密切關(guān)系；Bcl-2與Bax是 Bcl-2 家族中最具代表性的抑制凋亡和促進凋亡基因，Bcl-2/Bax 比值對決定細胞是否進入凋亡狀態(tài)具有重要的意義，而Caspase-3、Caspase-9是Caspase家族中引起凋亡的關(guān)鍵成分[12-13]。本研究結(jié)果顯示浙江產(chǎn)三葉青水煎液誘導腫瘤組織細胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax上調(diào)表達及Bcl-2下調(diào)效果要顯著優(yōu)于廣西產(chǎn)三葉青水煎液，這是浙江產(chǎn)三葉青水煎液具有顯著誘導腫瘤細胞凋亡效果的重要原因之一。

綜上所述，浙江產(chǎn)三葉青水煎液在肺癌腫瘤組織生長抑制、細胞凋亡誘導效果方面要顯著優(yōu)于廣西產(chǎn)三葉青水煎液；因此，在臨床三葉青組方使用時，應(yīng)當明確其產(chǎn)地來源而確定用藥量才能達到更好地治療效果。