劉 麗，俞海龍,李雅萍，王 靜，劉文婕,王欣欣， 李 成，張藝村

慢性牙周炎通過(guò)藥物等其他刺激因素干預(yù)體外分離培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞,來(lái)達(dá)到牙周組織再生、重建已成為牙周炎治療的研究熱點(diǎn)[1]。目前臨床用于控制牙周炎的藥物主要為抗生素類的化學(xué)制劑，中藥制劑應(yīng)用較少[2]。傳統(tǒng)的藥物提取、分離純化繁瑣低效，而細(xì)胞膜色譜法(CMC)作為一種新興的生物親和色譜法，不需要預(yù)先對(duì)樣品進(jìn)行分離和純化，能夠在特定的活性細(xì)胞膜篩選模型上直接確定與膜受體發(fā)生結(jié)合的中藥某種活性部位，從而達(dá)到快速、高效、準(zhǔn)確的篩選[3]。本實(shí)驗(yàn)以辛伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)該方法進(jìn)行篩選測(cè)試分析，并考察其適用性，從而篩選6種中藥與牙周膜細(xì)胞能結(jié)合的活性成分，為后期治療慢性牙周炎局部凝膠制劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：CO2培養(yǎng)箱(BB16)(德國(guó)Heraeus)，倒置相差顯微鏡(日本Nikon)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海安信光學(xué)儀器制造有限公司)，JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，細(xì)胞膜色譜柱芯組件(10 mm柱長(zhǎng)，2 mm內(nèi)徑，0.22 μm篩板孔徑)(深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司)，RPL-ZD10型裝柱機(jī)(大連日普利科技儀器有限公司)，VICI AG10G-0911V10 通切換閥(美國(guó)Valco儀器公司)，Concentrator真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)eppendorf公司)，Shim-pack VP-ODS液相色譜柱預(yù)柱(10 mm柱長(zhǎng)，1 mm內(nèi)徑，5 μm粒徑，C18鍵合硅膠固定相)(日本Shimzdzu公司)，LC-MS-2010EV高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀系統(tǒng)(包括2部 LC-20 液相色譜泵，1部DGU-20A3在線脫氣機(jī)，1部SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，1部CTO-20A色譜柱溫箱，1根Shim-pack VP-ODS高效液相色譜柱，1部 SPD-20A UV檢測(cè)器，1部SPD-M20A DAD檢測(cè)器，1部LC-MS-2010EV質(zhì)譜儀及LC-MS Solution色譜工作站)(日本Shimzdzu公司)。本研究細(xì)胞培養(yǎng)部分在西安交通大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究中心完成，細(xì)胞膜色譜部分在西安交通大學(xué)國(guó)家藥學(xué)重點(diǎn)研究中心完成。

1.2 試藥：苦豆子、甘草、三七、丹參、續(xù)斷、杜仲均購(gòu)自國(guó)大藥房(均經(jīng)鑒定為原藥)；試藥辛伐他汀(SIM)對(duì)照品(中國(guó)北京藥品生物制品檢驗(yàn)所，純度≥98%)；胎牛血清、培養(yǎng)基DMEM、胰蛋白酶(GIBCO，美國(guó))；乙腈，甲醇為色譜純(Fisher，美國(guó))；ZEX-Ⅱ大孔硅膠(青島美高貿(mào)易有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物制備：苦豆子、甘草、三七、丹參、續(xù)斷、杜仲粉末各10 g，用40 mL的甲醇-水(70∶30，v/v)溶液超聲提取30 min×3次，取上清液真空干燥；色譜甲醇復(fù)溶得到苦豆子、甘草、三七、丹參、續(xù)斷、杜仲的甲醇總提取物，2 mL去離子水使其完全溶解；再依次加入極性不同的有機(jī)溶劑(石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯)各10mL，超聲萃取30min×3次，分別收集6種部位的提取液，干燥后甲醇復(fù)溶、過(guò)濾。

1.3.2 hPDLC/CMC色譜柱制備：將門診正畸拔除牙周膜消化培養(yǎng)原代的人牙周膜細(xì)胞(hPDLC)傳至4～8代，用10 mL Tris-HCl低滲液制備成細(xì)胞膜懸液5 mL，動(dòng)態(tài)加入裝有活化硅膠載體的支口試管；次日將混合液洗滌收集沉淀加入10 mL去離子水，渦旋震蕩混勻，即得hPDLC/CMC固定相懸液，濕法裝入細(xì)胞膜色譜柱芯柱套中即得hPDLC/CMC色譜柱，連接至色譜系統(tǒng)中使用。

1.3.3 陽(yáng)性藥物SIM對(duì)hPDLC/CMC的測(cè)試分析及適用性考察：將一根hPDLSC/CMC色譜柱充分平衡后，連續(xù)進(jìn)樣 5 μl 0.2 mg/mL 的 SIM 3次，以保留時(shí)間為指標(biāo)來(lái)考察色譜柱的內(nèi)差異性；此外按照相同方法制備 3根hPDLSC/CMC 色譜柱，同時(shí)將 3根色譜柱置于液相色譜內(nèi)，在相同條件下分別進(jìn)樣 5 μl 0.2 mg/mL SIM，以每根色譜柱上的保留時(shí)間峰面積為指標(biāo)，考察柱間差異性。利用3次富集組分的峰面積得出富集后的平均峰面積來(lái)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值)，要求符合定性實(shí)驗(yàn)RSD<5%。

1.3.4 苦豆子、甘草、三七、丹參、續(xù)斷、杜仲提取物中活性成分的篩選：為了驗(yàn)證hPDLSC/CMC膜表面受體特異性結(jié)合的藥物某特定成分具有分離保留活性，實(shí)驗(yàn)比較了在相同長(zhǎng)度的純硅膠色譜柱和hPDLSC/CMC色譜柱上SIM及各藥物活性部位色譜峰的保留位置、峰形及活性持續(xù)時(shí)間，將能夠在hPDLC/CMC上產(chǎn)生良好保留峰形的提取物稱為其活性部位。操作如下：將hPDLC/CMC色譜柱連接入液相色譜系統(tǒng)中，按照選定的色譜條件：流動(dòng)相(去離子水、5 mmol/L磷酸鹽緩沖液)，柱溫37.0 ℃，流速0.2 mL/min，用流動(dòng)相平衡23 h待基線平穩(wěn)后，吸取苦豆子、甘草、三七、丹參、續(xù)斷、杜仲各部位的提取液5 μl注入色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析測(cè)定:SIM定容至0.2 mg/mL，(檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm)；苦豆子(檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm)、甘草(檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm)、三七(檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm)、丹參(檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm)、續(xù)斷(檢測(cè)波長(zhǎng)：212 nm)、杜仲(檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm)各提取物定容至1 mg/mL，并采用UV檢測(cè)器記錄CMC色譜圖。

2 結(jié)果

辛伐他汀在hPDLSC/CMC 色譜柱的10 min 左右，有明顯的保留色譜峰出現(xiàn)(圖1，目錄后)，而在純硅膠色譜柱上并無(wú)任何保留(圖2，目錄后)，色譜柱內(nèi)及柱間RSD值均<5%，見表1。

表1 hPDLC/CMC柱的柱內(nèi)柱間保留時(shí)間(min)

通過(guò)對(duì)辛伐他汀系統(tǒng)適用性考察內(nèi)容的分析，說(shuō)明hPDLC/CMC色譜柱具有很好的分離活性，其柱內(nèi)及柱間重現(xiàn)性良好，而且活性保留時(shí)間也能夠滿足定性鑒別試驗(yàn)的要求，可以用于從中藥復(fù)雜體系中篩選活性化合物?？喽棺?圖3，目錄后)，甘草(圖4，目錄后)，杜仲(圖5，目錄后)檢測(cè)無(wú)保留色譜峰；三七(圖6，目錄后)，丹參(圖7，目錄后)，續(xù)斷(圖8，目錄后)的主要成分分別進(jìn)樣檢測(cè)均產(chǎn)生良好保留峰形。

3 討論

通過(guò)對(duì)辛伐他汀適用性考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明hPDLC/CMC色譜柱具有很好的分離及保留活性，SIM在hPDLSC/CMC 有保留是因?yàn)楣枘z表面包覆的hPDLSC 膜受體和SIM之間的特異性結(jié)合作用所導(dǎo)致，而純硅膠柱上則沒有這種特異性結(jié)合。色譜柱由于其受體活性存在而對(duì)藥物具有一定的分離活性。本研究結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)差異性較小，重現(xiàn)性良好，能夠滿足定性鑒別試驗(yàn)的要求，可以用于從中藥復(fù)雜體系中篩選活性化合物。本研究通過(guò)HPLC-CMC實(shí)驗(yàn)方法，從苦豆子、甘草、三七、丹參、續(xù)斷、杜仲6種中藥材中有效篩選出了三七、丹參、續(xù)斷3種藥物某活性成分，可以與人牙周細(xì)胞膜受體有特異性結(jié)合。

苦豆子有清熱解毒、燥濕、止痛的作用，苦豆子生物堿對(duì)炎癥早期的滲出和水腫有明顯抗炎作用[4]。甘草有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值，如增強(qiáng)免疫、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗纖維化等諸多作用[5]。甘草次酸可能阻止前列腺素等物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，降低活性因子反應(yīng)性，而發(fā)揮抗炎、抗菌作用[6]。川續(xù)斷作為一種補(bǔ)藥、止痛劑和抗炎藥，常被用于腰痛、膝痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、顱內(nèi)血腫、先兆性流產(chǎn)和骨折等疾病的治療[7]。有研究表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可以顯著增加MC3T3-E1和小鼠原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖、分化，明顯增加了成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟[8]。杜仲具有補(bǔ)肝強(qiáng)腎、強(qiáng)筋健骨，能抑制多種細(xì)菌和病毒；另外，杜仲具有雙重調(diào)節(jié)人體骨代謝平衡，從而促進(jìn)骨形成[9]。三七具有止血、散疲、消腫止痛功效，具有保護(hù)心肌細(xì)胞、降血脂、抗血栓、增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗纖維化、消除氧自由基等作用；三七總皂昔對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性模型有良好的抗炎作用，它能對(duì)抗前列環(huán)素的釋放，抑制巨噬細(xì)胞受到炎癥刺激和白介素的釋放[10]。丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰功效。有研究表明，丹參的脂溶性成分具有抑菌作用，丹參水溶性部位萃取物具有顯著抗炎作用[11]。丹參或可通過(guò)miRNA-155降低膿毒癥大鼠血清IL-6、IL-10水平,從而減輕膿毒癥的炎癥反應(yīng)[11]。

藥物靶標(biāo)的篩選是新藥研發(fā)的關(guān)鍵部分。本研究利用體外PDLSC/CMC二維在線聯(lián)用生物親和色譜分析方法，首次快速高效地篩選、分離出苦豆子、甘草、杜仲與牙周膜細(xì)胞色譜柱未形成保留色譜峰。結(jié)果說(shuō)明這3種藥物不能在人牙周膜細(xì)胞親和富集，不能在口腔局部更好保留而發(fā)揮藥理作用。而三七、丹參、續(xù)斷提取成分與牙周膜細(xì)胞色譜柱能形成保留色譜峰，說(shuō)明利用固定相包覆的牙周細(xì)胞膜表面特定活性膜受體與這3種藥物配體之間有“受體-配體”親和靶點(diǎn)。本研究為治療口腔牙周炎的中藥研發(fā)提供了新的理論基礎(chǔ)，我們可以根據(jù)這3種藥物與牙周膜結(jié)合的機(jī)理及是否發(fā)揮特異藥效進(jìn)一步研究，也為利用特異性受體高表達(dá)細(xì)胞膜色譜能夠特異地從中藥中識(shí)別目標(biāo)組分，從而為相關(guān)受體的藥物研究及特異性篩選用于治療疾病的中藥活性化合物提供新的思路和方法。