彭玥晗 ， 徐 磊 ， 許金蔓 ， 王 昊 ， 胡悅旻 ， 鞠輝明,2

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009 ； 2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009)

我國(guó)擁有豐富的地方豬種資源，近年來(lái)，在豬的肉質(zhì)性狀、生長(zhǎng)性狀、繁殖性狀等方面與全基因組選擇和全基因組關(guān)聯(lián)分析方面取得了很多研究成果[1]。豬肉的生產(chǎn)效率及豬肉品質(zhì)一直都是豬種選育的重點(diǎn)，在遺傳上解析不同類(lèi)型豬的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育差異，對(duì)豬種遺傳差異的深入研究具有重要的指導(dǎo)意義[2]。圍脂滴蛋白(Perilipin，PLIN)是最早由 Greenberg 等于小鼠的附睪脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)蛋白家族[3]，其中PLIN1定位于脂肪細(xì)胞脂滴表面，調(diào)節(jié)脂肪甘油三酯的儲(chǔ)存和水解[4]。越來(lái)越多研究表明，PLIN1基因?qū)∪馍L(zhǎng)發(fā)育、能量代謝及線(xiàn)粒體功能有調(diào)控作用。CRISPR/Cas9可以編輯多種基因功能，是目前實(shí)現(xiàn)基因突變效率最高的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括系統(tǒng)元件 sgRNA 和 Cas9 蛋白，利用該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)基因敲入、基因敲除、基因沉默以及各種目的基因的編輯[5-6]。本課題組前期在研究巴馬豬、大白豬肌肉發(fā)育差異的過(guò)程中，利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術(shù)比較出PLIN1蛋白在巴馬豬、大白豬肌肉組織蛋白中表達(dá)量差異顯著。本試驗(yàn)擬利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建豬PLIN1敲除載體，轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞，富集crispr-sgRNA靶向切割引起的PLIN1基因突變或者外源堿基序列插入的細(xì)胞群，為后續(xù)研究該基因功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 豬腎上皮細(xì)胞系(PK15 細(xì)胞系)、基因敲除載體pYSY-CMV-Cas9-U6-sgRNA-EF1a-Puromycin為本實(shí)驗(yàn)室保存。去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)megaBio-Tek公司(美國(guó))；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 Transfection Kit、胎牛血清及細(xì)胞培養(yǎng)試劑，均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó))；PLIN1抗體(NB100-60554)，購(gòu)自Novus Biologicals公司(美國(guó))；GAPDH抗體，購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司(美國(guó))。其他分子生物學(xué)試劑，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。序列合成及測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 基因與載體

1.2.1 載體選擇 CRISPR 基因敲除質(zhì)粒 pYSY-CMV-Cas9-U6-PLIN1-sgRNA-EF1a-Puromycin(簡(jiǎn)稱(chēng)PLIN1-KO質(zhì)粒，圖1)作為載體，在gRNA scafflod 位置加入目的 sgRNA 序列。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR驗(yàn)證并送往公司測(cè)序，構(gòu)建PLIN1敲除載體。

1.2.3 相關(guān)引物序列 本試驗(yàn)中涉及的PLIN1 DNA區(qū)域PCR檢測(cè)引物及mRNA定量檢測(cè)引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3PLIN1突變細(xì)胞群獲得 將豬PK15細(xì)胞分為4組，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體(簡(jiǎn)稱(chēng)CON組)，其余3組為處理組，分別轉(zhuǎn)染3種PLIN1-sgRNA，分別稱(chēng)為PLIN1-KO1、PLIN1-KO2組和PLIN1-KO3組。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后利用5 μg/mL的嘌呤霉素篩選2 h， 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)富集基因突變后的細(xì)胞群，分別提取DNA、RNA和蛋白用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4PLIN1基因突變效率檢測(cè) 提取各組細(xì)胞DNA 用PLIN1-KO引物(序列見(jiàn)表1)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后連接至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α后每組挑取50個(gè)菌落進(jìn)行序列測(cè)定。提取各組細(xì)胞總mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用 pPLIN1和pGAPDH引物(序列見(jiàn)表1)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)PLIN1表達(dá)水平。提取各組細(xì)胞群蛋白，用Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白表達(dá)差異，利用Analysis軟件測(cè)定雜交條帶的灰度值，PLIN1蛋白灰度值和相應(yīng)內(nèi)參條帶(GAPDH)的比值為各組PLIN1條帶的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，20 ℃ 15 s。具體試驗(yàn)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果

2.1PLIN1突變后DNA水平檢測(cè) 處理組細(xì)胞PCR 產(chǎn)物連接pGEM-T載體，通過(guò)計(jì)算各組突變或缺失樣本的比率計(jì)算各組DNA突變率，試驗(yàn)組PLIN1-KO1、PLIN1-KO2及PLIN1-KO3 DNA的突變率為8%、30%和18%，部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)封三彩版圖2。

圖2 細(xì)胞內(nèi)DNA測(cè)序結(jié)果Fig.2 DNA sequencing results in cellsA：PLIN1-KO1細(xì)胞組突變； B：PLIN1-KO2細(xì)胞組突變； C：PLIN1-KO3細(xì)胞組突變A:Mutation of PLIN1-KO1 cell group; B:Mutation of PLIN1-KO2 cell group; C:Mutation of PLIN1-KO3 cell group

2.2PLIN1基因突變后mRNA表達(dá)變化檢測(cè) 利用qRT-PCR測(cè)量各組mRNA 表達(dá)量，CON組PLIN1表達(dá)量為0.92±0.05，PLIN1-KO1、PLIN1-KO2、PLIN1-KO3組細(xì)胞中PLIN1表達(dá)量分別為0.31±0.07、0.20±0.01和0.66±0.04，處理組PLIN1表達(dá)分別比正常細(xì)胞下降66.30%、78.26%和28.26%。PLIN1-KO2組PLIN1表達(dá)水平顯著低于CON組及其他各組(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)量Fig.3 Intracellular mRNA expression

2.3PLIN1突變后各組細(xì)胞PLIN1蛋白的表達(dá) 利用Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞PLIN1蛋白表達(dá)，雜交條帶通過(guò)灰度分析，CON組相對(duì)表達(dá)量為基準(zhǔn)1.00，PLIN1-KO1、PLIN1-KO2和PLIN1-KO3三組蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.45±0.03、0.26±0.07和0.37±0.05。處理組PLIN1表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，和CON組相比，處理組蛋白表達(dá)量分別下降55.00%、74.00%和63.00%。其中PLIN1-KO2組表達(dá)量下降極顯著(P<0.01)。

圖4 細(xì)胞蛋白Western Blot檢測(cè)及灰度分析Fig.4 Western Blot detection and gray scale analysis of cell proteinA:Western Blot顯影圖； B：PLIN1灰度分析圖A：Developing figure of Western Blot; B：PLIN1 gray level analysis diagram

3 討論

PLIN1基因在豬肌肉中廣泛表達(dá)且能通過(guò)阻止脂肪酶水解甘油三酯的途徑抑制基礎(chǔ)脂解，進(jìn)而促進(jìn)脂滴的形成并能夠改變線(xiàn)粒體功能[8]，另外，PLIN1基因的表達(dá)水平和豬生長(zhǎng)、胴體及肉質(zhì)性狀顯著相關(guān)[9-10]。本課題小組在前期研究中，利用iTRAQ比較出PLIN1蛋白在巴馬豬、大白豬肌肉組織蛋白中表達(dá)量差異顯著，但PLIN1影響豬肉性狀及線(xiàn)粒體功能的具體機(jī)制尚未明晰，所以我們擬通過(guò)突變PLIN1基因表達(dá)來(lái)開(kāi)展相應(yīng)功能研究。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種能在多種動(dòng)植物中實(shí)現(xiàn)基因突變的高效的工具[11]，已有的研究表明切割位點(diǎn)設(shè)計(jì)在越靠前的外顯子導(dǎo)致移碼突變的概率越大[12]，所以本試驗(yàn)選擇在影響PLIN1重要蛋白功能結(jié)構(gòu)域的第4外顯子設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)，為了提高突變成功率，設(shè)計(jì)3條CRISPR/Cas9突變的sgRNA，選擇基因突變后能改變PLIN1基因表達(dá)效率最高的載體。在確定突變效率過(guò)程中，本試驗(yàn)從細(xì)胞群水平進(jìn)行檢測(cè)，由于突變載體上有嘌呤霉素抗性基因，本課題小組前期已經(jīng)證明了PK15細(xì)胞的最小致死劑量是5 μg/mL嘌呤霉素篩選2 h， 本試驗(yàn)在此條件下對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，在隨后的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中大部分細(xì)胞會(huì)死亡，存活的細(xì)胞則是突變載體成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以此富集的細(xì)胞群進(jìn)行基因整體突變效率檢測(cè)，大大減少后期細(xì)胞中陰性細(xì)胞的比例，在總體水平上可以更好的驗(yàn)證其切割活性。在檢測(cè)突變效率過(guò)程中考慮到基因突變后，可能由于預(yù)測(cè)的突變位置不影響基因的表達(dá)，即存在PLIN1 RNA及蛋白表達(dá)沒(méi)有變化的情況，或者蛋白水平的降低，本試驗(yàn)不僅從DNA層面通過(guò)PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定來(lái)鑒定PLIN1基因突變的效率，也進(jìn)一步檢測(cè)了PLIN1 RNA及蛋白水平的表達(dá)變化，檢測(cè)結(jié)果可以互相驗(yàn)證，結(jié)果顯示，PLIN1-KO2載體在DNA層面上基因突變率最高，該組細(xì)胞中PLIN1 RNA及蛋白表達(dá)降低幅度也最大。

本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬PLIN1基因第4外顯子設(shè)計(jì)了3條能夠靶向切割PLIN1基因的sgRNA并構(gòu)建相應(yīng)的突變載體，轉(zhuǎn)染入PK15細(xì)胞，富集crispr-sgRNA靶向切割引起的PLIN1基因突變或者外源堿基序列插入的細(xì)胞群。通過(guò)RNA及蛋白水平檢測(cè)，3個(gè)PLIN1-KO敲除載體均能突變細(xì)胞中PLIN1基因，其中PLIN1-KO2載體突變效率最高，本試驗(yàn)為后續(xù)研究中突變豬細(xì)胞中PLIN1基因表達(dá)，研究該基因表達(dá)缺失后對(duì)細(xì)胞功能和線(xiàn)粒體功能的影響提供科學(xué)依據(jù)。