程智，王孝艷，雍子宜，2，謝華*（.四川省藥品檢驗研究院，成都 673；2.成都醫(yī)學院藥學院，成都60500）

富馬酸比索洛爾是目前臨床上治療心血管疾病常見的一種選擇性β1-腎上腺素受體拮抗劑[1-3]，在《中國藥典》2020年版（ChP2020）、美國藥典（USP42）、歐洲藥典（EP10.0）、英國藥典（BP2020）以及日本藥典（JP17）中均有收載。富馬酸比索洛爾片在ChP2020、美國藥典（USP42）、英國藥典（BP2020）以及日本藥典（JP17）中均有收載，國內有批準文號的3 家生產企業(yè)均通過了仿制藥一致性評價研究，并獲批了新的藥品標準[4-7]。富馬酸比索洛爾膠囊為我國特有劑型，只在ChP2020 中收載。

在有關物質檢測方面，除美國藥典（USP42）在片劑中無規(guī)定外，其他標準均為有關物質檢測提供了方法和參考，但各標準在已知雜質、色譜條件和雜質限度等方面均存在著很大的差異，特別是在國內各企業(yè)通過仿制藥一致性評價獲得新的注冊標準后，其有關物質測定方法及限度均高于ChP2020，故存在注冊標準與藥典并行檢驗的情況。為統(tǒng)一和提高我國藥品標準，參考國內外各標準中有關物質的測定方法，結合國內原料藥及其制劑中雜質含量的實際情況，建立HPLC 法測定富馬酸比索洛爾及其制劑中的有關物質。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國Waters公司）；島津LC-20AD 高效液相色譜儀（島津中國有限公司）；CPA225D 十萬分之一電子天平、XPR6UD5 百萬分之一電子天平、SevenExcellence 多參數測量酸度計（梅特勒-托利多公司）；Sartorius arium pro 純水儀（德國Sartorius 公司）。

1.2 試藥

富馬酸比索洛爾對照品（批號：100711-201602，純度：99.7%）、富馬酸對照品（批號：111541-201803，純度：99.9%）（中國食品藥品檢定研究院），雜質A（批號：A-J20161128-01，純度：99.7%）、雜質B（批號：LGC，MM0460.07，純度：100%）、雜質E（批號：19085，純度：99.5%）、雜質G（批號：1455-093A2，純度：99.2%）、雜質K（批號：3015-0692A2，純度：99.3%）、雜質L（批號：150401，純度：97.1%）、雜質M（批號：VST019，純度：97.0%）、雜質N-醛（批號：VST009，純度：97.0%）、雜質酸（批號：VST020，純度：97.0%）、雜質羥乙酯（批號：VST021，純度：97.0%）（自制）。磷酸二氫銨（分析純）、磷酸（分析純）、乙腈（色譜純）、水為純化水。

圖1 富馬酸比索洛爾及其雜質化學結構式Fig 1 Chemical structure formula of bisoprolol fumarate and its impurity

富馬酸比索洛爾原料藥（企業(yè)A，批號：1712241；企業(yè)B，批號：9351059、9351060、9351061；企業(yè)C，批號：20160202、180402、181201）；富馬酸比索洛爾片（企業(yè)A，批號：1903115、1808281；企業(yè)B，批號：NT001201、NT001882；企業(yè)C，批號：200306、180802）；富馬酸比索洛爾膠囊（企業(yè)D，批號：190101、190201、190702，規(guī)格：2.5 mg）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A 為磷酸鹽緩沖液（稱取磷酸二氫銨3.45 g，加水900 mL，磷酸調節(jié)pH 值至2.5，加水至1000 mL），流動相B 為磷酸鹽緩沖液-乙腈（20∶80，V/V），梯度洗脫，流速1.0 mL·min－1，檢測波長225 nm，柱溫30℃，進樣量20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別稱取雜質A、雜質酸、雜質L、雜質羥乙酯、雜質G、雜質K、雜質M、雜質N-醛和富馬酸比索洛爾對照品適量，用溶劑（磷酸鹽緩沖液）溶解并定量稀釋制成每1 mL 約含比索洛爾1 μg、雜質A 1.5 μg、雜質羥乙酯和雜質酸2 μg、其他雜質2.5 μg 的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品細粉適量（約相當于富馬酸比索洛爾25 mg），精密稱定，置50 mL 量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 對照溶液的制備 精密量取“2.2.2”項下供試品溶液1 mL，分別置于100 mL 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗溶液 分別稱取雜質A、雜質酸、雜質L、雜質羥乙酯、雜質G、雜質K、雜質M、雜質N-醛和富馬酸比索洛爾對照品適量，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 約含比索洛爾500 μg 和其他各已知雜質2 μg 的溶液，即得。

2.2.5 空白輔料溶液 取混合輔料約0.75 g，置50 mL 量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 精密量取“2.2.4”項下的系統(tǒng)適用性溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果空白輔料峰無干擾，比索洛爾峰與各雜質峰分離度均＞1.5，理論板數均＞3000，見圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖Fig 2 Chromatogram of system suitability

2.3.2 專屬性試驗 取富馬酸比索洛爾原料（企業(yè)B，批號：9351060）約25 mg，加混合輔料（均為片劑與膠囊的混合輔料）0.75 g 置50 mL 量瓶中，分別按以下方式處理：

① 加水溶解稀釋至刻度，搖勻，作為未破壞供試品溶液；② 酸破壞：加入1 mol·L－1鹽酸溶液2 mL，室溫放置1.5 h 后，加入1 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL 中和，加水稀釋至刻度，搖勻，作為酸破壞供試品溶液；③ 堿破壞：加2 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL，100℃水浴加熱3 h，加入2 mol·L－1鹽酸溶液2 mL 中和，加水稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞供試品溶液；④ 氧化破壞：加30%的過氧化氫溶液2 mL，水浴80℃加熱2 h，加水稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞供試品溶液；⑤ 高溫破壞：加水適量溶解，于100℃水浴加熱4 h，加水稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞供試品溶液；⑥ 光照破壞：置日光燈下照射48 h，取出，加水稀釋至刻度，搖勻作為強光破壞供試品溶液。

精密量取上述供試品溶液各20 μL，進樣測定，對比未破壞供試品溶液色譜圖，酸破壞檢出8 個雜質，其中雜質A 含量較高（10.18%）；堿破壞檢出9 個雜質，其中雜質A 含量較高（0.29%）；氧化破壞產生雜質較多；高溫破壞、光照破壞未產生新雜質。結果見圖3。

圖3 專屬性試驗色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of related substances in bisoprolol fumarate from specificity test

2.3.3 線性關系考察 精密稱取雜質A、G、K、L、M、N-醛、羥乙酯、酸及富馬酸比索洛爾對照品各約2.5 mg，分別置10 mL 量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取各溶液適量置同一10 mL 量瓶中，加溶劑稀釋制成每1 mL 中分別約含富馬酸比索洛爾15 μg、雜質A 15 μg、雜質G 25 μg、雜質K 25 μg、雜質L 25 μg、雜質M 25 μg、雜質N-醛 25 μg、雜質羥乙酯20 μg、雜質酸20 μg 的溶液，作為混合對照品儲備液，取適量稀釋成限度濃度的1000%、500%、200%、100%、50%、20%的線性溶液。分別精密量取20 μL，照“2.1”項下色譜條件測定，結果見表2。

表2 已知雜質線性范圍Tab 2 Linearity of the known impurity

2.3.4 精密度試驗 取“2.3.3”項下100%質量濃度線性溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，結果比索洛爾及各雜質峰面積的RSD均小于1.2%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.5 檢測限與定量限考察 取“2.3.3”項下富馬酸比索洛爾及各雜質的對照品溶液，逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。以信噪比為3∶1，計算檢測限，以信噪比為10∶1計算定量限。結果，雜質A、G、K、L、M、N-醛、羥乙酯、酸及比索洛爾的檢測限分別為0.031、0.049、0.057、0.054、0.043、0.048、0.043、0.051、0.032 μg·mL－1，定量限分別為0.152、0.246、0.286、0.268、0.216、0.241、0.214、0.257、0.159 μg·mL－1。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.3”項下100%質量濃度線性溶液及“2.2.2”項下供試品溶液，分別于5℃放置0、6、12、17、24 h 后按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結果混合對照品和供試品溶液在5℃下放置24 h 內雜質個數及雜質量均無明顯變化。

2.3.7 加樣回收試驗 精密稱取片劑細粉和膠囊劑內容物細粉適量（本底中含0.152 μg·mg－1的雜質A 及1.562 μg·mg－1的雜質G），共9 份，分別置10 mL 量瓶中，分別精密量取“2.3.3”項下混合對照 品儲備液0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，置上述量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率。結果雜質A 回收率在100.74%～104.86%，RSD為1.3%；雜質G 回收率在98.15%～106.21%，RSD為2.5%；雜質K 回收率在100.44%～105.23%，RSD為1.6%；雜質L 回收率在104.68%～108.82%，RSD為1.2%；雜質M回收率在100.61%～105.63%，RSD為1.5%；雜質N-醛回收率在98.80%～103.92%，RSD為1.5%；雜質羥乙酯回收率在100.13%～104.44%，RSD為1.3%；雜質酸回收率在90.45%～94.42%，RSD為1.4%。

2.3.8 耐用性試驗 分別調整各色譜參數：流速[（1.0±0.05）mL·min－1]、柱溫（35℃、40℃）、流動相pH 值（2.5±0.1），取系統(tǒng)適用性溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，各條件下8 個已知雜質與主峰之間的分離度均能不低于1.2，結果重現(xiàn)性較好，方法耐用性良好。

2.3.9 樣品測定 分別取各生產企業(yè)的原料藥或制劑樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結果見表3。

表3 樣品中各雜質含量檢測結果(%)Tab 3 Impurity determination in the samples(%)

3 討論

3.1 色譜條件的篩選與確定

BP2020 中收載的已知雜質最多，故本次研究大部分雜質沿用了BP2020[8]中的雜質命名，雜質酸、雜質羥乙酯和雜質N-醛沿用的是進口注冊標準JX20150419[9]。收集目前標準中收載的共10 個已知雜質對照品進行系統(tǒng)適用性研究，在參照目前獲批的4 個片劑最新國家藥品標準（分別沿用的ChP2020 原料有關物質檢測系統(tǒng)和進口注冊標準JX20150419 有關物質檢測系統(tǒng)）和1 個原料最新藥品標準[10]的基礎上，對色譜條件進行了篩選。結果表明，進口注冊標準JX20150419 的色譜系統(tǒng)優(yōu)化后可以在一個色譜系統(tǒng)中實現(xiàn)10 個已知雜質的良好分離，色譜圖見圖4。

圖4 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖Fig 4 System suitability chromatogram of bisoprolol fumarate

3.2 已知雜質的收載

對比國內外標準表明：BP2020 富馬酸比索洛爾原料中收載了15 個已知雜質，明確控制了3 個已知雜質；BP2020 片劑中收載并明確控制了6 個已知雜質；片劑進口注冊標準JX2015019 中明確控制了7 個已知雜質；片劑標準YBH06092019 及YBH07222020 中收載并明確控制了9 個已知雜質；片劑標準YBH05892018 中收載并明確控制了3 個已知雜質。各標準收載的已知雜質多有交叉，且基本在BP2020 中有收載。結合本品的實際處方及生產工藝分析，本研究初期對有關物質中需要重點控制的8個已知雜質進行了研究。但由于各雜質的特性各異，研究中未找到合適的破壞條件制備同時含多個雜質的系統(tǒng)適用性溶液，考慮到后期標準執(zhí)行中各雜質對照品的獲取問題，在最后的擬訂標準中收載了在樣品普遍存在且最能反映樣品質量的4 個雜質（雜質A、雜質L、雜質G、雜質K）作為已知雜質控制，其余各雜質均作為“其他雜質”一并控制。

3.3 雜質限度的擬訂

參考人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會議（ICH）的要求[11-12]，擬訂原料限度如下：除富馬酸及富馬酸之前的色譜峰不計外，如有與雜質A、雜質L、雜質G、雜質K 保留時間一致的色譜峰，按外標法以峰面積計算，分別不得過0.3%、0.1%、0.1%、0.1%，其他單個雜質峰面積不得大于對照溶液中比索洛爾峰面積的0.1 倍（0.10%），雜質總量不得過0.5%；擬訂制劑限度如下：除富馬酸及富馬酸之前的色譜峰不計外，如有與雜質A、雜質L、雜質G、雜質K 保留時間一致的色譜峰，按外標法以峰面積計算，分別不得過0.3%、0.5%、0.5%、0.5%，其他單個雜質峰面積不得大于對照溶液中比索洛爾峰面積的0.2 倍（0.2%），雜質總量不得過2.0%。

3.4 影響因素試驗

參照ChP2020 四部指導原則＜9001＞《原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導原則》，考察3 家企業(yè)富馬酸比索洛爾片（各1 批）的雜質變化情況。在高溫下放置10 d 后，3 家企業(yè)的雜質總量均明顯增大（A 企業(yè)0.19%→0.71%，B 企業(yè)1.17%→2.21%，C 企業(yè)0.30%→1.15%），但已知雜質變化情況各異（A 企業(yè)主要是雜質L 由0.05%→0.19%，B 企業(yè)主要是雜質K 由0.42%→1.00%，C 企業(yè)主要是雜質L 由0.05%→0.15%）。在高濕下放置10 d 后，A 企業(yè)和C 企業(yè)樣品的雜質總量均無明顯變化，但B 企業(yè)的雜質總量明顯增大（1.17%→1.95%），主要是由于雜質L 和雜質G 的增大引起的。在光照下放置10 d 后，A 企業(yè)和C 企業(yè)樣品的雜質總量均無明顯變化，但B 企業(yè)的雜質總量明顯增大（1.17%→2.03%），主要是由于雜質L、雜質G、雜質M 和雜質N-醛的增大引起的。各企業(yè)樣品在影響因素試驗中表現(xiàn)差異較大。

綜上所述，本次研究為富馬酸比索洛爾原料、片劑及膠囊提供了一個科學、合理及全面的有關物質分析方法，可以為該品種的系統(tǒng)質量控制提供參考。