王沙凝，李再巧，吳 沖，田 迪，葉桂芝，宋 羚，桂明英，馬 嘯,

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201)

宮頸癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位，發(fā)病早期無(wú)特異性癥狀，部分出現(xiàn)癥狀就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，目前多采用以手術(shù)和放化療為主的綜合治療方案，毒副作用較強(qiáng)[1-3]。阿霉素(doxorubicin，DOX)為蒽醌類(lèi)高效廣譜化療藥物，用于臨床治療各類(lèi)惡性腫瘤，具有較大副作用，主要體現(xiàn)在心肌損傷，并伴隨肌肉萎縮等不良癥狀，因此其臨床應(yīng)用受限[4-5]。由于近年來(lái)女性患者人數(shù)逐漸增多，年齡逐漸年輕化，新型輔助藥物的開(kāi)發(fā)顯得越發(fā)重要。熊果酸(ursolic acid，UA)，又稱(chēng)烏索酸、烏蘇酸，為五環(huán)三萜類(lèi)化合物，富含于苦丁茶中，苦丁茶老葉中熊果酸的平均含量為1.211%，嫩葉中熊果酸的平均含量為0.574%，具有廣泛的生物學(xué)活性[6-8]。許多研究發(fā)現(xiàn)：熊果酸能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤活性[9-11]。本研究通過(guò)將熊果酸與阿霉素聯(lián)合使用，初步探討其對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖的影響，為熊果酸能否作為化療輔助藥物，減少阿霉素的使用劑量，以減輕抗癌藥物的毒副作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

UA 和DOX 均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；宮頸癌HeLa 細(xì)胞購(gòu)自云南省細(xì)胞工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清(購(gòu)自Hyclone 公司)、1%青鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)的DMEM 高糖培養(yǎng)基(購(gòu)自Hyclone 公司)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 檢測(cè)細(xì)胞存活率

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以4×104個(gè)/mL的密度接種于96 孔板中，每孔200 μL，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行加藥處理，DOX 質(zhì)量濃度梯度為1、2、3、4、5、6、7、8 和9 mg/L；UA 濃度梯度為0、5、10、15 和20 μmol/L；聯(lián)用試驗(yàn)組為2 mg/L DOX 分別與5、10、15 和20 μmol/L UA 聯(lián)用。將細(xì)胞進(jìn)行藥物培養(yǎng)24 h，后加入MTT (購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，每孔16 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除培養(yǎng)基，每孔加入160 μL DMSO (購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行震板并在492 nm 處檢測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率，采用Prism 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1.25×105個(gè)/mL的密度、每皿4 mL 的體積接種于60 mm 培養(yǎng)皿中，放置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行4 h 饑餓處理，后加藥處理，處理組分別為0 (CK)、20 μmol/L UA、2 mg/L DOX、5 mg/L DOX 和2 mg/L DOX+20 μmol/L UA。藥物培養(yǎng)24 h 后吸除培養(yǎng)基，使用PBS 沖洗2 次，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 Hoechest 染色

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1.25×105個(gè)/mL的密度接種于6 孔板中，每孔接種2 mL。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行4 h 饑餓處理，后加藥處理，藥物處理劑量同1.2.3 節(jié)。藥物培養(yǎng)24 h 后吸除培養(yǎng)基，使用PBS 沖洗1 次，再加入1 mL培養(yǎng)基，并加入10 μL Hoechst 33342 活細(xì)胞染色液(100 ×)(購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)染色10 min，吸除培養(yǎng)基，用PBS 沖洗3 次，在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.5 Western-blot 法檢測(cè)HeLa 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度、每皿4 mL 的體積接種于60 mm 培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行4 h 饑餓處理，后進(jìn)行加藥處理，培養(yǎng)12 h。收集處理后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS (購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)緩沖液洗細(xì)胞2 次，加入預(yù)冷的裂解液(購(gòu)自上海美侖試劑有限公司) 100 μL 處理細(xì)胞，在冰上裂解30 min 后用4 ℃離心機(jī)14 000 r/min 高速離心15 min，收集上清液，進(jìn)行BCA (購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司) 蛋白定量檢測(cè)。采用濕轉(zhuǎn)膜法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，使用TBST 進(jìn)行洗滌，5% 脫脂奶粉封閉1 h，后鋪一抗：Bax Antibody (購(gòu)自Cell Signaling Technology)、Bcl-2 Antibody (購(gòu) 自Cell Signaling Technology)、Caspase-3 Antibody (購(gòu)自abcam)和Beta Tubulin Antibody (購(gòu)自Cell Signaling Technology)，置于4 ℃搖床上孵育過(guò)夜。后鋪相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，經(jīng)TBST 溶液洗滌后，將曝光液(購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司)均勻滴在PVDF 膜置上進(jìn)行曝光，并使用ImageJ 軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，采用Prism 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，單因素分析采用AVONA 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，圖像處理采用imageJ，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 UA 與DOX 單獨(dú)使用對(duì)HeLa 細(xì)胞存活率的影響

當(dāng)UA 濃度為5 μmol/L 時(shí)，HeLa 細(xì)胞存活率與對(duì)照組不存在顯著差異(圖1)；當(dāng)UA 濃度增加至10 μmol/L 以后，細(xì)胞存活率極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，抑制效果增強(qiáng)；當(dāng)UA 濃度為20 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率最低，抑制效果最為顯著。當(dāng)DOX 質(zhì)量濃度為1～3 mg/L 時(shí)，HeLa 細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.01)；當(dāng)DOX 質(zhì)量濃度為3～8 mg/L 時(shí)，雖然與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.01)，但處理組之間不存在顯著差異。

圖1 UA 與DOX 單獨(dú)使用對(duì)HeLa 細(xì)胞存活率的影響)Fig.1 The effects of UA and DOX uesed alone on the survive rate of HeLa cells

2.2 UA 與DOX 聯(lián)用對(duì)HeLa 細(xì)胞存活率的影響

選取5、10、15、20 μmol/L UA 分別與2 mg/L DOX 進(jìn)行聯(lián)用，由圖2 可知：4 組不同濃度的UA 和2 mg/L DOX 聯(lián)用分別與2 mg/L DOX 單獨(dú)使用相比，細(xì)胞存活率均極顯著降低(P＜0.01)，且4 個(gè)聯(lián)用組的細(xì)胞存活率均極顯著低于5 mg/L DOX 單獨(dú)使用；5、10、15 μmol/L UA 與2 mg/L DOX 的3 組聯(lián)用分別與相應(yīng)的3 個(gè)不同濃度的UA 單獨(dú)使用相比，細(xì)胞存活率均極顯著降低(P＜0.01)，而20 μmol/L UA 和2 mg/L DOX 聯(lián)用與20 μmol/L UA 相比，細(xì)胞存活率不存在顯著差異，但顯著低于15 μmol/L UA 單獨(dú)使用，達(dá)到UA 與DOX 聯(lián)用作用效果最高劑量。

圖2 UA 和DOX 聯(lián)用對(duì)HeLa 細(xì)胞存活率的影響)Fig.2 The effect of the combination of UA and DOX on the survival rate of HeLa cells

2.3 UA 與DOX 聯(lián)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞具有表面結(jié)構(gòu)和自身表面張力，以及受到外界的機(jī)械壓力，能夠保持一定的形態(tài)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)(圖3)：經(jīng)20 μmol/L UA 和2 mg/L DOX 單獨(dú)給藥處理的HeLa 細(xì)胞的形態(tài)由梭狀轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則形狀，細(xì)胞密度降低、細(xì)胞分離數(shù)增加；經(jīng)5 mg/L DOX 單獨(dú)處理的HeLa 細(xì)胞形態(tài)明顯皺縮，由梭狀變?yōu)閳A形，細(xì)胞密度明顯降低；聯(lián)用組(20 μmol/ UA+2 mg/L DOX)處理的HeLa 細(xì)胞形態(tài)變化最為明顯，由梭狀變?yōu)閳A形，而細(xì)胞密度變化不太明顯。

圖3 HeLa 細(xì)胞形態(tài))Fig.3 Cell morphology of HeLa

2.4 UA 與DOX 聯(lián)用細(xì)胞凋亡觀察

Hoechst 是一種可穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光探針，常用細(xì)胞凋亡檢測(cè)。在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散均勻熒光；出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)濃染致密的顆粒塊狀熒光。如圖4 所示：聯(lián)用組(20 μmol/L UA+2 mg/L DOX)給藥處理的HeLa 細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)的濃染致密的顆粒塊狀熒光(紅色圓圈所示)。因此，聯(lián)用組細(xì)胞凋亡數(shù)量高于單獨(dú)用藥組。

圖4 Hoechest 染色)Fig.4 Staining of Hoechest

2.5 HeLa 細(xì)胞促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

相關(guān)促凋亡蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖5 所示：對(duì)于Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量，聯(lián)合用藥組(20 μmol/L UA +2 mg/L DOX)顯著高于20 μmol/L UA 單獨(dú)使用(P＜0.05)，但與2 mg/L DOX 相比，沒(méi)有顯著差異；聯(lián)用組Bax/Bcl-2 表達(dá)量分別與20 μmol/L UA 和2 mg/L DOX 單獨(dú)使用相比，也沒(méi)有顯著差異。

3 討論

本研究MTT 結(jié)果顯示：熊果酸可顯著降低HeLa 細(xì)胞的活性，與阿霉素聯(lián)用效果高于2 種藥物單獨(dú)使用效果，且高于較高質(zhì)量濃度的阿霉素單獨(dú)使用效果，這發(fā)揮了熊果酸抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[10]。

在細(xì)胞形態(tài)學(xué)中，二者聯(lián)用對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響較為明顯；細(xì)胞凋亡觀察結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：出現(xiàn)較強(qiáng)的濃染致密的顆粒塊狀熒光，即凋亡細(xì)胞數(shù)較多。此外，有研究表明：經(jīng)熊果酸可誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致核固縮，細(xì)胞核呈致密濃染的顆粒塊狀熒光[12]，該結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

關(guān)于促凋亡蛋白，半胱天冬蛋白酶Caspase-3是細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑中的執(zhí)行者，在Caspase 家族介導(dǎo)的凋亡通路中，級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終聚集于此，并將刺激信號(hào)往下傳導(dǎo)，可與大量的蛋白因子共同調(diào)控細(xì)胞凋亡，具有不可逆作用[13]。Caspase-3 活化可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段，最終使得核小體間DNA 降解，細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-15]；B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 基因即Bcl-2基因是一種原癌基因，它具有抗凋亡作用。Bax是Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，在通過(guò)線粒體應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，是細(xì)胞凋亡內(nèi)源性線粒體途徑的重要調(diào)節(jié)因子，通常以二者比值判斷細(xì)胞凋亡狀態(tài)。有研究表明：線粒體跨膜電位的改變預(yù)示細(xì)胞可能出現(xiàn)凋亡[16]。熊果酸可保護(hù)心臟免受阿霉素引起的傷害，其通過(guò)增加AKT 磷酸化水平和增強(qiáng)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)，同時(shí)抑制阿霉素誘導(dǎo)的eNOS 通過(guò)NADPH 氧化酶4 (NOX4)下調(diào)解偶聯(lián)[17]。本試驗(yàn)結(jié)果提示：二者聯(lián)用可達(dá)到減少阿霉素毒副作用的效果。有研究表明：高劑量熊果酸(50 mg/kg)可以降低阿霉素腎病小鼠的尿蛋白，抑制腎小管間質(zhì)TGF-β1 蛋白的表達(dá)，減輕阿霉素的毒副作用[18]。Western-blot 結(jié)果顯示：Cleaved caspase-3 蛋白含量(圖5)聯(lián)用組低于高劑量阿霉素組，與熊果酸單獨(dú)用藥組存在差異性(P＜0.05)，但與低劑量阿霉素組不存在差異性，這可能與熊果酸的給藥劑量有關(guān)。相關(guān)研究顯示：20～50 μmol/L 熊果酸作用于HuH7 肝癌細(xì)胞8 h 后，能呈劑量依賴(lài)性地下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白(XIAP) 的表達(dá)量[19]。而B(niǎo)ax 蛋白含量不存在差異性，可能是進(jìn)行了細(xì)胞核凋亡途徑，此外，還可能與藥物作用時(shí)間、給藥濃度以及相關(guān)凋亡通路有關(guān)，具體作用機(jī)制還有待深入研究。

圖5 促凋亡蛋白的表達(dá)量)Fig.5 Levels of proteins associating with apoptosis

4 結(jié)論

MTT 結(jié)果顯示：熊果酸與阿霉素聯(lián)用效果高于2 種藥物單獨(dú)使用效果；聯(lián)用效果在細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果中變化最為明顯，由梭狀變?yōu)閳A形，且在熒光染色中出現(xiàn)較強(qiáng)的濃染致密的顆粒塊狀熒光，細(xì)胞凋亡較多。而根據(jù)相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2 的表達(dá)量結(jié)果顯示：二者聯(lián)用的作用機(jī)制可能是進(jìn)行了細(xì)胞核凋亡途徑，具體機(jī)制仍需探究。因此，二者在一定程度上減少阿霉素的使用劑量，增強(qiáng)阿霉素對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞的治療作用。