李 震，張清壯，許石劍，羅富方，劉勝傳，宋莉丹，李 鑫

(1.貴州省煙草公司黔西南州公司，貴州 興義 562400；2.湖南省農業(yè)科學院，湖南 長沙 410128；3.湖南省蔬菜研究所，湖南 長沙 410128；4.湖南省科學技術事務中心，湖南 長沙 410013)

烤煙作為貴州主要支柱產業(yè)之一，烤煙種植是煙農增收和脫貧致富的重要途徑。土壤養(yǎng)分及生態(tài)平衡狀況是影響煙草品質的基本條件，而由于受烤煙傳統(tǒng)種植習慣的影響，一味追求高產而大量施用化肥以及連作種植模式突出導致植煙土壤性質劣化、土壤板結、耕作層變淺和犁底層上移，煙田生態(tài)功能降低，有益微生物種類和數(shù)量降低，從而影響煙株的生長發(fā)育和烤煙產質量下降[1]。如何通過烤煙—土壤—微生物建立適宜于區(qū)域烤煙可持續(xù)發(fā)展的土壤保育技術，對促進烤煙種植結構調整、提高烤煙產質量和煙農收入具有重要意義。

土壤微生物不僅是維持土壤生化活性的重要組成部分，還是植物生長的活性營養(yǎng)庫，能改善土壤理化性質、參與土壤的養(yǎng)分循壞和礦物質轉化等多種生化過程，是反映土壤健康的有效指標[2]。土壤微生物多樣性降低，有益微生物減少，病原菌增加，會引起土壤酸化，改變土壤有效養(yǎng)分，是連作障礙主要成因之一，最終將導致烤煙生長發(fā)育受阻、產質量降低[3]。為了防治烤煙連作障礙，采取一系列有效的消減措施，如輪作、間作套種、施用生物有機肥、選用抗病品種和生物防治等[4]。煙草與其他作物輪作及間套作對于改善土壤微生物種群結構和消減煙草連作障礙具有很好效果[5]。徐潔等[6]表明：添加生物有機肥能改變土壤中的微生物尤其是有益微生物的數(shù)量與結構，促進煙草生長，提高烤煙的產質量。土壤耕層重構主要是通過現(xiàn)代化機械手段，將表層土壤0～20 cm 與＞20～40 cm進行互換，試圖通過土壤耕層的重新構筑，改良土壤結構，提升土壤肥力，解決煙田連作生產中存在的諸多弊病[7-8]。目前有關耕層重構對烤煙土壤微生物多樣性的影響尚未系統(tǒng)研究。

本研究擬利用耕層重構技術解決黔西南煙區(qū)煙田生態(tài)功能降低、病蟲害加重和烤煙生產力下降的問題，基于大田試驗，研究耕層重構對煙田土壤微生物多樣性和烤煙農藝性狀的影響，以期通過耕層重構改善烤煙土壤微生態(tài)環(huán)境，促進煙株生長發(fā)育，為該煙區(qū)特色優(yōu)質煙葉生產和煙葉可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2019 年在興義市興仁縣雨樟鎮(zhèn)交樂村立山坪(N25°20′53″，E105°7′49″)進行，海拔1 560 m，屬中亞熱帶季風氣候。供試品種為云煙97，由黔西南州煙草公司興義市分公司提供。

土壤基礎理化性狀：pH 為5.15，有機質含量為27.85 g/kg，全氮含量為1.78 g/kg，堿解氮含量為134.06 mg/kg，有效磷含量為6.56 mg/kg，速效鉀含量為313.95 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區(qū)組設計，于2018 年10 月中下旬進行土壤置換處理，2019 年4 月下旬起壟移栽；設置3 個處理。T1：對照，當?shù)爻Ｒ?guī)旋耕，旋耕深度0～15 cm；T2：0～20 cm 土壤與＞20～40 cm 土壤互換，旋耕深度30 cm；T3：0～15 cm土壤與＞15～30 cm 土壤互換，旋耕深度30 cm，每個處理3 個重復，共9 個小區(qū)，小區(qū)面積為111.1 m2。

具體做法：(以T3為例)使用動力160 kW 拖拉機帶動旋轉式主副深翻犁1 次，將0～15 cm 土壤與＞15～30 cm 土壤進行互換。株行距為1.2 m×0.5 m，4 月21 日開始移栽，試驗田的施肥情況為：施用煙草專用肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=12∶12∶14] 750 kg/hm2，硫酸鉀225 kg/hm2，有機肥1 200 kg/hm2。其他栽培管理措施均與當?shù)貎?yōu)質煙葉生產中的管理措施完全一致。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 烤煙農藝性狀測定

在打頂后10 d 測定煙株農藝性狀，參照YC/T 142—2010 標準，每個小區(qū)定點選擇生長比較一致的健壯煙株5 株，測定株高、莖圍、有效葉片、最大葉長和最大葉寬等指標，烘烤后測定各小區(qū)產量，并折算成單位面積產量。

1.3.2 土壤樣品采集

在烤煙采收后，各處理采用抖落法采集煙株根際土壤，混勻，用無菌自封袋包裝，放入冰盒保存，帶回實驗室置于-80 ℃冰箱，用于提取土壤DNA，分析微生物多樣性。

1.3.3 土壤微生物的測序與多樣性分析

所有土壤樣品使用特定DNA 提取試劑盒進行微生物的總DNA 提取，后使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量。確定質量合格后將DNA樣本低溫送至上海北滬生物科技有限公司完成擴增子測序。采用Illumina MiSeqTM測序技術進行測定。

微生物多樣性分析使用QIIME 軟件執(zhí)行。α 多樣性分析用于評估微生物群落的豐富度和多樣性[9]。Ace 和Chao 豐富度指數(shù)用于估計群落中實際存在的物種數(shù)，數(shù)值越高表明群落物種的豐富度越高；Shannon 和Simpson 多樣性指數(shù)可以反映樣品的多樣性程度，數(shù)值越高表明群落多樣性越高；β 多樣性分析用于研究不同樣本群落結構的相似性或差異關系以及與環(huán)境因子的相關性。最后進行主成分分析(PCA)以便區(qū)分不同處理后群落結構的變化差異。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SPSS 和RStudio 軟件對所測數(shù)據(jù)進行整理、方差分析、各分類學水平上的群落結構柱形圖和主成分分析等。

2 結果與分析

2.1 耕層重構對烤煙農藝性狀和產量的影響

從表1 可見：處理組(T2、T3)烤煙農藝性狀及產量與對照(T1)差異顯著。從煙株株高來看，對照T1的株高顯著低于處理組(P＜0.05)，其中T2處理最高。煙株莖圍、有效葉數(shù)、最大葉面積和產量均以T2處理最高。T2和T3處理組產量較T1對照組分別提高14.31%和7.32%，說明耕層重構改變了土壤結構分布，顯著改善影響煙葉生長發(fā)育的各構成因素，從而對煙葉的生長起到促進效果。綜合農藝性狀和產量來看，T2、T3處理優(yōu)于T1對照組。

表1 耕層重構對烤煙農藝性狀和產量的影響Tab.1 Effect of tilth layer reconstruction on the agronomic characters and yield of flue-cured tobacco

2.2 耕層重構對植煙土壤細菌和真菌群落多樣性的影響

2.2.1 α 多樣性

從表2 可見：細菌群落中，與對照T1相比，T2和T3土壤耕層重構的處理顯著提高了Ace、Chao 和Shannon 指數(shù)(P＜0.05)。4 個群落多樣性指數(shù)的變化趨勢一致，均表現(xiàn)為T2＞T3＞T1，其中T2的Ace、Chao 和Shannon 指數(shù)比T1分別提高41.28%、39.56%和26.44%，T3的各指數(shù)較T1分別提高36.78%、34.78%和22.46%，而Simpson 指數(shù)在各組群落間差異不顯著。與細菌群落多樣性結果相反，真菌群落中T2和T3處理的Ace、Chao、Shannon 和Simpson 指數(shù)值都顯著低于對照T1。以T3中Ace 和Shannon 指數(shù)值下降最大，分別較對照T1下降35.49%和38.00%。由此可見，耕層重構提高了細菌群落的豐富度和多樣性，降低了真菌群落的豐富度和多樣性，土壤耕層重構后的土壤環(huán)境更有利于細菌的生長繁殖。

表2 植煙土壤細菌和真菌群落多樣性指數(shù)Tab.2 Indexes of bacterial and fungal community diversity in tobacco-growing soil

2.2.2 β 多樣性

由圖1a 細菌主成分分析(PCA)可知：第一主成分(PC1)的方差貢獻率為77.9%，第二主成分PC2 的方差貢獻率為15.9%，累積達到93.8%。對照T1分布在第二象限，T2處理分布在第四象限，T3處理分布在第一象限。在PC1 上，耕層重構處理的土壤細菌OTU 分布具有相對一致性，且與對照T1存在較大差異；在PC2 上，T1和T3處理的土壤細菌OTU 分布差異較小。

由圖1b 真菌主成分分析可知：PC1 的方差貢獻率為48.4%，PC2 的方差貢獻率為18.6%，累積達到67.0%。真菌在主成分軸上的變化趨勢與細菌一致。耕層重構對微生物群落功能多樣性的影響在空間距離差異上分布較明顯，表明耕層重構導致土壤微生物群落功能改變。

圖1 土壤樣品細菌(a)、真菌(b) PCA 分析圖)Fig.1 PCA analysis of bacteria (a) and fungi (b) in soil samples

2.3 耕層重構對植煙土壤細菌和真菌群落結構的影響

采用高通量測序技術對土壤微生物多樣性進行分析，不同處理微生物群落在門、屬水平的相對豐度如圖2 所示。在門水平上(圖2a)，各處理中細菌主要由綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、奇古菌門(Thaumarchaeota)和酸桿菌門組成。與T1相比，T2和T3處理土壤中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門相對豐度明顯降低，綠彎菌門、奇古菌門、酸桿菌門和浮霉菌門相對豐度明顯升高，其中擬桿菌門降低的最多，綠彎菌門提高的最多。T2和T3處理群落組成相似。屬水平上(圖2b)，T2、T3處理組中Nitrososphaeraceae、Sbr1031、Subgroup 6 和Anaerolineaceae 的相對豐度較T1顯著增加，而Muribaculaceae、Cmig08 和Ralstonia的相對豐度明顯降低。

圖2 土壤樣品在細菌(a、b)和真菌(c、d)門、屬分類水平上相對豐度變化)Fig.2 Changes in relative abundance of soil bacteria (a,b) and fungi (c,d) samples at phylum and genus levels

由圖2c 可知：土壤中的真菌主要由子囊菌門(Ascomycota)構成，所占比例達74.67%～86.53%。不同處理對真菌相對豐度變化不同，T2較T1土壤中的子囊菌門相對豐度明顯升高，擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度明顯降低，降幅為12.13%，而T3較T1土壤中的子囊菌門和擔子菌門相對豐度無顯著差異，壺菌門(Chytridiomycota)相對豐度明顯升高，增幅為6.40%，T3較T1和T2處理土壤中的球囊菌門(Glomeromycota)相對豐度明顯降低。屬水平上(圖2d)，T2和T3組中曲霉屬相對豐度顯著增加，管柄囊霉屬(Funneliformis)在T2中顯著增加。

2.4 耕層重構中優(yōu)勢菌群與烤煙生長的關系

由表3 可知：株高與酸桿菌門、浮霉菌門、曲霉屬和翹孢霉屬的相對豐度呈顯著正相關(P＜0.05)，其相關系數(shù)分別為0.596、0.639、0.585和0.645。有效葉數(shù)與株高存在相似規(guī)律，其相關系數(shù)分別為0.714、0.767、0.671 和0.629。

表3 優(yōu)勢菌門、屬與烤煙生長參數(shù)的相關性分析Tab.3 Pearson correlation analysis between growth parameters of tobacco and abundant bacterial phylum and genera

3 討論

土壤耕層重構(T2和T3)后種植的烤煙比對照土壤上種植的煙株(T1)有明顯的生長優(yōu)勢，其株高、莖圍、有效葉數(shù)、最大葉面積和產量等指標均比對照增加，其中增產幅度達到14.31%。耕層重構技術運用于其他農作物上均與該試驗表現(xiàn)出一致的效果。王樹林等[7]研究表明：耕層重構后棉花生長表現(xiàn)出明顯的后發(fā)優(yōu)勢，具有抗旱耐澇作用，可有效提高棉花產量。孟慶英等[10]研究表明：土層置換可顯著增加大豆、馬鈴薯和甜菜的產量。盧佳等[11]研究表明：土層置換處理后玉米生長勢及產量相關指標均有一定程度的提高。

耕層重構促進烤煙生長可能有2 個原因：一是通過有益微生物改善理化性質，提升土壤養(yǎng)分含量來促進作物生長；二是抑制或阻撓病原菌的發(fā)展，間接促進作物的生長。土壤微生物在土壤養(yǎng)分轉化和碳氮循環(huán)中起著尤為重要的作用[12]，其微生物多樣性與土壤微生態(tài)環(huán)境密切相關[13]。本研究結果表明：T2和T3處理土壤中細菌Ace指數(shù)、Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均顯著高于T1對照組，真菌各項多樣性指數(shù)則顯著低于T1對照組，說明耕層重構提高了植煙土壤細菌的豐富度和多樣性，降低了真菌的豐富度和多樣性，符合健康的“細菌型”土壤的標準。耕層重構后土壤中曲霉屬、浮霉菌門和酸桿菌門的相對豐度顯著增加，與烤煙株高和有效葉數(shù)呈正相關。曲霉菌是一種適應能力較強的腐生真菌，能夠在高營養(yǎng)、低營養(yǎng)以及強滲透脅迫下生存繁殖[14]。曲霉菌廣泛存在于植物體內，對植物生長和抵抗逆境有一定作用，主要通過分泌到植物組織中的一些物質發(fā)揮作用，如激素(茉莉酸、吲哚乙酸和水楊酸)、黃酮類物質、多酚類物質和脯氨酸等[15-16]。植物可以利用這些真菌細胞外生物過程釋放的營養(yǎng)物質，促進植物生長，或通過這些激素類物質的信號，植物能夠即時響應并抵御外界脅迫環(huán)境[16]。浮霉菌門在氮循環(huán)中起重要作用，是一種典型的厭氧氨氧化細菌，而氨氧化微生物在菜田土壤氮循環(huán)中，對于增加土壤氮含量、改變氮的形式和增強植物對氮的有效利用至關重要[17]。酸桿菌門能通過改善土壤pH 進而有益于植物的生長。對于土壤中的拮抗微生物，本研究中T2處理翹孢霉屬和管柄囊霉屬顯著增加。翹孢霉屬是一種鐮刀枯萎病的生防拮抗菌[18]。管柄囊霉屬對致病菌生長有明顯的抑制作用，能夠降低植物感病率，改善烤煙生長環(huán)境，促進烤煙生長[19]。

4 結論

研究發(fā)現(xiàn)：通過0～20 cm 土壤與＞20～40 cm土壤互換，旋耕深度30 cm 的方式進行耕層重構后種植煙草，其農藝性狀最佳，產量最高(較未處理土壤提高14.31%)。同時微生物群落分析表明耕層重構能夠提高微生物多樣性指數(shù)，增加有益微生物曲霉屬、浮霉菌門和酸桿菌門的相對豐度。因此，對植煙土壤進行耕層重構可以改善烤煙土壤微生態(tài)環(huán)境，是一種促進煙草發(fā)育、增加煙葉產量和緩解煙田連作障礙的有效耕作措施。此外，耕層重構也為構建健康煙田土壤生態(tài)系統(tǒng)提供了一種新的途徑和實踐參考。