劉成前，馮書華，李 想，何永美，張彥雪，祖艷群，李 元，謝春梅

(云南農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，云南 昆明 650201)

溫室氣體大量排放導(dǎo)致全球氣候變暖已成為當今重要的環(huán)境問題之一[1]。甲烷(CH4)作為溫室氣體，對溫室效應(yīng)貢獻僅次于CO2，貢獻率可達15%，增溫潛勢是CO2的23～25 倍[2]。稻田是重要的CH4排放源之一，中國作為水稻(Oryza sativa)種植大國，水稻種植面積占全球水稻面積的18.5%，稻田CH4排放量占全球排放量的19%[3]。因此，研究稻田CH4排放對控制全球氣候變暖具有重要意義。

水稻根系分泌物是影響稻田CH4排放的重要因素，稻田土壤中的產(chǎn)甲烷菌以此為碳源釋放CH4[4]。水稻根系分泌物包括氨基酸、低分子量有機酸和可溶性糖等小分子有機物，其中有機酸易被根際細菌分解為CO2、H2和醋酸鹽等產(chǎn)CH4基質(zhì)，為產(chǎn)甲烷菌提供原料，促進稻田土壤CH4的產(chǎn)生[5]。根系分泌物的釋放可改變土壤中活性有機碳的組分，為CH4產(chǎn)生提供了重要的底物，稻田CH4排放量中60%來源于土壤活性有機碳[6]。根系分泌物類似物的增加促進微生物活性和酶促反應(yīng)，加快土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化速率[7]；土壤微生物是土壤生化反應(yīng)的驅(qū)動力，土壤酶大多數(shù)來源于此[8]。有研究表明：向土壤中添加根系分泌物類似物如乙酸鹽、甲酸鹽、蘋果酸鹽、草酸鹽和糖等，可顯著增加土壤中CO2和CH4的排放量[9]?，F(xiàn)有研究集中于田間原位添加根系分泌物類似物或覆壓植物秸稈增加有機質(zhì)輸入，提高土壤脲酶、過氧化氫酶和蔗糖酶活性等，為了解土壤微生物、酶活性和CH4排放之間的關(guān)系提供理論依據(jù)[10]；多數(shù)室內(nèi)研究主要模擬根系分泌物碳輸入促進生物代謝活力、酶活性和基因表達等方面[11]，缺少對CH4排放影響的研究。

梯田農(nóng)業(yè)廣泛分布于亞洲、歐洲、美洲和非洲，是人類適應(yīng)山地環(huán)境而形成的一種古老的生產(chǎn)模式，目前全球已有14 處古梯田被列入世界文化遺產(chǎn)名錄[12]，元陽梯田的規(guī)模和海拔跨度具有較強的典型性和代表性。元陽哈尼梯田位于云南省元陽縣哀牢山南部，海拔1 400～1 800 m，傳統(tǒng)水稻種植歷史1 500 多年，水稻種植時間為每年5—10 月，冬季休閑期水稻秸稈還田，浮水固氮植物滿江紅(Azolla imbricate)自然生長，土壤有機碳含量豐富，利于CH4產(chǎn)生，在水稻生長期和冬季休閑期均有CH4排放，具有持續(xù)和高通量排放的特點，是CH4排放量最大的一類稻田[13]。土壤有機碳是CH4排放的關(guān)鍵底物，而根系分泌物是根際沉積過程中的一部分，也是植物根系釋放有機碳的主要來源[14]。本研究以元陽梯田土壤為對象，模擬水稻根系分泌物增加，研究添加可溶性糖和有機酸對土壤酶活性、土壤活性有機碳組分和含量的影響，探究CH4排放的影響因素，以期為了解梯田系統(tǒng)土壤溫室氣體排放及其影響因素提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

稻田土壤樣品采集于元陽縣新街鎮(zhèn)箐口村(N23°7′，E102°44′)梯田，年平均溫度15 ℃，年均降水量1 397 mm，年均蒸發(fā)量1 543 mm，屬于山地季風氣候，海拔1 600 m，5—10 月種植水稻，梯田全年淹水，是元陽哈尼梯田核心區(qū)[15]。供試土壤背景值為：全氮含量2.54 g/kg，全磷含量0.431 g/kg，全鉀含量13.85 g/kg，堿解氮含量92.17 mg/kg，速效磷含量14.03 mg/kg，速效鉀含量16.50 mg/kg，土壤pH 值5.67，有機質(zhì)含量29.93 g/kg，土壤容重1.45 g/cm3，含水率48%。

1.2 厭氧培養(yǎng)試驗

使用土壤采樣器“S 布點法”采集水稻收獲后的稻田0～20 cm 處土壤，迅速運回試驗室。直接用新鮮土樣過10 目尼龍網(wǎng)篩，以去除水稻秸稈、植物根系和石礫等雜質(zhì)[15]，參照楊玉楠等[16]的方法開展厭氧培養(yǎng)試驗。

可溶性糖和有機酸組合溶液質(zhì)量分數(shù)參照SHI 等[17]的方法，設(shè)置為可溶性糖0.245 mg/g、草酸0.423 mg/g、琥珀酸0.403 mg/g 和蘋果酸0.033 mg/g，相當于在低、中和高的植物光合速率下根系分泌物中的碳含量，碳添加比率為0.1、0.2 和0.3 mg/(g·d) (按土壤干質(zhì)量計算)。試驗共設(shè)計10 種根系分泌物類似物及其組合處理，每個處理3 組重復(fù)，各處理添加量見表1。組合溶液均用去離子水配制，用NaOH 調(diào)節(jié)pH值至5.5，定容至150 mL，保存于4 ℃冰箱內(nèi)。

表1 可溶性糖和有機酸的添加組合Tab.1 Addition combination of soluble sugar and organic acid

每個處理取300 g 土壤樣品(干質(zhì)量)加入1 L 棕色廣口瓶中，用去離子水淹沒3 cm，使其達到厭氧狀態(tài)，培養(yǎng)2 周，以培養(yǎng)微生物群落。培養(yǎng)結(jié)束，用氮氣沖洗消散瓶中累積的氣體，隨后以10 mL/d 的速率加入可溶性糖和有機酸溶液，空白處理加10 mL 高壓滅菌的去離子水作為對照(CK)，室溫下培養(yǎng)2 周。廣口瓶用橡膠塞密封，橡膠塞留兩口，一口添加可溶性糖和有機酸，另一口連接馬氏發(fā)酵管；馬氏發(fā)酵管內(nèi)裝有過量0.5 mol/L NaOH 溶液，用來吸收培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的二氧化碳氣體，利用馬氏發(fā)酵管的排液法測得CH4排放量。

1.3 測定方法

直接取瓶中土壤懸液混勻后測定土壤酶活性和有機碳含量，同時測定含水率、確定土壤干質(zhì)量。

土壤活性有機碳測定采用嚴昌榮等[18]的方法，硫酸鉀浸提，重鉻酸鉀—硫酸外加熱容量法測定。土壤微生物量碳(MBC)按照《土壤與環(huán)境微生物研究法》中的改進方法[19]，氯仿熏蒸，K2SO4浸提，重鉻酸鉀—硫酸外加熱容量法測定。土壤易氧化有機碳(LOC)采用傳統(tǒng)方法[15]，高錳酸鉀氧化，離心取上清液稀釋后比色，根據(jù)高錳酸鉀的消耗量計算土壤易氧化有機碳含量。

土壤脫氫酶活性測定采用關(guān)松蔭等[20]的TTC比色法，加TTC Assay buffer 工作液，避光孵育，于485 nm 測定吸光度，計算TTC 還原量，以該還原量表示脫氫酶活性。過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法[20]，加H2O2和鋁鉀礬震蕩后過濾，高錳酸鉀滴定，計算H2O2消耗量，以該量表示過氧化氫酶活性。蔗糖酶活性測定采用3，5—二硝基水楊酸比色法[15]，加蔗糖和二硝基水楊酸沸水浴加熱，于508 nm 測定吸光值，計算蔗糖消耗量，以該消耗量表示蔗糖酶活性。纖維素酶活性測定采用甲苯培養(yǎng)比色法[15]，加羧甲基纖維素溶液加熱培養(yǎng)，于540 nm 測定吸光值，計算纖維素消耗量，以該消耗量表示纖維素酶活性。多酚氧化酶活性測定采用鄰苯三酚—乙醚比色法[15]。加鄰苯三酚溶液培養(yǎng)，于525 nm測定吸光值，計算鄰苯三酚—乙醚消耗量，以該消耗量表示多酚氧化酶活性。每一土樣需做無基質(zhì)對照。

CH4氣體采集；用雙聯(lián)球連接廣口瓶導(dǎo)出口，另一端連接集氣袋，采集氣體，氣體樣品采用Agilent 7890B 氣相色譜儀測定分析[15]。CH4排放量計算公式為：

F=dC/dtt=0×h×ρ×60×273/(273+T)

式中，F(xiàn)為氣體排放通量；h為采樣瓶高度(液面離頂部的高度)；T為瓶內(nèi)溫度；ρ為標準狀況下CH4氣體的密度，0.717 g/L；dC/dtt=0為單位時間內(nèi)氣體濃度線性變化率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 對數(shù)據(jù)統(tǒng)計整理，用Origin Pro 9.1繪圖，用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，處理組間差異顯著性采用LSD 法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加可溶性糖和有機酸對CH4 排放的影響

由圖1 可知：添加可溶性糖和有機酸可影響CH4排放量和排放通量。除Sr 和S 處理外，其他處理的CH4排放量較CK 增加趨勢更明顯；除S 和OSM 處理外，其他處理的CH4排放通量顯著增加(P＜0.05)，SrM 和SrO 處理增量與CK 相比分別高達124 和197 mg/(m·h)。

圖1 添加可溶性糖和有機酸對CH4 排放的影響)Fig.1 Effect of the addition of soluble sugar and organic acid on the CH4 emission

2.2 添加可溶性糖和有機酸對土壤有機碳和CH4排放通量的影響

由圖2 可知：添加可溶性糖和有機酸對土壤微生物量碳和可溶性有機碳含量影響較大，表現(xiàn)為促進作用，易氧化有機碳含量變化不明顯。與CK 處理相比，SrO 處理易氧化有機碳含量顯著增加，增幅為7.8%，O 和OSM 處理顯著降低，降幅分別為10.0%和22.4%，其他6 組處理變化均不顯著；除SrS 和SrOSM 處理外，其他處理組的微生物量碳含量均顯著高于對照組(P＜0.05)，SrO 處理組的增量高達250%；8 組處理可溶性碳含量均顯著增加，增幅為48.1%～153%。

圖2 添加可溶性糖和有機酸組分對土壤活性碳含量的影響)Fig.2 Effects of the addition of soluble sugar and organic acid on the activated organic carbon content in soil

由圖3 可知：易氧化有機碳含量與CH4排放通量呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，微生物量碳與CH4排放通量顯著正相關(guān)(P＜0.05)，表明土壤中微生物量碳含量和易氧化有機碳含量與CH4排放通量密切相關(guān)。

圖3 微生物量碳含量和易氧化有機碳含量與CH4 排放通量的相關(guān)性)Fig.3 Correlation between microbial biomass carbon content and easily oxidizable organic carbon content and CH4 emission flux

2.3 添加可溶性糖和有機酸對土壤酶活性的影響

由圖4 可知：添加不同可溶性糖和有機酸組合對土壤酶活性的影響呈現(xiàn)不同的變化趨勢。與CK 處理相比，S、OSM、Sr、SrO、SrS 和SrOSM處理的脫氫酶活性顯著增加，OSM 處理增幅高達374%；O、M 和SrM 處理的脫氫酶活性則顯著降低；各處理過氧化氫酶活性均顯著降低，降幅為14.7%～45.3%，其中，O、M、Sr 和SrM 處理的降幅較小；S、M、Sr、SrM 和SrOSM 處理的蔗糖酶活性顯著降低，降幅為38.7%～50.5%，而SrS 處理的蔗糖酶活性則顯著增加；S、M、OSM、Sr、SrO 和SrOSM 處理的纖維素酶活性顯著降低，降幅為31.2%～40.5%；O、S、OSM、SrO、SrS 和SrOSM 處理的多酚氧化酶活性顯著增強，O 和OSM 處理增量高達6.53 和6.66 U/g。

圖4 添加可溶性糖和有機酸對土壤酶活性的影響)Fig.4 Effect of the addition of soluble sugar and organic acid on the enzyme activity in soil

通過對土壤碳轉(zhuǎn)化酶活性與活性有機碳含量作相關(guān)性分析可知(表2)：可溶性碳含量與脫氫酶和多酚氧化酶活性呈極顯著正相關(guān)，與過氧化氫酶活性呈極顯著負相關(guān)；易氧化有機碳含量與多酚氧化酶活性呈顯著負相關(guān)；微生物量碳含量與所測5 種酶活性相關(guān)性均不明顯。

表2 土壤酶活性與活性有機碳含量的相關(guān)性Tab.2 Correlation between soil enzyme activity and active organic carbon contents

3 討論

3.1 添加可溶性糖和有機酸對土壤酶活性的影響

可溶性糖和有機酸是水稻根系重要的根系分泌物，是土壤微生物的主要碳源和氮源，在促進土壤微生物生長的過程中也影響著土壤酶的活性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)：添加可溶性糖和有機酸后脫氫酶活性顯著增加。脫氫酶活性隨草酸、蘋果酸和琥珀酸質(zhì)量分數(shù)增加呈先降低后增加的趨勢，琥珀酸可使酶活性較快地從下降趨勢轉(zhuǎn)為上升趨勢[22]，琥珀酸處理土壤脫氫酶表現(xiàn)為顯著增加，本研究設(shè)置草酸和蘋果酸質(zhì)量分數(shù)未達到拐點仍處于降低階段，而草酸和蘋果酸處理的酶活性顯著降低。

添加可溶性糖和有機酸后水稻土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性顯著降低，其原因為土壤酶含有大量羧基(-COOH)和氨基(-NH2)，低分子量有機酸含有羧基(-COOH)和羥基(-OH)，相同的基團會促進有機酸對酶活性的作用，相異基團會減弱該作用；草酸、琥珀酸和蘋果酸都含有2 個羧基，蘋果酸含有1 個羥基，抑制有機酸作用于酶活性的強度，導(dǎo)致土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性顯著降低；可溶性糖含有較多羥基，與不同酸組合后的促進作用是導(dǎo)致SrO 和SrM 處理蔗糖酶活性增加的原因[23]。

水稻土壤多酚氧化酶活性顯著提高，有機酸的消耗使體系pH 上升，多酚氧化酶活性在pH 6～9 間呈迅速上升趨勢[24]；隨添加物增加，土壤含水率上升，導(dǎo)致有機質(zhì)分解過程中間產(chǎn)物多酚的積累，多酚作為多酚氧化酶的催化底物，其含量上升會刺激土壤微生物分泌多酚氧化酶[25]；Sr、M 和SrM 處理均含有較多的羥基，抑制添加物作用于酶活性的效果顯著，其他處理抑制效果弱，酶活性較強，這與以上結(jié)果吻合。纖維素酶主要降解纖維素和木質(zhì)素等難降解的物質(zhì)[26]，而本試驗中添加有機酸和糖類物質(zhì)并不含有纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)，因此導(dǎo)致纖維素酶活性下降。

3.2 添加可溶性糖和有機酸對酶活性與活性有機碳的交互影響

土壤酶是土壤生物與環(huán)境間的主要調(diào)節(jié)者，參與土壤活性有機碳的分解和轉(zhuǎn)化過程，與土壤活性有機碳含量密切相關(guān)[27]。本研究中，過氧化氫酶活性與可溶性碳含量呈極顯著負相關(guān)，脫氫酶和多酚氧化酶活性與可溶性碳含量呈極顯著正相關(guān)，這是由于可溶性有機碳和易氧化有機碳含量在土壤中周轉(zhuǎn)速度較快、較敏感，能及時反映土壤碳庫的變化[28-29]。肖燁等[30]報道土壤易氧化有機碳含量與蔗糖酶活性、纖維素酶活性和過氧化氫酶活性呈顯著正相關(guān)，與本研究結(jié)果存在差異，可能是由于添加可溶性糖和有機酸的組合利用率的不同以及微生物群落結(jié)構(gòu)的改變引起的[11]。多酚氧化酶活性與可溶性有機碳呈極顯著正相關(guān)，與易氧化有機碳含量呈顯著負相關(guān)，原因是添加可溶性糖和有機酸改變了根際環(huán)境，增加了多酚氧化酶活性，促進土壤有機質(zhì)的分解以及活性有機碳的轉(zhuǎn)化[15]，而本試驗中SrO、SrM、O 和M 處理可溶性有機碳含量顯著提高，有機酸通過促進微生物活動影響土壤有機質(zhì)的礦化作用、促進凈損失，與YUAN 等[31]的研究一致。試驗中直接添加可溶性糖和有機酸，快于水稻根系分泌到環(huán)境之中的速度，可溶性有機碳含量顯著增加，其為微生物提供充足的底物，微生物量碳含量增加顯著。易氧化有機碳含量變化趨勢不顯著，部分呈降低趨勢，相關(guān)性分析表明易氧化有機碳與多酚氧化酶呈負相關(guān)，多酚氧化酶活性對有機質(zhì)含量依賴不大[32]，其變化趨勢可能與其他酶活性共同作用有關(guān)，其機理有待深入研究。可溶性糖和有機酸含有的粘膠類物質(zhì)等，改變土壤的顆粒狀態(tài)，其有機碳組分比例較高，影響根際土壤的碳組分和含量；此外，可溶性糖和有機酸促進土壤微生物活動和代謝[33]，也間接地對土壤碳組分和含量產(chǎn)生復(fù)雜影響。

3.3 添加可溶性糖和有機酸對CH4 排放量的影響

可溶性糖和有機酸易被微生物作為碳源利用，分解成CO2、H2和CH4等氣體[34]。土壤碳排放能力的重要指標是土壤活性有機碳，尤其是可溶性有機碳、微生物量碳和易氧化有機碳，與CH4的排放密切相關(guān)；土壤厭氧微生物將植物根系提供的有機質(zhì)分解，產(chǎn)物在產(chǎn)甲烷菌的作用下生成CH4[35]。本研究發(fā)現(xiàn)：可溶性糖有機酸的輸入能夠使水稻土壤CH4排放量顯著增加，并且這種效應(yīng)的強弱依賴于可溶性糖和有機酸種類的組成。試驗處理中，輸入總碳量為0.2 mg/(g·d)時，僅有機酸加入，低分子量有機酸可直接被微生物利用，微生物量碳含量增加顯著，土壤酶活性改變，促進CH4排放；輸入碳總量為0.3 mg/(g·d)時，可溶性糖的加入使底物進一步增加，導(dǎo)致CH4排放通量和排放總量繼續(xù)增加[36-37]。由相關(guān)性分析可知：CH4排放通量與草酸和蘋果酸含量呈正相關(guān)，添加草酸和蘋果酸處理的微生物量碳含量和可溶性有機碳含量增加，CH4排放量和排放通量顯著增加，這是由于草酸和蘋果酸結(jié)構(gòu)簡單，更容易被微生物利用[38]，因此含蘋果酸和草酸處理的CH4排放量增加顯著；可溶性糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需經(jīng)分解后才可被利用，與蔗糖酶活性在有可溶性糖組合中增加吻合；添加可溶性糖增加了微生物活動的可利用底物，最終導(dǎo)致SrM 和SrO處理的CH4排放總量顯著增加?；羯徑艿萚39]研究表明：外源添加可溶性糖和有機酸體系中，易氧化有機碳含量在處理10 d 后趨于穩(wěn)定，本研究中易氧化有機碳含量表現(xiàn)為差異不顯著，有少量處理表現(xiàn)為顯著下降，由于添加的可溶性糖和有機酸均是易氧化有機碳，其在土壤中周轉(zhuǎn)快，極易被利用[40]，因此，易氧化有機碳被迅速消耗，這與關(guān)振寰等[41]的研究結(jié)果一致。研究表明：CH4產(chǎn)生途徑主要包括有機酸腐解途徑和H2-CO2還原途徑，其中，有機酸腐解途徑產(chǎn)生的CH4占總產(chǎn)量60%～76%[42-43]

相關(guān)性分析可知：微生物量碳含量與CH4排放通量呈顯著正相關(guān)，易氧化有機碳含量與CH4排放通量呈極顯著正相關(guān)，易氧化有機碳含量受草酸影響顯著，微生物量碳含量受蘋果酸影響顯著，因此CH4排放通量受蘋果酸影響顯著，草酸次之。易氧化有機碳含量與CH4排放通量呈極顯著正相關(guān)，原因是在淹水還原環(huán)境下，有機物的數(shù)量和對厭氧微生物的有效性在CH4形成過程中起著決定性作用[31]，雖然微生物量碳含量與可溶性有機碳含量同樣對CH4排放產(chǎn)生影響，但較易氧化有機碳含量影響不顯著，其原因為CH4產(chǎn)生過程較CO2更為敏感，最終的產(chǎn)生潛力受底物等較多環(huán)境因素影響[44]。由此可知，可溶性糖和有機酸的添加影響稻田土壤中有機碳的組分含量，提高稻田土壤中易氧化有機碳和微生物量碳等與CH4排放密切相關(guān)的活性有機碳的含量[45]，進而影響到CH4的產(chǎn)生，增加CH4的排放量。

水稻根系分泌物釋放改變土壤活性有機碳的組分，為土壤CH4產(chǎn)生提供重要底物；根際土壤活性有機碳組分、含量和根際微生物直接影響CH4排放[46]。根系分泌物排放增加，土壤中活性物質(zhì)增加，進而影響微生物活性，促進CH4排放[47]。土壤有機碳具有的巨大庫容，其微小變化就會影響到碳向大氣的排放速率，進而影響大氣中溫室氣體濃度[48]。因此，土壤碳庫動態(tài)變化的研究在全球的氣候變化中具有重要地位。

4 結(jié)論

添加可溶性糖和有機酸顯著增加微生物量碳和可溶性有機碳含量，顯著增加多酚氧化酶和脫氫酶活性，降低蔗糖酶、纖維素酶和過氧化氫酶活性。蘋果酸處理對CH4排放的促進效果顯著，草酸次之。添加可溶性糖和有機酸通過改變土壤碳含量和酶活性，進而影響CH4排放量和排放通量。