武小霞 崔紀超 鐘玉揚 余金姜 顏墩煒 朱錦樂 鄭建揚 中奕

(1莆田市農(nóng)業(yè)科學研究所 福建莆田 351144;2莆田市農(nóng)業(yè)技術推廣站 福建莆田 351100)

甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam．］起源于熱帶南美洲地區(qū)，在100多個國家和地區(qū)廣泛種植，是世界第七大重要農(nóng)作物，中國第四大重要糧食作物，在基本谷物食品短缺時期，成為許多中國人的主要食物來源［1-2］。中國甘薯種植面積和總產(chǎn)量均為世界第一［3-4］，但目前育成的甘薯品種中，幾乎都有南瑞苕和勝利百號的血緣，狹窄的遺傳基礎導致選育突破性的新品種較為困難［5-6］。分子標記有助于了解甘薯遺傳背景和品種間差異，為種質(zhì)資源的合理利用提供參考依據(jù)［7］。ISSR（Inter simple sequence repeat）分子標記由于其簡單、快速、高效、可重復性較高的特點而被廣泛應用［8］。宋吉軒等［9］利用ISSR分析貴州甘薯地方品種遺傳多樣性，明晰其親緣關系；張安世等［10］采用ISSR分子標記技術構建22個甘薯品種的指紋圖譜；羅文彬等［11］明確了34份具有代表性的甘薯種質(zhì)材料的遺傳背景；李強等［12-13］分析了62份甘薯主要親本及中國26份主要育成品種的遺傳多樣性，明確了其遺傳差異。同時，ISSR標記也在不同類型的甘薯中得以應用，如陳新起等［14］分析了10個菜用甘薯材料的遺傳多樣性和親緣關系；季志仙等［15］將17份材料劃分為4個組群，表明甘薯主要食用品種間具有較好的遺傳多樣性；研究表明，紫薯和紅黃薯具有明顯不同的來源和系統(tǒng)演化關系［16］。目前對福建省甘薯育成品種親緣關系沒有系統(tǒng)的研究。本研究利用ISSR分子標記對福建省甘薯育成品種進行遺傳多樣性和聚類分析，明晰其親緣關系，進而為提高甘薯育種效率及育種過程親本的選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

20份甘薯品種（表1）種植于福建省莆田市農(nóng)業(yè)科學研究所清前試驗基地。

表1 二十份甘薯品種信息

1.1.2 儀器及試劑

高通量組織研磨儀（美壁MB-48）、水平電泳槽（DYCP-33A，北京六一有限公司）、移液器（Eppendorf，德國）、PCR儀（GENESY96T）、離心機（TCL-16M）、冰箱（SIEMENS，德國）、紫外分光光度計（UVmini-1240，日本島津）和凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD GELDOCTMXR+，美國）。磁珠法基因組DNA抽提試劑盒、ISSR引物、瓊脂糖B、5XTBE緩沖液、DNA分子量標準Marker、Taq PCR Mix預混液（2×，不含染料）和4S Gel Red核酸染料均采購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘薯基因組DNA的提取

用磁珠法基因組DNA抽提試劑盒（植物）提取甘薯新鮮葉片總DNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測，并用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 ISSR引物篩選

ISSR引物來源于已報道的甘薯資源中使用的ISSR引物，以4個樣品DNA模板進行初篩，選擇多態(tài)性豐富、條帶較為清晰的引物。

1.2.3 PCR擴增

PCR反應體系50μL：DNA模板2μL，ISSR引物4μL，Taq PCR Mix預混液（2×，不含染料）25μL，蒸餾水19μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃1 min，54℃45 s（依據(jù)引物而定），72℃1.5 min，進行40個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測后，用凝膠成像儀拍照。

1.2.4 統(tǒng)計分析

用Image Lab軟件對擴增條帶進行讀帶，某一位置有擴增條帶記為“1”，無擴增條帶記為“0”，將統(tǒng)計結果用NTSYS 2.10進行分析。

2 結果與分析

2.1 ISSR引物篩選

4份品種的DNA對已報道的甘薯ISSR引物進行初篩，最終選擇出多態(tài)性豐富、條帶較為清晰的6個引物（表2），對20份甘薯材料進行擴增。

2.2 ISSR引物多態(tài)性信息

6個引物共獲得擴增條帶88條，多態(tài)性條帶74條（表2），多態(tài)率達84.091%。其中引物UBC859擴增條帶最多，為17條；引物UBC899和UBC900擴增條帶均為16條，多態(tài)率可達100%，部分引物擴增結果見圖1。

表2 ISSR引物信息

圖1 部分引物擴增結果

2.3 聚類分析

20份甘薯品種間的遺傳相似系數(shù)在0.636～0.886（表3），平均遺傳相似系數(shù)為0.744，表明這些甘薯育成品種間遺傳關系較近。福菜薯18號和泉薯10號相似度最大，達0.886；金山75和龍薯601、莆紫薯18相似度最低，表明其遺傳差異相對較大。

聚類分析表明，基于6個ISSR分子標記，在遺傳相似系數(shù)為0.715時，可將20份甘薯育成品種分為三類（圖2），其中莆紫薯18為第一類，金山75為第二類，其余均被分到第三類。莆紫薯18親本為夏引1號集團雜交中間材料和泉薯2號。夏引1號由美國夏威夷引進，可能由于地域相差較遠，故獨自為一類。金山75為金山57放任授粉，其它品種親本材料中也有金山57的血緣，如龍薯15號和龍薯9號，但金山75獨自為一類，有可能是各育種單位在相互引種的過程中導致材料的混雜。福寧紫3號和福薯404，龍薯601和龍薯9號，莆薯16和莆薯20可能由于地域較近聚在一起；福菜薯18號和泉薯10號由不同育種單位選育，但可能由于母本均為泉薯系列，遺傳背景較為相似，故聚在一起；龍薯15號和龍薯9號親本來源均為巖薯5號/金山57，但其聚類結果相差較遠。由于甘薯為同源六倍體，基因組較大，為更加全面地利用甘薯基因組的信息，應增加分子標記的數(shù)量，同時結合其它類型的分子標記，使得聚類分析結果更為準確可靠。

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圖2 甘薯育成品種的聚類分析結果

3 討論與結論

3.1 討論

本研究分析了20份福建省2000年以來的育成品種，涵蓋福建省各甘薯育種單位、各種類型的甘薯種質(zhì)資源。通過ISSR標記對這些品種資源進行遺傳多樣性分析，6個引物共獲得擴增條帶88條，多態(tài)性條帶74條，多態(tài)率達84.091%，這些資源間平均遺傳相似系數(shù)為0.744，遺傳關系較近。

近年來分子標記技術被廣泛應用于甘薯資源遺傳多樣性和親緣關系的研究中，以期為甘薯的資源鑒定和育種改良提供分子水平的技術支撐。不同類型甘薯種質(zhì)資源的遺傳距離不同，基于ISSR分子標記，來源于四川、廣西、山東、河南、江蘇、廣東和福建等84份育成品種的平均遺傳距離為0.167 0，主要來源于福建、廣東和廣西的28份地方品種的平均遺傳距離為0.196 8；12份引自日本、菲律賓和美國等地的引進品種的平均遺傳距離為0.179 1［17］。張超凡等［18］的研究中，11份湖南甘薯育成品種平均遺傳距離0.511 5；20份湖南甘薯地方品種間平均遺傳距離0.524 0。相對于引進品種和地方品種，中國育成品種遺傳基礎狹窄及骨干基因的單一性，導致育成品種的遺傳多樣性降低［5，15］；但李強等［13］認為，來自亞洲的中國甘薯主要親本的遺傳多樣性和遺傳差異高于來自非洲和美洲的，而且提出中國1990年后育成品種比之前育成品種的遺傳差異有增大的趨勢。南文卓等［19］研究結果顯示，30份海南地區(qū)引種甘薯種質(zhì)資源平均遺傳相似性系數(shù)為0.62，認為甘薯品種間遺傳多樣性較豐富。蘇一鈞等［20］研究顯示，303份甘薯地方種材料的遺傳距離為0.028～0.947，平均遺傳距離為0.564，認為其遺傳多樣性更為豐富。45份貴州甘薯（包含地方和引進品種）種質(zhì)資源平均變異系數(shù)為0.4，遺傳關系較近［9］。趙冬蘭等［21］研究顯示，24份材料的平均相似系數(shù)為0.74，表明中國的甘薯品種種質(zhì)資源比較豐富；同時，研究認為，不同功能類型的甘薯資源遺傳差異較大?；赟SR標記的76份紫心甘薯品種表現(xiàn)出一定的分化趨勢，即遺傳背景有擴大的趨勢［22］。陳新起等［14］研究顯示，10份菜用甘薯種質(zhì)平均遺傳相似系數(shù)為0.645，認為其遺傳差異較大。甘薯主要食用品種具有較好的遺傳多樣性［15］。不同的研究對于甘薯資源遺傳多樣性的看法與結論不同，可能是因為研究的材料類型、來源以及地域背景不同，且所選擇的群體大小有所差異，同時所應用到的分子標記種類和數(shù)量也有可能導致該現(xiàn)象。本研究中的20份材料均為福建省近年來的育成品種，且其親本來源以本省育成品種為主，故其遺傳相似系數(shù)較大，親緣關系較近。

3.2 結論

20份福建省育成品種間遺傳相似性較大，親緣關系較近。在之后的研究工作中應純化研究材料，擴大群體，增加不同類型的種質(zhì)資源，豐富分子標記的類型與數(shù)量，以便更為全面地分析本省的甘薯資源遺傳關系。在育種工作中加大親本選擇力度，選擇親緣關系遠的親本，創(chuàng)制優(yōu)勢雜交組合，突破遺傳局限性；同時應充分挖掘地方品種資源的應用潛力，特別是其與育成品種間應充分發(fā)掘利用。