楊智勇，姜旭，朱紅

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110004）

糖尿病是一個(gè)全球性健康問題，預(yù)計(jì)到2030年將會(huì)有超過5億5千萬人罹患糖尿病，其最主要的一個(gè)并發(fā)癥是心血管疾病，在糖尿病患者死亡原因中占2/3以上［1-3］。高糖狀態(tài)下，心肌細(xì)胞病理生理狀態(tài)改變導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維化進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而引發(fā)心肌功能障礙，若不及時(shí)干預(yù)，極易進(jìn)展成糖尿病心肌病，進(jìn)而引發(fā)全心衰竭［2］。心肌細(xì)胞在高糖狀態(tài)下發(fā)生上述變化的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究［4］顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激深度參與其中，糖尿病患者產(chǎn)生的高水平活性氧（reactive oxygen species，ROS）與體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)不平衡，過量的ROS攻擊心肌細(xì)胞，加速其凋亡的速度。持續(xù)高血糖狀態(tài)還可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活分子伴侶糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）參與的未折疊蛋白反應(yīng)，啟動(dòng)程序性細(xì)胞凋亡［5］。高糖狀態(tài)下，心肌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平增高并互相協(xié)同，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，更加重了其向糖尿病心肌病的加速進(jìn)展［6］。

曲美他嗪是哌嗪類衍生物，可通過抑制心肌細(xì)胞線粒體脂肪酸的攝取，促進(jìn)葡萄糖有氧氧化提供能量，增加其抗氧化能力，并保護(hù)心肌免受ROS的損害，它對(duì)冠狀動(dòng)脈血流、心肌收縮力、心率并無影響，而是直接改善心肌能量代謝［7］。但曲美他嗪在糖尿病心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用尚不明確。本研究通過高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素的方法，建立穩(wěn)定、可靠、優(yōu)質(zhì)的糖尿病大鼠模型，并給予曲美他嗪進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)各組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵指標(biāo)，探討曲美他嗪改善糖尿病大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物建模與分組

雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～220 g，購自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有入選大鼠均飼養(yǎng)于室溫25 ℃的動(dòng)物房中，采用標(biāo)準(zhǔn)顆粒適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食水。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、糖尿病組（DM組）、糖尿病+曲美他嗪治療組（TDM組），每組10只。C組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，DM組和TDM組給予高脂飼料（D12451）進(jìn)行喂養(yǎng)。喂養(yǎng)4周后，DM組和TDM組按照30 mg/kg劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素，C組大鼠一次性腹腔注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。經(jīng)尾靜脈取血，采用氧化還原方法測(cè)定血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L并且持續(xù)穩(wěn)定3 d，為糖尿病大鼠模型建立成功。模型建立成功后，TDM組給予曲美他嗪20 mg·kg-1·d-1灌胃，C組和DM組給予等量鹽水灌胃，持續(xù)4周。記錄大鼠每周體質(zhì)量和血糖的變化情況。本研究中動(dòng)物建模及處理方法經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和藥品

鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）；高脂飼料（D12451）（京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；兔抗大鼠超氧化 物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）抗體、小鼠抗大鼠8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）抗體、兔抗大鼠Bcl-2抗體、山羊抗大鼠GRP78抗體（美國Santa Cruz公司）；HRP標(biāo)記的通用型IgG 抗體（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗山羊、山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗（上海碧云天公司）；曲美他嗪（齊魯制藥有限公司）。

1.3 免疫組化檢測(cè)心肌組織SOD-1和8-OHdG的表達(dá)

采用10%水合氯醛（3 g/kg）腹腔注射麻醉后處死大鼠。取心尖部組織，置于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，脫蠟至水，加馬血清封閉，3%過氧化氫消除外源性過氧化氫酶，用0.01 mol/L PBS漂洗3次后，分別加入以1 ∶200稀釋的兔抗大鼠SOD抗體和小鼠抗大鼠8-OHdG抗體，4 ℃過夜。然后分別用1 ∶100稀釋HRP標(biāo)記的通用型IgG抗體孵育1 h，DAB顯色。每組隨機(jī)選取8個(gè)視野，于200倍顯微鏡下觀察、攝像。采用Image-Pro Plus系統(tǒng)對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.4 Western blotting檢測(cè)心肌組織SOD、8-OHdG、Bcl-2、GRP78蛋白的表達(dá)

取大鼠心肌組織100 mg，經(jīng)研磨、裂解、勻漿、離心后，提取蛋白，采用BCA法測(cè)定提取蛋白的濃度。隨后根據(jù)濃度進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，洗 膜，加 入SOD（1 ∶1 000）、8-OHdG（1 ∶1 000）、Bcl-2（1 ∶1 000）、GRP78（1 ∶1 000）抗體4 ℃過夜孵育。洗膜后再選擇合適的二抗室溫下孵育，洗膜液洗膜。在避光條件下發(fā)光法顯色，應(yīng)用凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)掃描定量，將掃描后得到的蛋白灰度值與相應(yīng)β-actin灰度值相比，計(jì)算出各組蛋白表達(dá)的相對(duì)百分比，作為蛋白的相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)使用Dunnettt檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)使用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠模型建模的基本情況

DM組和TDM組大鼠毛發(fā)粗糙，而C組大鼠毛發(fā)順滑。干預(yù)期間，DM組大鼠死亡3只，TDM組大鼠死亡1只，C組大鼠無死亡。

統(tǒng)計(jì)建模0周和第1、2、3、4周末大鼠的體質(zhì)量和血糖。0周時(shí)，3組比較，體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）；與C組比較，DM組和TDM組血糖明顯升高（P＜ 0.05）；且DM組與TDM組比較，血糖無明顯差異（P＞ 0.05）。第1、2、3、4周末，與C組比較，DM組和TDM組大鼠體質(zhì)量均明顯降低，血糖均明顯升高（均P＜ 0.05）；且DM組與TDM組比較，體質(zhì)量和血糖均無明顯差異（均P＞ 0.05）。

C組中，大鼠體質(zhì)量隨時(shí)間增加而增長，第1、2、3、4周末體質(zhì)量均高于0周（均P＜ 0.05），且每周末測(cè)得的體質(zhì)量均高于前一時(shí)間點(diǎn)（均P＜ 0.05）；DM組中，大鼠體質(zhì)量雖然也呈現(xiàn)隨時(shí)間增加而增長的趨勢(shì)，第1、2、3、4周末體質(zhì)量均高于0周（均P＜ 0.05），但體質(zhì)量增長速度較C組下降，僅第2、3、4周末的體質(zhì)量高于第1周末（均P＜ 0.05），其余各時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較未見明顯差異（均P＞ 0.05）；TDM組中，大鼠體質(zhì)量變化不明顯，各時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較，體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞ 0.05）。3組中，各時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較，血糖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞ 0.05）。上述結(jié)果證實(shí)，DM組和TDM組糖尿病大鼠模型建模成功。

表1 3組大鼠體質(zhì)量和血糖的變化情況Tab.1 Changes in body weight and blood glucose level of rats in three groups

2.2 免疫組化檢測(cè)曲美他嗪對(duì)大鼠心肌組織中SOD表達(dá)的影響

與C組相比，DM組大鼠心肌組織中SOD表達(dá)明顯下降（P=0.001），而TDM組大鼠心肌組織SOD表達(dá)較DM組升高（P=0.012）。說明曲美他嗪可以逆轉(zhuǎn)糖尿病心肌細(xì)胞中SOD下降。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織SOD的表達(dá)和比較Fig.1 Detection and comparison of SOD expression in the myocardium of rats in each group using immunohistochemistry

2.3 免疫組化檢測(cè)曲美他嗪對(duì)大鼠心肌組織中8-OHdG表達(dá)的影響

與C組相比，DM組大鼠心肌組織中8-OHdG表達(dá)明顯升高（P=0.003），而TDM組大鼠心肌組織中8-OHdG表達(dá)較DM組降低（P=0.002）。說明曲美他嗪可以逆轉(zhuǎn)糖尿病心肌細(xì)胞中8-OHdG過度表達(dá)。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織8-OHdG表達(dá)和比較Fig.2 Detection and comparison of 8-OHdG expression in the myocardium of rats in each group using immunohistochemistry

2.4 Western blotting定量檢測(cè)曲美他嗪對(duì)大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激關(guān)鍵指標(biāo)的影響

利用Western blotting定量檢測(cè)各組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激關(guān)鍵指標(biāo)SOD、8-OHdG、Bcl-2和GRP78蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示，與C組比較，DM組中SOD、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，8-OHdG、GRP78蛋白表達(dá)水平明顯升高，而TDM組SOD、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于DM組，8-OHdG、GRP78蛋白表達(dá)水平明顯低于DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05）。說明曲美他嗪可以逆轉(zhuǎn)糖尿病時(shí)心肌組織中氧化應(yīng)激水平的升高。見圖3。

圖3 Western blotting檢測(cè)各組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激關(guān)鍵指標(biāo)Fig.3 Detection and comparison of oxidative stress key indicators in the myocardium of rats in each group using Western blotting

3 討論

糖尿病是一種以慢性代謝性紊亂為表現(xiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，因代謝失調(diào)和氧化應(yīng)激可引發(fā)一系列并發(fā)癥，包括心肌病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變和腎病。在無高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病的情況下出現(xiàn)的心肌功能障礙被稱為糖尿病心肌病，早期表現(xiàn)為左心室舒張功能損傷，伴有心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)而出現(xiàn)收縮功能障礙。糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，目前已知有糖代謝、脂代謝、鈣調(diào)節(jié)異常、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體自噬等多種因素參與［8-9］，如果不在糖尿病早期心肌細(xì)胞病變時(shí)及時(shí)干預(yù)，會(huì)造成嚴(yán)重不良后果。

氧化應(yīng)激在糖尿病心肌細(xì)胞損傷及糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS與機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)不平衡，過量的活性氮介導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)及核酸損傷，引發(fā)細(xì)胞凋亡，從而引起組織器官功能障礙［10］。SOD是抵抗ROS 的第一道防線，可降低細(xì)胞內(nèi)外ROS水平，具有抗氧化作用，能夠有效的抑制氧化應(yīng)激。ROS介導(dǎo)的DNA損傷在修復(fù)過程產(chǎn)生鳥嘌呤修飾產(chǎn)物8-OHdG，鳥嘌呤在DNA堿基中氧化性最強(qiáng)，因此8-OHdG可作為DNA氧化性損傷的標(biāo)志物。心肌組織中8-OHdG水平，可以反映氧化應(yīng)激造成心肌損傷的程度［11］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心肌組織SOD蛋白表達(dá)下降，8-OHdG表達(dá)增多，表明氧化應(yīng)激途徑可能參與了糖尿病心肌組織損傷的過程。

糖尿病導(dǎo)致的持續(xù)高血糖狀態(tài)使心肌細(xì)胞內(nèi)未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集，鈣離子穩(wěn)態(tài)和氧化還原狀態(tài)失衡等都會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的改變，當(dāng)超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力時(shí)會(huì)觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，啟動(dòng)程序性細(xì)胞調(diào)亡，引起炎癥反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的啟動(dòng)可激活由分子伴侶GRP78參與的未折疊蛋白反應(yīng)。研究［12］指出，糖尿病大鼠出現(xiàn)心肌舒張功能降低的同時(shí)，心肌組織中GRP78升高。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心肌組織GRP78蛋白表達(dá)增多，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了糖尿病心肌病心肌組織損傷的過程。

糖尿病心肌組織的高氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平共同作用，進(jìn)一步加劇了心肌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)展至終末期可導(dǎo)致心肌收縮和舒張功能障礙。研究［13］表明，細(xì)胞凋亡Bcl-2家族是參與細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，能夠通過促進(jìn)和抑制凋亡的基因相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程。Bcl-2存在于線粒體內(nèi)，通過阻止細(xì)胞色素C釋放，抑制細(xì)胞凋亡和延長細(xì)胞存活時(shí)間，發(fā)揮抑制心肌組織凋亡的作用。高血糖可引起心肌組織中Bcl-2減少，加速心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，糖尿病會(huì)引起心肌細(xì)胞Bcl-2減少，加劇心肌細(xì)胞凋亡。

因此，延緩糖尿病心肌病進(jìn)展的關(guān)鍵之一，是有效抑制糖尿病心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡。曲美他嗪是治療心絞痛的臨床常用藥，其在心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)通過抑制長鏈3酮酰輔酶A 硫解酶，減少脂肪酸氧化攝取，提高葡萄糖氧化供能，改善心肌能量代謝，發(fā)揮抗缺血效應(yīng)。糖尿病心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用受損，胰島素信號(hào)通路發(fā)生改變，導(dǎo)致心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用降低，增加了游離脂肪酸含量，促進(jìn)動(dòng)脈硬化形成，導(dǎo)致心肌彌漫性損傷［14-15］。曲美他嗪通過維持細(xì)胞膜磷脂合成功能、抑制鈣超載、防止線粒體損傷，對(duì)糖尿病心肌細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激起到抵抗作用，減少心肌細(xì)胞凋亡，在預(yù)防和治療糖尿病心肌病中已經(jīng)取得良好的療效［12］。但曲美他嗪對(duì)糖尿病心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用及其機(jī)制的研究尚待完善。

本研究通過建立糖尿病大鼠模型，給予曲美他嗪干預(yù)，檢測(cè)各組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡指標(biāo)。結(jié)果證實(shí)，曲美他嗪處理組大鼠心肌組織SOD、Bcl-2的表達(dá)升高，而8-OHdG、GRP78的表達(dá)降低。說明曲美他嗪能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌組織起保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制糖尿病大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。

綜上所述，曲美他嗪升高糖尿病大鼠心肌組織中SOD、Bcl-2的表達(dá)，降低8-OHdG、GRP78的表達(dá)，可能通過抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)心肌起保護(hù)作用。上述指標(biāo)的具體作用機(jī)制，今后需進(jìn)一步深入研究。