張雪，楊樹(shù)林，邢一凡，張盛帆，李文婧，王憲昊，曲星雯，楊帆

（1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 公共衛(wèi)生學(xué)院，山東泰安 271016；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東泰安 271000）

狂躁抑郁雙向情感障礙是一種兼有抑郁和狂躁，且?；旌稀⒔惶娣磸?fù)發(fā)作的疾病，有文獻(xiàn)報(bào)道，腸道菌群可能通過(guò)其代謝產(chǎn)物色氨酸對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起調(diào)節(jié)作用，從而引起宿主精神行為改變,并導(dǎo)致抑郁發(fā)生或加重[1]。本研究通過(guò)造模建立抑郁模型小鼠，并通過(guò)宏基因組測(cè)序技術(shù)研究抑郁癥小鼠與正常對(duì)照小鼠腸道菌群的微生物生態(tài)學(xué)特征，尋找兩組小鼠腸道菌群的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇4 周齡SPF 級(jí)雌性小鼠20 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 試劑與儀器

苯甲酸雌二醇注射液（規(guī)格：2 mL；4 mg），岑氏，杭州動(dòng)物藥品廠(chǎng)；BSA323S 電子天平，賽多利斯。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，通過(guò)金屬耳標(biāo)編號(hào)，對(duì)照組為1 ～10 號(hào)，實(shí)驗(yàn)組為11 ～20 號(hào)。

1.3.2 操作

體重檢測(cè)：測(cè)定體重前，將電子秤清潔并固定好，輕輕抓取小鼠，不要沾有墊料，將小鼠放在稱(chēng)重盤(pán)內(nèi)，待示數(shù)穩(wěn)定后讀數(shù)并記錄；試驗(yàn)開(kāi)始后，連續(xù)記錄9 天。

飲食量檢測(cè)：每日飼喂實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組定量、足量鼠糧，第二天稱(chēng)量剩余鼠糧質(zhì)量，并計(jì)算各組的每日食量；記錄飲食第2 天后注射雌激素，連續(xù)記錄9 天。

皮下注射：小鼠背部進(jìn)針，進(jìn)行皮下注射。每2天注射一次，每只小鼠每次注射0.05 mL 苯甲酸雌二醇，共注射6 次，為期12 天。

新物體識(shí)別測(cè)試：將小鼠放在潔凈的放有未知物體的飼養(yǎng)籠中，用錄像設(shè)備記錄10 分鐘內(nèi)小鼠與物體的接觸情況，并計(jì)數(shù)接觸的次數(shù)；通過(guò)統(tǒng)計(jì)接觸次數(shù)的差異，分析小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

糞便采集及送檢：在造模前后分別采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠糞便，直接抓取小鼠，小鼠受刺激自然排便后，將糞便放入無(wú)菌EP 管中。將糞便保存在-80 ℃冰箱中，干冰保存送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進(jìn)行16S rDNA 微生物分類(lèi)測(cè)序與糞便菌群分析。

16S rDNA 微生物分類(lèi)測(cè)序與分析：本步驟由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，基本過(guò)程包括：樣品的預(yù)處理；提取DNA；第一輪PCR 擴(kuò)增；第二輪PCR 擴(kuò)增；DNA 純化回收；定量混合；上機(jī)測(cè)序；軟件分析。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間小鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化采用t-test 分析；腸道菌群豐度多組間比較采用Welch's t-test 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組體重記錄數(shù)據(jù)見(jiàn)表1 和表2，由表1 和表2 數(shù)據(jù)可知對(duì)照組小鼠與實(shí)驗(yàn)組小鼠體重在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。

表1 對(duì)照組小鼠體重 單位：g

表2 實(shí)驗(yàn)組小鼠體重 單位：g

2.2 飲食

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中飲食量數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，由表3 數(shù)據(jù)可得，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組飲食量均存在不同程度的波動(dòng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠飲食量波動(dòng)較大，平均值小于對(duì)照組。

表3 飼喂1 ～9 天對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠飲食量 單位：g

2.3 學(xué)習(xí)記憶能力變化

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t-test 進(jìn)行分析，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)顯著性差異，P值分別為0.103 2（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組小鼠造模前后以及造模后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠新物體識(shí)別能力均有顯著差異，P值分別為0.004 9 和0.000 1（P＜0.05），說(shuō)明造模成功（見(jiàn)表4 和表5）。

表4 試驗(yàn)前后對(duì)照組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

表5 造模前后實(shí)驗(yàn)組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

2.4 菌群基因組測(cè)序

2.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)

通過(guò)對(duì)對(duì)照組（HC）和實(shí)驗(yàn)組（HA）兩組共計(jì)4個(gè)樣本（HC2、HC5、HA12 和HA17）進(jìn)行16S rDNA測(cè)序、數(shù)據(jù)質(zhì)控后，共得到有效序列377 695 條，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別得到優(yōu)化序列197 398 條和180 297 條，對(duì)照組平均長(zhǎng)度為421.15 bp，實(shí)驗(yàn)組平均長(zhǎng)度為420.65 bp（見(jiàn)表6）。

表6 各樣本有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.4.2 OUT 聚類(lèi)分析

對(duì)97%相似水平下的操作單元分類(lèi)（Operational Taxonomic Unit，OTU）進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖1 所示。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組共有566 個(gè)OTU，兩組共有的OTU 為434，約占OUT 總數(shù)的76.7%；實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有的OTU 為50，對(duì)照組獨(dú)有的OUT 為82；HA 組共有484個(gè)OTU，對(duì)照組共有516個(gè)OUT。由圖1可知，大多菌群為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組兩組共有，對(duì)照組OUT總數(shù)略多于實(shí)驗(yàn)組，即對(duì)照組種群多樣性略大于實(shí)驗(yàn)組。

圖1 樣本OUT 分布韋恩圖

2.4.3 Alpha 指數(shù)分析

在OTU 的基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算Shannon 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Ace 指數(shù)以及Simpson 指數(shù)分析單個(gè)樣品的多樣性。樣品的多樣性可分為物種豐度和物種均勻度，若前面三項(xiàng)指數(shù)越大，最后一項(xiàng)指數(shù)越小，則表明樣品中的多樣性越豐富。樣本HA12、HA17、HC2 和HC5 的Alpha 多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表7 所示。

由 表7 可 知，Shannon、Chao 和Ace 指 數(shù) 中對(duì)照組的兩樣本數(shù)值均比實(shí)驗(yàn)組組要高，最后一項(xiàng)Simpson 指標(biāo)對(duì)照組數(shù)值比實(shí)驗(yàn)組要低，說(shuō)明對(duì)照組物種多樣性整體大于實(shí)驗(yàn)組。

表7 Alpha 多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4.4 稀釋曲線(xiàn)分析

稀釋曲線(xiàn)是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計(jì)這些序列對(duì)應(yīng)樣Alpha 多樣性指數(shù)，以抽取的數(shù)據(jù)量為橫軸，以Alpha多樣性指數(shù)值為縱軸繪制曲線(xiàn)，根據(jù)曲線(xiàn)是否達(dá)到平緩或達(dá)到平臺(tái)期來(lái)判斷本次測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足夠。

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Alpha 指數(shù)對(duì)應(yīng)的稀釋曲線(xiàn)如圖2 和圖3 所示。由圖2 和圖3 可知，指數(shù)稀釋性曲線(xiàn)指向一致且趨向平坦，證明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠。

圖2 HC 組Alpha 指數(shù)稀釋曲線(xiàn)

圖3 HA 組Alpha 指數(shù)稀釋曲線(xiàn)

2.4.5 群落結(jié)構(gòu)差異分析

2.4.5.1 物種相對(duì)豐度圖

采用Welch's t-test 分析方法，分析樣本在不同分類(lèi)水平上的群落結(jié)構(gòu)。將多個(gè)樣本的群落結(jié)構(gòu)分析放在一起對(duì)比，使用較直觀(guān)的柱狀圖顯示，并將在所有樣本中豐度占比均小于1%的物種歸為others，其余的作為優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行分析。

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組基于門(mén)（Phylum）和屬（Genus）分類(lèi)水平的結(jié)果如圖4 和圖5 所示。由圖4 可知，在門(mén)水平，HC、HA 兩組樣品的優(yōu)勢(shì)菌落可分為5 大類(lèi)：厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、脫鐵桿菌門(mén)（Deferribacteres）和放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）。其中，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在兩組樣品中占絕大多數(shù)，且在HA 組中擬桿菌門(mén)含量大于HC 組，厚壁菌門(mén)含量少于HC 組。

圖4 門(mén)水平的分析柱狀圖

由圖5 可知，在屬水平，HC、HA 兩組樣品的優(yōu)勢(shì)菌落可分為22 個(gè)屬。對(duì)照組占比前5 位的菌屬分別是乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、別普雷沃菌屬（Alloprevotella）、阿利斯蒂普斯屬（Alistipes）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和螺桿菌屬（Helicobacter）；實(shí)驗(yàn)組占比前5 位的菌屬分別是乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、巴內(nèi)西埃拉屬（Barnesiella）、土桿菌屬（Turicibacter）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和類(lèi)桿菌屬（Bacteroides）。

圖5 屬水平的分析柱狀圖

2.4.5.2 Welch's t-test 分析

STAMP 差異分析用于比較兩組樣本之間物種或功能的豐度，通過(guò)此分析可獲得顯著性差異物種或功能以及該物種或功能更趨向何種環(huán)境條件下的樣本。當(dāng)比較對(duì)象為組時(shí)，采用Welch's t-test，結(jié)果如圖6所示。由圖6 可知，g_unclassified_Enterobacteriaceae和g_Roseburia 兩個(gè)屬在對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組兩組間有顯著性差異，P值分別為0.023 和0.004（P＜0.05）。

圖6 Welch's t-test 分析

3 討論

近年來(lái)，隨著當(dāng)代社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)壓力逐年上升，抑郁癥的發(fā)病率也隨之上升[2]，因此抑郁癥的相關(guān)發(fā)病及其防治機(jī)制的研究已經(jīng)成為艱巨且緊迫的任務(wù)。抑郁病人大多數(shù)存在食欲下降和體重減輕的軀體癥狀，也會(huì)出現(xiàn)記憶力下降、興致低迷以及認(rèn)知功能障礙等變化[3]，因此當(dāng)小鼠被給予外源性雌激素時(shí)，可造成小鼠體內(nèi)高雌激素狀態(tài)，從而出現(xiàn)行為學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 的異常變化[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射苯甲酸雌二醇使小鼠體內(nèi)形成高雌激素的病理狀態(tài)，小鼠會(huì)在體重、體溫、飲食等生理狀態(tài)以及學(xué)習(xí)能力等行為學(xué)方面表現(xiàn)出組內(nèi)和組間的變化[5-6]。對(duì)造模成功的小鼠抑郁模型進(jìn)行糞便取樣，通過(guò)宏基因組測(cè)序探究抑郁小鼠與對(duì)照組之間菌群生態(tài)學(xué)的異同。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)雌性小鼠長(zhǎng)期處于高雌激素的病理狀態(tài)下，會(huì)出現(xiàn)體重增長(zhǎng)變慢、食欲降低以及學(xué)習(xí)記憶能力減退等抑郁樣表現(xiàn)。根據(jù)OUT 聚類(lèi)分析，大多菌群為HA、HC 兩組共有，但HC 組OUT 總數(shù)略多于HA 組，表明HC 組種群多樣性略大于HA 組；Alpha 指數(shù)分析結(jié)果也說(shuō)明HC 組物種多樣性整體大于HA 組；對(duì)菌群物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以及Welch's t-test 分析可知，g_unclassified_Enterobacteriaceae 和g_Roseburia 兩個(gè)屬在HC、HA 兩組間有顯著差異（P＜0.05）。

當(dāng)人體出現(xiàn)腹瀉時(shí)，腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）在糞便菌群測(cè)定中高于正常菌群，同時(shí)測(cè)定5-HT 含量也高于正常菌群[7]，因此可對(duì)二者的相關(guān)性進(jìn)一步探究。目前已有研究針對(duì)“腦-腸-微生物”軸影響大腦神經(jīng)的機(jī)制進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)將普通小鼠的糞便移植于無(wú)菌小鼠后，其中樞5-HT 代謝異?？刹糠帜孓D(zhuǎn)，這些腸道微生物所介導(dǎo)的神經(jīng)生化改變，與抑郁癥患者所伴有的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA 軸）失調(diào)相契合，從分子層面提示腸道微生物紊亂可能與抑郁發(fā)生相關(guān)[8]。在潰瘍性結(jié)腸炎治療的相關(guān)研究中，丁酸生成細(xì)菌（Roseburia intestinalis，R.I）鞭毛蛋白起到了一定的抗炎作用[9]，說(shuō)明抑郁癥相關(guān)菌屬在炎癥性腸病中也有著至關(guān)重要的作用，可為抑郁癥及其并發(fā)腸道疾病的藥物研發(fā)以及療效監(jiān)測(cè)提供相關(guān)思路。

4 結(jié)論

小鼠長(zhǎng)期處于高雌激素的病理狀態(tài)下會(huì)導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生，抑郁小鼠腸道菌群多樣性小于正常小鼠，其豐度在界、門(mén)、綱、目、科這些層面上表現(xiàn)出統(tǒng)一性，而在菌屬層面上（g_unclassified_Enterobacteriaceae 和g_Roseburia）差異性明顯。