許為義，曹思宇，陳菡雯，孫 晨，劉 莉，伍 鑫，王玉明

(合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

0 引言

硒對(duì)人體健康和生理代謝起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[1].Larry C.Clark研究發(fā)現(xiàn)，每日補(bǔ)充200 μg硒可將癌癥發(fā)病率降低37%、死亡率降低50%.美國食品藥品監(jiān)管局(FDA)將硒稱為抑癌劑[2-3].《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》推薦成年人日均攝入硒元素60 μg，但實(shí)際中國居民日均攝入量僅44 μg，低于最低參照攝入量(50 μg·d-1)[4]，這潛在增加了國民患心血管、癌癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn).

自然食物有機(jī)硒是居民攝入有效硒最便捷和安全途徑，為踐行“健康中國”的國策使命，研究者們深入開展植物富硒性能、機(jī)制及影響因素等研究工作，積極研發(fā)多種安全健康的優(yōu)質(zhì)富硒農(nóng)產(chǎn)品，包括富硒茶、富硒大米、富硒辣椒等農(nóng)作物.相關(guān)研究表明，自然植物富硒量與植物品種、土壤母質(zhì)自然硒含量及理化特性有關(guān)，Lin[5]等人發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤硒濃度為25 mg·kg-1時(shí)，甜菜富硒量達(dá)到峰值；王銳[6]等人證實(shí)玉米富硒土壤閾值是0.3 mg·kg-1，水稻在土壤pH≤7.5時(shí)富硒土壤閾值是0.3 mg·kg-1，而在pH>7.5時(shí)以0.4 mg·kg-1為富硒土壤閾值.

然而，農(nóng)作物耕種最常施用的農(nóng)藥，其對(duì)植物富硒能力的影響研究報(bào)道甚少.本文選擇廣泛分布于南亞、東南亞、東亞的富硒能力較好且富含多種維生素和鈣、鐵等營養(yǎng)元素，并具有利便、清熱、解毒功效的藥食同源蔬菜木耳菜為試驗(yàn)品種，試圖探索農(nóng)林業(yè)中廣泛使用的“綠色除草劑”[7]草甘膦和擬除蟲菊酯類殺蟲劑氯氰菊酯[8]，對(duì)基于不同基質(zhì)(火山巖和土壤基質(zhì))上生長的木耳菜富硒能力的影響，以便科學(xué)地指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料和試劑

實(shí)驗(yàn)土壤取自于皖南宣城市(N30°54′19.66″，E118°42′46.69″)宣州區(qū)的黃棕壤，其有機(jī)質(zhì)含量為2.13%，pH值為5.00[9-10]，土壤肥力較高，適于種植糧食和經(jīng)濟(jì)作物[15].實(shí)驗(yàn)區(qū)域?qū)儆趤啛釒駶櫦撅L(fēng)氣候，水熱條件好，地質(zhì)調(diào)查揭示地區(qū)富硒土壤(0.4 mg·kg-1)占比約43%，土壤理化性質(zhì)類似于湖北恩施.

實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)設(shè)計(jì)兩種不同性質(zhì)基質(zhì)：土壤基質(zhì)和火山巖基質(zhì)，其中土壤基質(zhì)配比構(gòu)成(分兩個(gè)階段添加農(nóng)藥)和火山巖基質(zhì)配比構(gòu)成見表1.

表1 土壤培養(yǎng)基農(nóng)藥施加情況

表2 火山巖培養(yǎng)基農(nóng)藥施加情況

1.1.2 儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)用主要儀器：電子天平(JA2003B，上海越平)；pH計(jì)(PHS-3C上海雷磁)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2，金壇杰瑞爾)；去離子水系統(tǒng)(752N，上海精科)；植物破碎機(jī)(FSH-2A，VRera，南京)；紫外分光光度計(jì)(752 N，上海精科)；土壤培養(yǎng)皿(規(guī)格：185×180×145 mm，北京仁創(chuàng)科技集團(tuán)有限公司)；火山巖培養(yǎng)皿(規(guī)格：185×190×200 mm).

酵母硒(有效硒含量為3 000 ppm，武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司)；草甘膦(總有效成分為93%，重慶豐化科技有限公司)；氯氰菊酯(含4.5%乳油，河南省金旺生化有限公司)；鄰苯二胺(AR100，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；甲苯(AR，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；EDTA-2Na(AR100，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；濃硝酸(GR，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；鹽酸(GR，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；高氯酸(GR，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；氨水(AR，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司).

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)分兩階段進(jìn)行.第一階段在不同的基質(zhì)中，探究同濃度梯度下草甘膦的富硒能力；第二階段在相同培養(yǎng)基(土壤)中，探究相同濃度梯度的農(nóng)藥草甘膦和殺蟲劑氯氰菊酯對(duì)木耳菜富硒能力的影響.

1.1.1 第一階段

該階段僅于出芽后24 d時(shí)采樣一次，設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組和5個(gè)實(shí)驗(yàn)組(土壤組A-F與a-f為實(shí)驗(yàn)條件完全相同的兩組，在第一階段取a-f結(jié)果，A-F僅用于對(duì)比檢驗(yàn)).以土壤硒均值5.5 mg·kg-1為標(biāo)準(zhǔn)，且在保證兩種培養(yǎng)基內(nèi)單位體積的硒含量相等的條件下，每個(gè)培養(yǎng)基投加有機(jī)硒含量為3 000 ppm的酵母硒1.962 g.根據(jù)該款草甘膦的推薦使用濃度82～118 g/畝求得培養(yǎng)基最佳使用量，并以最適濃度為基準(zhǔn)按25%濃度梯度增加和遞減分別向兩種培養(yǎng)基進(jìn)行投加(表1～2).需要注意的是，由于草甘膦可能抑制種子的萌發(fā)，故需將培養(yǎng)基質(zhì)放置3 d后再加入木耳菜種子，為提高幼苗成活率，本實(shí)驗(yàn)在種子出芽后第4 d和第10 d添加生根劑、第7 d和第14 d添加植物營養(yǎng)液，添加量均為最適用量.

1.1.2 第二階段

第二階段實(shí)驗(yàn)組與空白組設(shè)置與第一階段相同，在第一階段采樣完成后，于a-f、A-F的基礎(chǔ)上分別繼續(xù)添加草甘膦和氯氰菊酯.有研究表明，草甘膦在土壤中的半衰期為1～174 d(一般取60 d)[11]，且在含水量為60%的酸性土壤中16 d即可降解80%以上[12].因此，可認(rèn)為首次添加的草甘膦不會(huì)對(duì)本次施加的草甘膦或氯氰菊酯造成影響.根據(jù)該款氯氰菊酯的推薦使用濃度40 mL/畝求得培養(yǎng)基最佳使用量，并以最適濃度為基準(zhǔn)按25%濃度梯度增加和遞減投加至土壤培養(yǎng)基.本實(shí)驗(yàn)階段自出芽后第27 d起采樣，采樣間隔為7 d，共采集10次.

1.2 樣品采集與處理

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

土壤培養(yǎng)基隨機(jī)取自研究區(qū)內(nèi)表層土，采樣深度為10 cm，去除土壤表面雜草、土壤中殘留根莖，經(jīng)日曬、風(fēng)干、除雜、碾碎、混合后，以每個(gè)土壤培養(yǎng)皿1 070 g分樣.

火山巖培養(yǎng)基采用吸水性為65%、pH為5～7的火山巖，以每個(gè)火山巖培養(yǎng)皿830 g分樣，上層覆等量薄土.

1.2.2 樣品的自然培育

本實(shí)驗(yàn)中木耳菜播種至培養(yǎng)基后，均于室外自然條件下培育，并配合人工灌溉.灌溉采用筆者自主研制的自動(dòng)灌溉裝置，每日于晨間8時(shí)、午間12時(shí)及晚間6時(shí)各灌溉一次，每次持續(xù)1 min(水量約60～70 ml).

1.2.3 樣品采集

初次采樣時(shí)間為出芽后24 d，此后另分階段于出芽后第27、34、41、48、55、62、69、76、83和90 d采樣.為避免由于酵母硒添加時(shí)分布不均、木耳菜扎根淺等而導(dǎo)致吸附不均，本研究采用網(wǎng)格法采樣，即將培養(yǎng)基十字劃分為4個(gè)大小相等的部分，每次采樣時(shí)從每隔中

隨機(jī)采取2-3株樣品，最后將采集的所用樣品混合均勻.

1.2.4 樣品預(yù)處理

用去離子水清洗樣品后，將樣品研磨成勻漿，在千分之一天平上稱取1.5 g置于100 mL錐形瓶內(nèi).為防止雜質(zhì)干擾、富集樣品中的硒、并將硒轉(zhuǎn)化為可被測定的形態(tài)，需對(duì)采集的樣品進(jìn)行消解，本實(shí)驗(yàn)采用HNO3-HClO4濕式消解法.此外，在酵母硒及其他藥劑施加完全相同的條件下，用去離子水代替農(nóng)藥，作為空白對(duì)照.

用去離子水清洗樣品后，將樣品研磨成勻漿，在千分之一天平上稱取1.5 g置于100 mL錐形瓶內(nèi).為防止有物質(zhì)對(duì)測定造成干擾、并將硒轉(zhuǎn)化為可被測定的形態(tài)，同時(shí)防止硒的含量低于儀器的檢測限，需對(duì)采集的樣品進(jìn)行消解，本實(shí)驗(yàn)采用HNO3-HClO4濕式消解法.此外，在酵母硒及其他藥劑施加完全相同的條件下，用去離子水代替農(nóng)藥，作為空白對(duì)照.

1.3 樣品測定

本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測定植物體內(nèi)的硒含量，該方法具有靈敏度高、設(shè)備簡單易操作等優(yōu)勢[13].

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)對(duì)木耳菜富硒能力的影響

由于火山巖基質(zhì)的樣品僅在出芽后24 d取樣一次，為控制取樣時(shí)間相同，本節(jié)取土壤基質(zhì)初次采樣的樣品，將二者日均富硒量進(jìn)行對(duì)比(圖1).由圖，a、g均為空白對(duì)照，檢測結(jié)果作為木耳菜基礎(chǔ)富硒值.隨施加草甘膦濃度的升高，土壤與火山巖基質(zhì)總體均表現(xiàn)為促進(jìn)木耳菜富硒，但二者均存在最適富硒濃度，即在草甘膦施加達(dá)到最適濃度時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng).火山巖基質(zhì)的最適富硒濃度為0.003 6 g/培養(yǎng)基，此時(shí)日均富硒量0.720 mg·kg-1；土壤基質(zhì)的最適富硒濃度為0.002 4 g/培養(yǎng)基，對(duì)應(yīng)日均富硒量0.463 mg·kg-1.通過觀察柱狀圖的變化趨勢，可以得出火山巖基質(zhì)中草甘膦的最適富硒濃度較土壤基質(zhì)更高，且峰值富硒量也更高.這可能與火山巖的天然的蜂窩多孔結(jié)構(gòu)及表面正電荷相關(guān)[14]，火山巖的該特性可以促進(jìn)木耳菜對(duì)藥劑肥料的吸收、減少流失，從而提高養(yǎng)分固持.火山巖的酸性較黃棕壤弱，可增加硒元素由固態(tài)溶解為有機(jī)態(tài)[15]，提高硒的有效性.

2.2 草甘膦與氯氰菊酯對(duì)植物富硒能力的影響

在第二階段實(shí)驗(yàn)條件下，草甘膦與氯氰菊酯對(duì)木耳菜富硒表現(xiàn)出不同的促進(jìn)作用，但任何農(nóng)藥施加濃度過高時(shí)，均會(huì)對(duì)植物富硒產(chǎn)生抑制作用，且該抑制作用的強(qiáng)弱與施加濃度大小存在顯著正相關(guān)關(guān)系.這一方面是由于高濃度農(nóng)藥產(chǎn)生藥害，影響植物的正常生長，甚至導(dǎo)致植物死亡；另一方面高濃度的農(nóng)藥也對(duì)土著微生物表現(xiàn)出抑制作用，改變土壤生物群落結(jié)構(gòu)，從而破壞土壤微生態(tài)[16].本研究中氯氰菊酯即為典型，其在高濃度下對(duì)木耳菜富硒能力的抑制較草甘膦更強(qiáng).鑒于此，草甘膦與氯氰菊酯均存在促進(jìn)木耳菜富硒的最適施加濃度.由圖2(c)，草甘膦最適富硒濃度出現(xiàn)在施加量為0.002 9 g/培養(yǎng)基(c組)，最佳促進(jìn)區(qū)段為出芽后34～62 d，對(duì)應(yīng)的最大富硒量為1.007 mg/(kg·d-1)；氯氰菊酯的最適富硒濃度則出現(xiàn)在施加量為0.001 8 g/培養(yǎng)基(d組)時(shí)，其最佳促進(jìn)區(qū)段為出芽后41～62 d，對(duì)應(yīng)的最大富硒量為0.902 mg/(kg·d-1)(圖2(d)).另外，兩種農(nóng)藥對(duì)木耳菜富硒的促進(jìn)作用均隨生長時(shí)間的推移先增強(qiáng)再減弱，本研究結(jié)果表明，一般情況下施加草甘膦較氯氰菊酯能更快表現(xiàn)出對(duì)木耳菜富硒的最佳促進(jìn)，且草甘膦的促進(jìn)作用表現(xiàn)相對(duì)氯氰菊酯強(qiáng)，這可能與草甘膦的高分解代謝速率和分解產(chǎn)物低毒性、易被生物利用密切相關(guān)[17-18].

圖2 不同濃度草甘膦和氯氰菊酯對(duì)木耳菜富硒的影響對(duì)比(圖(a)-(f)分別對(duì)應(yīng)氯氰菊酯A-F組及草甘膦a-f組)

2.3 草甘膦與氯氰菊酯對(duì)木耳菜富硒的影響隨時(shí)間的變化

為驗(yàn)證2.2中所述兩種農(nóng)藥對(duì)木耳菜富硒的促進(jìn)作用隨生長時(shí)間的變化規(guī)律，本節(jié)在施加最適富硒濃度的草甘膦(c組0.002 9 g/培養(yǎng)基)和氯氰菊酯(d組0.001 8 g/培養(yǎng)基)條件下的木耳菜日均富硒量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與生長天數(shù)建立回歸模型(圖3).

圖3 木耳菜富硒能力隨時(shí)間變化的線性擬合(圖(a1)、(a2)分別對(duì)應(yīng)草甘膦c組出芽后27～55 d和56～90 d；圖(b1)、(b2)分別對(duì)應(yīng)氯氰菊酯D組出芽后27-55 d和56-90 d)

木耳菜出芽后55 d內(nèi)，草甘膦與氯氰菊酯對(duì)木耳菜富硒能力的促進(jìn)均與生長時(shí)間存在正相關(guān)關(guān)系，且草甘膦的促進(jìn)作用比氯氰菊酯更顯著(R2=0.941 4>0.713 8).出芽55 d后，二者的促進(jìn)作用開始減弱，其對(duì)富硒能力的促進(jìn)與生長時(shí)間成負(fù)相關(guān)，甚至出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，草甘膦的抑制效果同樣更顯著(R2=0.941 8>0.843 9).

施加草甘膦的木耳菜第二階段較第一階段促進(jìn)富硒作用減弱是受氣溫、濕度及其生長階段等影響；氯氰菊酯表現(xiàn)出的相關(guān)性相對(duì)較弱正是由于2.2中發(fā)現(xiàn)施加草甘膦與氯氰菊酯達(dá)到最大富硒量存在時(shí)間差，則此時(shí)施加氯氰菊酯對(duì)木耳菜富硒的促進(jìn)作用由升至降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)應(yīng)比草甘膦的轉(zhuǎn)折點(diǎn)更晚，而本實(shí)驗(yàn)中并未探討其準(zhǔn)確時(shí)間節(jié)點(diǎn).因此，本節(jié)中所述顯著性大小比較不能直接反映兩種農(nóng)藥在最適濃度時(shí)的促進(jìn)效果.

3 討論

根據(jù)筆者的前期實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)：(1)火山巖由于其特殊的理化特性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出比土壤基質(zhì)更優(yōu)的促進(jìn)木耳菜富硒能力，但其所需施加的草甘膦濃度也稍大于土壤基質(zhì)，此時(shí)應(yīng)根據(jù)不同種植情形考慮成本問題；(2)草甘膦與氯氰菊酯在一定濃度范圍內(nèi)均對(duì)木耳菜富硒有促進(jìn)作用，但濃度過高時(shí)促進(jìn)作用會(huì)減弱，甚至表現(xiàn)為抑制，草甘膦最適富硒濃度為0.002 9 g/培養(yǎng)基，對(duì)應(yīng)最大富硒量為1.007 mg/(kg·d-1)；氯氰菊酯的最適富硒濃度為0.001 8 g/培養(yǎng)基，對(duì)應(yīng)的最大富硒量為0.902 mg/(kg·d-1)；(3)草甘膦和氯氰菊酯在最適富硒濃度下，其促進(jìn)作用均隨出芽天數(shù)的增加表現(xiàn)為先增加再減弱，施加草甘膦的達(dá)到促進(jìn)效果的時(shí)間總體上少于氯氰菊酯.在充分考慮不同地域培養(yǎng)基質(zhì)理化性質(zhì)、作物種類及施加藥劑特異性的條件下，以上結(jié)論可以為富硒作物的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供借鑒.

在本研究的基礎(chǔ)上，存在大量值得思考的問題，如有機(jī)態(tài)硒是否會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)草甘膦對(duì)木耳菜轉(zhuǎn)化富集硒的促進(jìn)作用？農(nóng)藥對(duì)作物富硒能力影響的分子生物學(xué)機(jī)制是什么？目前，大量研究表明，植物多吸收水溶性硒(包括硒酸鹽、亞硒酸鹽和有機(jī)硒)，其運(yùn)輸機(jī)制主要有三種[19]：(1)硒酸鹽的吸收主要依靠高親和力的硫酸轉(zhuǎn)運(yùn)子SULTR1；1和SULTR1；2完成；(2)利用ATP硫酸化酶(ATPS)、硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SMT)、5′-磷硫酸腺苷還原酶(APR)將硒酸鹽、亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒吸收；(3)5′-磷酸硒腺苷(APSe)通過APR調(diào)控完成硒酸鹽同化.而草甘膦作用于非靶標(biāo)植物時(shí)首先會(huì)與植物根系直接接觸，導(dǎo)致草甘膦在其根部大量富集，同時(shí)被代謝為氨甲基膦酸(AMPA)，根中的草甘膦和AMPA會(huì)通過木質(zhì)部或韌皮部運(yùn)輸?shù)娇墒秤们o和葉中[20].另外，姚國君[21]以油菜、黃瓜、番茄、甘藍(lán)和辣椒為植物樣本，發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯在非靶標(biāo)生物中也存在降解途徑，且在辣椒中表現(xiàn)最為顯著.在上述的代謝過程中，草甘膦和氯氰菊酯是否會(huì)影響到植物轉(zhuǎn)運(yùn)硒元素時(shí)所涉及到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、關(guān)鍵酶、甚至調(diào)控某些基因的表達(dá)等科學(xué)問題[22]，隨著“組學(xué)”的概念興起，高通量測序、靶向測序、熒光定量PCR檢測、蛋白質(zhì)印跡和全轉(zhuǎn)錄組測序等方法逐漸成熟，也將會(huì)得到新的突破.