龍 丹，王 凱，郭丹丹，楊 梅，徐 麗，張陽春，張春林

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

全球范圍內，頭頸鱗癌發(fā)病率在惡性腫瘤中居第6位[1]，吸煙飲酒是已被證實的致癌因素之一。近年研究證實感染高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)與頭頸鱗癌的發(fā)生密切相關，且頭頸鱗癌中HPV的感染率有逐年上升的趨勢[2-3]。因此，開展HPV陽性頭頸鱗癌的基礎研究，對于頭頸鱗癌的防治十分必要。HPV陽性頭頸鱗癌是一個獨特的腫瘤亞組，與HPV陰性頭頸鱗癌相比，具有明顯的臨床特征，如對放化療反應敏感，預后較好等[4]。HPV陽性頭頸鱗癌的生物學特性與HPV病毒直接或間接相關，眾多的癌基因及抑癌基因可能參與其中[5]，但是具體的調控機制并不明確。

生殖器形成抑制基因-1(Suppressor of morphogenesis in genitalia-1,SMG-1)是新近發(fā)現(xiàn)的一個重要的抑癌基因，屬于PIKKs家族，主要調控p53在G1期信號傳導通路，阻滯細胞周期，在DNA損傷修復中發(fā)揮作用，其異常表達與腫瘤的發(fā)生密切相關[6]。有研究證實在喉鱗癌組織內SMG-1的表達與腫瘤的發(fā)生密切相關，SMG-1是預測喉癌預后的重要生物學指標。抑癌基因啟動子的異常甲基化可引起目的基因轉錄失活，參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase1，DNMT1)可催化腫瘤的啟動子甲基化反應，DNMT1已發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中均有異常表達[8]，但在HPV陽性頭頸鱗癌中的意義仍未明確。不同于HPV陰性頭頸鱗癌，HPV陽性頭頸鱗癌中抑癌基因的甲基化水平高于HPV陰性頭頸鱗癌[9-11]，HPV感染可能與腫瘤的甲基化相關。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，HPV病毒可通過影響甲基化水平調節(jié)HPV陽性頭頸鱗癌的生物學特性[12]。本研究通過對比HPV陽性頭頸鱗癌及HPV陰性頭頸鱗癌中SMG-1和DNMT1的表達差異，探討HPV陽性頭頸鱗癌中SMG-1和DNMT1的表達及臨床意義，篩選頭頸鱗癌預后的標記物，并為進一步的機制研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 標本來源收集 2014年6月至2017年12月就診于我院的頭頸鱗癌患者的石蠟組織標本105例。所有石蠟標本均經10%的中性福爾馬林液固定，后由專業(yè)病理醫(yī)師以2014年WHO診斷標準進行HE染色切片診斷[13]。納入標準：原發(fā)灶病理確診為頭頸鱗癌；有完整的臨床資料及標本；標本質量達到HPV-DNA的PCR檢測和免疫組化的檢測要求。排除標準：原發(fā)灶非頭頸部腫瘤；合并其他腫瘤；臨床資料缺失。

1.2 研究方法

1.2.1 HPV陽性頭頸鱗癌的檢測 首先提取石蠟組織標本切片5～10片，厚5 μm，面積100～250 mm2，將處理好的樣品裝于1.5 mL無菌離心管中，使用TaKaRa MiniBEST FFPE DNA Extraction Kit試劑盒提取樣本DNA，使用微量核酸測定儀進行DNA濃度測定和DNA質量評估，使用AmpliTaq GoldTMDNA Polymerase Kit試劑盒，PCR擴增管家基因β-globin進行DNA質控檢驗，檢驗合格者則進行HPV-DNA的檢測，使用GP5+/GP6+引物巢式PCR擴增HPV-DNA(見表1)，再取10 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下對條帶拍照分析結果。所有石蠟組織標本進行免疫組化法p16蛋白檢測。HPV-DNA和p16均陽性的頭頸鱗癌標本確定為HPV陽性頭頸鱗癌[14]。

表1 PCR擴增β-globin 和 HPV-DNA所用的引物

1.2.2 SMG-1，DNMT1蛋白檢測 按照免疫組化Envision法將石蠟組織標本烤片30 min，二甲苯10 min(2次)，按照酒精濃度梯度(100%，95%，80%，70%)進行脫蠟水化，3%雙氧水室溫封閉8 min，純水沖洗干凈，采用0.01 mol/L檸檬酸高溫高壓法抗原修復2～3 min，冷卻至室溫，一抗(兔抗-p16，1∶400稀釋，Proteintech公司；兔抗-SMG-1，1∶1 000稀釋，Abcam公司；兔抗-DNMT1，1∶2 000稀釋，Abcam公司)4 ℃過夜孵育14～18 h，二抗(通用型羊抗兔鼠，福州邁新生物公司)室溫孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，干燥，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 SMG-1，DNMT1蛋白表達結果判定 顯微鏡400倍光鏡下隨機選取5個視野，每個視野至少含100個腫瘤細胞，計算陽性率：即5個視野中陽性腫瘤細胞數的均值。SMG-1蛋白表達主要在細胞核及細胞質，DNMT1蛋白表達主要在細胞核，以細胞核/細胞質染成黃棕色或黃褐色為陽性細胞。DNMT1[15]和SMG-1[16]的表達均以半定量法將蛋白表達分為4個水平。DNMT1：陰性(-)，無染色或染色細胞低于5%，計0分；弱陽性(+)，染色細胞為6%～25%，計1分；中強陽性(++)，染色細胞為26%～75%，計2分；強陽性(+++)，染色細胞大于75%，計3分。SMG-1：陰性(-)，細胞核/細胞質無染色，計0分；弱陽性(+)，細胞核/細胞質淡黃色，染色細胞小于50%，計1分；中強性(++)，細胞核/細胞質呈黃色/棕黃色，染色細胞小于40%，計2分；強陽性(+++)，細胞核/細胞質呈褐色/棕褐色，染色細胞大于40%，計3分。

1.3 統(tǒng)計學分析 本實驗采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，兩組間二分類資料比較使用χ2檢驗，有序多分類資料比較使用R×C列聯(lián)表χ2檢驗，對T<5超過1/5的分類資料比較使用Fisher精確概率法。兩組有序多分類資料的相關性分析使用Spearman秩相關系數。使用Kaplan-Meier法進行生存分析，取α= 0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 頭頸鱗癌中HPV的感染率 在頭頸鱗癌中HPV的總感染率為21.9%(23/105)，下咽癌中HPV的感染率為27.3%(3/11)，喉癌中HPV的感染率為21.0%(17/81)，口咽癌中HPV的感染率為33.3%(2/6)(見表2)。

表2 HPV在頭頸鱗癌中的感染情況

2.2 頭頸鱗癌中SMG-1和DNMT1的表達 與HPV感染的相關性頭頸鱗癌中SMG-1和DNMT1中的總陽性率為(40.00%，67.62%)， HPV陽性頭頸鱗癌中SMG-1陽性率(21.74%)低于HPV陰性組(45.12%)，DNMT1陽性率(86.96%)高于HPV陰性組(62.20%)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1，表3)。

A: SMG-1,陰性；B: SMG-1,弱陽性; C: SMG-1,中強陽性；D:SMG-1,強陽性；E：DNMT1,陰性；F: DNMT1,弱陽性；G: DNMT1，中強陽性；H: DNMT1,強陽性。圖1 SMG-1,DNMT1在頭頸鱗癌中的表達(×400)

表3 SMG-1和DNMT1在頭頸鱗癌中的表達

2.3 SMG-1、DNMT1與頭頸鱗癌臨床特征的關系 所有納入的頭頸鱗癌患者均無遠處轉移，經R×2列聯(lián)表χ2檢驗，SMG-1和DNMT1在N分期和腫瘤分期的差異性表達均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在性別，年齡，T分期和治療方式上表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表4)。SMG-1與DNMT1表達呈負相關(rs=-0.486，P<0.001，見表5)。

表4 納入的頭頸鱗癌患者臨床特征與SMG-1、DNMT1表達情況

表5 SMG-1與DNMT1表達的相關性

2.4 頭頸鱗癌中HPV感染、SMG-1和DNMT1表達水平與患者預后的關系 Kaplan-Meier法進行生存分析的結果顯示，HPV陽性頭頸鱗癌的5年生存率(87.0%)明顯優(yōu)于HPV陰性組的5年生存率(54.9%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028)。頭頸鱗癌中SMG-1陰性組5年生存率(77.8%)明顯優(yōu)于SMG-1陽性組的5年生存率(38.1%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，且SMG-1陰/弱陽性組的5年生存率(73.2%)優(yōu)于SMG-1中強陽/強陽性組的5年生存率(38.2%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.013)。頭頸鱗癌中DNMT1陽性組5年生存率(71.8%)優(yōu)于陰性組5年生存率(41.2%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.030)，且DNMT1強陽性組5年生存率(82.5%)明顯優(yōu)于陰/弱陽/中強陽性組5年生存率(49.2%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007，見圖2)。

圖2 頭頸鱗癌中HPV感染、SMG-1和DNMT1表達與生存率關系

3 討論

頭頸鱗癌是常見的惡性腫瘤之一，占所有癌癥的3%～5%[1]，感染高危型HPV是其主要危險因素之一[2]。HPV病毒通過感染人類黏膜上皮細胞，其癌蛋白E6和E7可分別導致p53和視網膜母細胞瘤(Rb)腫瘤抑制蛋白失活，從而激發(fā)HPV相關腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。近年來，頭頸鱗癌中HPV感染率有升高的趨勢，進行頭頸鱗癌中HPV感染的檢測也越來越被重視。目前，頭頸鱗癌中HPV的檢測方法尚未統(tǒng)一，不同的研究目的采用不同檢測方法，其中包括定量逆轉錄PCR，免疫組化，原位雜交，免疫印跡等，可分別用于檢測HPV的DNA，RNA及相關蛋白，聯(lián)合多種檢測方法可提高檢測效率。不同于宮頸癌，HPV相關頭頸鱗癌中HPV DNA病毒載量及mRNA轉錄表達量均較低，往往需要輔以組織標本才能完成HPV檢測。本研究使用PCR檢測HPV-DNA聯(lián)合p16免疫組化法檢測頭頸鱗癌患者的HPV感染情況，與HPV金標準E6/E7 mRNA的分析結果有一致性[14]，在頭頸鱗癌中測得HPV的總感染率為21.9%(23/105)，在口咽癌中HPV的感染率為33.3%(2/6)，在下咽癌中HPV的感染率為27.3%(3/11)，在喉癌中HPV的感染率為21.0%(17/81)，與Ni[14]和Gama[18]研究結果類似，其中口咽癌中HPV的感染率略低于我們前期研究[3]的結果，可能原因為本研究組使用PCR檢測HPV-DNA聯(lián)合免疫組化檢測p16的方法，剔除了單純檢測HPV-DNA陽性而p16陰性的假陽性標本及HPV一過性感染的樣本，增加了檢查特異性。HPV陽性頭頸鱗癌相較于HPV陰性頭頸鱗癌具有對放化療反應敏感，預后較好等的獨特的臨床特征[4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[19]，HPV陽性頭頸細胞株(UPCI-SCC-090，UM-SCC-47)相較于HPV陰性頭頸細胞株(FaDu，UM-SCC-4)對放化療更敏感。本研究組HPV的生存分析顯示HPV陽性頭頸鱗癌的5年生存率(87.0%)明顯優(yōu)于HPV陰性組(54.9%)。因此，對HPV陽性頭頸鱗癌的生物學機制研究是十分必要的。介于HPV的存在是頭頸鱗癌患者最重要的預后因素之一，眾多的癌基因及抑癌基因可能參與其中[5]，本研究組對SMG-1和DNMT1在HPV陽性頭頸鱗癌中的表達進行研究。

SMG-1是人體中重要的抑癌基因之一，屬于PIKKs家族的成員，參與生物學中多種機制調控，包括參與缺氧反應，參與腫瘤壞死因子-α誘導的細胞凋亡，修復DNA損傷反應等，其異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關[6,16]。Zhang等[20]報道在胃癌中miR-192和miR-215可下調SMG-1的表達而提高癌細胞的增殖和侵襲特性。周學軍等[21]報道在喉鱗癌中SMG-1發(fā)揮抑癌基因作用且SMG-1表達缺失的喉鱗癌患者預后良好。HPV陽性頭頸鱗癌中SMG-1的報道較少，HPV病毒的癌蛋白E6可導致p53突變，造成DNA損傷及基因組不穩(wěn)定[17]，而p53受到其上游基因SMG-1的調控，提示SMG-1可能參與HPV相關頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展。本研究中HPV陽性頭頸鱗癌SMG-1陽性率(21.74%)低于HPV陰性組(45.12%)，提示在HPV陽性頭頸鱗癌中SMG-1表達下調。本研究納入的頭頸鱗癌患者中SMG-1表達隨著腫瘤N分期及腫瘤分期的等級提高呈下降趨勢，與周學軍[21]和Gubanova等[16]中頭頸鱗癌的研究結果相似，提示在HPV陽性頭頸鱗癌中SMG-1表達可能與淋巴結浸潤及腫瘤分期相關。SMG-1的生存分析顯示，頭頸鱗癌中SMG-1陰性組5年生存率(77.8%)明顯優(yōu)于SMG-1陽性組(38.1%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，與Gubanova[16]和Zhang等[19]的頭頸鱗癌結果相似，提示HPV陽性頭頸鱗癌中SMG-1高表達者預后不良，SMG-1可能成為頭頸鱗癌患者預后的標記物之一。

DNMT1是一種將甲基轉移至基因組DNA胞嘧啶核苷酸的酶，DNA的甲基化在表觀遺傳基因調控中起重要作用，異常的甲基化與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[8]。有研究證實HPV陽性頭頸鱗癌中抑癌基因的甲基化水平高于HPV陰性頭頸鱗癌[9-11]，HPV感染可能與腫瘤的甲基化相關。本研究中HPV陽性頭頸鱗癌DNMT1陽性率(86.96%)高于HPV陰性組(62.20%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示在HPV陽性頭頸鱗癌中DNMT1表達上調。相關研究報道在HPV陽性頭頸鱗癌中存在RXRG[9]，EREG[10]，p16[11]等多種抑癌基因的異常甲基化及其沉默，與DNMTs密切相關。本研究組中SMG-1和DNMT1表達呈負相關，提示SMG-1和DNMT1可能參與HPV陽性頭頸鱗癌中抑癌基因的異常甲基化，調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。頭頸鱗癌中DNMT1表達隨著N分期及腫瘤分期等級提高呈上升趨勢，提示HPV陽性頭頸鱗癌中DNMT1表達可能與淋巴結浸潤及腫瘤分期相關。DNMT1的生存分析顯示，頭頸鱗癌中DNMT1陽性組5年生存率(71.8%)明顯優(yōu)于DNMT1陰性組(41.2%)，與Xue等[22]的頭頸鱗癌結果相似，提示HPV陽性頭頸鱗癌中DNMT1低表達者預后不良，DNMT1可能成為頭頸鱗癌患者預后的標記物之一。

在HPV陽性頭頸鱗癌中，SMG-1與DNMT1表達呈負相關，SMG-1和DNMT1均與頭頸鱗癌的預后相關，SMG-1高表達者預后不良，DNMT1低表達者預后不良，我們前期研究顯示[19]HPV陽性頭頸細胞株對放化療敏感性強于HPV陰性細胞株。因此，本研究為進一步的研究提供參考，在HPV陽性頭頸鱗癌中，DNMT1可能通過調控SMG-1的表達，提高腫瘤對放化療敏感性，從而影響其預后，為后續(xù)研究探討DNMT1和SMG-1在HPV陽性頭頸鱗癌中的作用機制提供依據。