李婉媚 楊旭斌 黃懿文 陳雪雁

1廣州市第十二人民醫(yī)院內(nèi)分泌內(nèi)科（廣州510620）；2中山大學附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病學科（廣州510630）

心臟自主神經(jīng)病變（CAN）是糖尿病重要的并發(fā)癥之一，可引起患者體位性低血壓、持續(xù)性心動過速及無痛性心肌梗死等，可顯著增加糖尿病的病死率［1-2］。研究證實，血糖升高是導致CAN 的關(guān)鍵因素［3］。有研究提示，糖化血紅蛋白控制在良好范圍內(nèi)，仍不能完全減少CAN 的發(fā)生和發(fā)展［4］。筆者前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，血糖波動較持續(xù)性高血糖更容易引起CAN，而相關(guān)機制未明。已有報道，血糖波動導致糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的核心因素之一在于炎癥因子［1］。但目前關(guān)于血糖波動導致CAN 的機制研究尚未見報道。為此，本研究通過建立糖尿病血糖波動大鼠模型，探討血糖波動對糖尿病大鼠心臟自主神經(jīng)功能的影響以及炎癥因子在其中可能的作用機制，為臨床上改善心臟自主神經(jīng)功能、減少相關(guān)的病死率提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取45 只雄性SPF 級別大鼠，體質(zhì)量在260 ～300 g 之間，周齡均為8 周，由上海劍鈍生物科技有限公司提供。

1.2 試劑及材料 酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒：腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒購于上?；鄯f生物科技有限公司；白細胞介素6（IL-6）試劑盒購于齊一生物科技（上海）有限公司；白細胞介素1β（IL-1β）試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司。

反映心臟自主神經(jīng)功能的因子：睫狀生長因子（CNTF）試劑盒購于上海滬震實業(yè)有限公司；神經(jīng)生長相關(guān)蛋白（GAP-43）購于上海鈺博生物科技有限公司；神經(jīng)生長因子（NGF）試劑盒購于上?？祈樕锟萍加邢薰?；乙酰膽堿酶轉(zhuǎn)移酶（CHAT）購于上海信裕生物科技有限公司、絡(luò)氨酸氫化酶（TH）試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（STZ）購于上海艾研生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病模型制備 45 只SD 大鼠中，隨機抽取15 只為空白對照組（NC 組），另外30 只大鼠按照60 mg/kg 的比例注射STZ 制備糖尿病模型，連續(xù)2 次隨機血糖＞16.7 mmol/L 即模型成功。之后將其隨機分為持續(xù)高血糖組（DS 組）和波動高血糖組（DF 組），各15 只。DF 組在注射STZ 糖尿病大鼠模型基礎(chǔ)上參考國際公認的AZUMA 等［7］造模方法制造血糖波動大鼠模型。DF 組每天定時（上午8點，下午2點）葡萄糖灌胃（2.5 g/kg），每天定時（上午9點，下午3點）給予3U的胰島素腹腔注射，DS組和NC 組每天相應時間給予等量生理鹽水［6］。每天檢測7：30、9：30、11：30、13：30、17：30、19：30 血糖，并計算各組日內(nèi)血糖波動的評價參數(shù)如血糖標準差（SDBG）、最大血糖波動幅度（LAGE）。DF組空腹血糖波動于7.8 ～16.7 mmol/L，餐后血糖在11.1 ～33.3 mmol/L，且SDBG和LAGE顯著高于持續(xù)高血糖組時，則為造模成功［7-8］。

1.3.2 指標檢測 所有大鼠喂養(yǎng)4 周以后，隔夜禁食，采用4%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠心臟開胸取出后，立即分離心臟，切取有心臟表面神經(jīng)節(jié)叢存在的心臟脂肪墊并制成勻漿液備用，采用酶聯(lián)免疫吸附法對心臟表面神經(jīng)節(jié)叢勻漿液進行TH、CHAT、NGF、GAP-43、CNTF 及TNF-α、IL-1β、IL-6 水平測定［9］。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0 對上述資料進行整理分析，其中計量資料采用均數(shù)±標準差表示，通過單因素方差分析對組間資料進行比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況變化 4 周后，NC 組大鼠攝水攝食量較正常，毛發(fā)光潔，精神狀態(tài)良好。DS 組和DF 組大鼠出現(xiàn)不同程度的萎靡消瘦，毛亂無光澤，多尿多食多飲；且與DS 組相比較，DF 組大鼠體質(zhì)量更輕，活動更少，標準差（SDBG）、最大血糖波動幅度（LAGE）更高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠喂養(yǎng)4 周后一般情況變化Tab.1 Characteristics of the rats among groups after 4 weeks ±s

表1 各組大鼠喂養(yǎng)4 周后一般情況變化Tab.1 Characteristics of the rats among groups after 4 weeks ±s

注：與NC 組相比，*P ＜0.001；與NC 組相比，#P ＜0.001；與DS 組相比，△P ＜0.001

組別NC組DS組DF組F值P值例數(shù)15 15 15體質(zhì)量（g）511.26±26.51 359.54±23.19#219.65±14.92*△47.382＜0.001 HbA1c（%）4.59±0.51 11.23±0.58#11.10±0.46*23.457＜0.001 SDBG（mmol/L）0.75±0.33 1.78±0.55#4.21±0.48*△16.743＜0.001 LAGE（mmol/L）1.58±0.45 5.42±0.61#12.78±1.14*△20.491＜0.001

2.2 各組大鼠心臟自主神經(jīng)勻漿液中CHAT、TH及TH/CHAT 水平比較 4 周后，與NC 組相比，DS組和DF 組大鼠TH 和TH/CHAT 水平明顯升高，CHAT 明顯降低，且DF 組大鼠上述指標變化更為顯著（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠中TH、CHAT 及TH/CHAT 水平比較Tab.2 Comparison of TH、CHAT and TH/CHAT among groups after 4 weeks ±s

表2 各組大鼠中TH、CHAT 及TH/CHAT 水平比較Tab.2 Comparison of TH、CHAT and TH/CHAT among groups after 4 weeks ±s

注：與NC 組相比，*P ＜0.001；與NC 組相比，#P ＜0.001；與DS組相比，△P ＜0.05

組別NC 組DS 組DF 組F 值P 值例數(shù)15 15 15 TH/CHAT（ng/mL）0.92±0.08 1.54±0.15#1.97±0.21*△31.185＜0.001 CHAT（ng/mL）41.15±6.54 27.26±4.87#22.19±3.76*△26.462＜0.001 TH（ng/mL）34.26±5.19 41.69±6.29#45.33±6.38*△19.326＜0.001

2.3 各組大鼠心臟自主神經(jīng)勻漿液中神經(jīng)營養(yǎng)因子水平比較 4周后，與NC組相比，DS組和DF組大鼠GAP-43 和NGF 水平明顯升高，CNTF 明顯降低，且DF 組大鼠上述指標變化更為顯著（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠中神經(jīng)營養(yǎng)因子水平比較Tab.3 Comparison of CNTF，GAP-43 and NGF amonggroups after 4 weeks ±s

表3 各組大鼠中神經(jīng)營養(yǎng)因子水平比較Tab.3 Comparison of CNTF，GAP-43 and NGF amonggroups after 4 weeks ±s

注：與NC 組相比，*P ＜0.001；與NC 組相比，#P ＜0.001；與DS組相比，△P ＜0.05

組別NC 組DS 組DF 組F 值P 值例數(shù)15 15 15 CNTF（ng/mL）31.74±6.59 18.54±5.29#16.02±4.26*△34.375＜0.001 GAP-43（ng/mL）112.69±15.64 129.36±15.95#137.88±16.19*△26.284＜0.001 NGF（ng/mL）312.58±36.87 368.25±38.39#379.08±36.28*△25.825＜0.001

2.4 各組大鼠心臟自主神經(jīng)勻漿液中IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較 4 周后，與NC 組相比，DS 組和DF 組大鼠TNF-α、IL-6 及IL-1β水平明顯升高，且DF 組大鼠上述炎癥指標升高更為顯著（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠中TNF-α、IL-6 及IL-1β水平比較Tab.4 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-1βamong groups after 4 weeks

3 討論

目前認為糖尿病心臟自主神經(jīng)病變的主要機制為副交感神經(jīng)異常、軸突性神經(jīng)病變、高糖毒性、交感-迷走神經(jīng)紊亂、神經(jīng)營養(yǎng)等多因素相互影響，致使迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)損傷，發(fā)生心臟自主神經(jīng)病變［10-11］。研究顯示，較大的血糖波動會增加慢性并發(fā)癥的風險［12］。與持續(xù)性高血糖相比，間斷性的高血糖更能誘導機體副交感神經(jīng)發(fā)生異常，致使心臟自主神經(jīng)病變的發(fā)生［13］。然而，其相關(guān)機制仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著血糖波動幅度等指標的升高，反映心臟自主神經(jīng)功能損害及再生的相關(guān)因子GAP-43、CNTF、NGF、CHAT 以及TH 呈現(xiàn)顯著變化。劉紅梅等［14］研究發(fā)現(xiàn)血糖波動與持續(xù)高血糖相比，炎癥因子TNF-α，IL-6和IL-1β相關(guān)蛋白表達水平升高，考慮血糖波動是造成炎性因子變化的主要原因。

糖尿病大鼠中，神經(jīng)因子等的改變是反映心臟自主神經(jīng)功能的重要提示。GAP-43 為交感神經(jīng)芽生的標志物，糖尿病時心臟中GAP-43 過度表達標志著神經(jīng)損傷后出現(xiàn)重構(gòu)現(xiàn)象［15］。在體外研究中，CNTF 可以促進雞胚副交感睫狀節(jié)神經(jīng)元的存活，同時，有較強的促進迷走神經(jīng)作用［16］。另一個神經(jīng)因子NGF 在機體交感神經(jīng)重構(gòu)中同樣發(fā)揮重要的作用，而在心臟自主神經(jīng)功能調(diào)節(jié)異常時NGF 呈升高趨勢［17-18］。而CHAT 和TH 可分別有效反映迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)活性。TH/CHAT 的比值可有效反映迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)之間的平衡性［19］。本研究結(jié)果顯示，血糖波動組GAP-43 和NGF 水平明顯升高，表明交感神經(jīng)得到一定程度的修復，而CNTF 水平相對較低，表明迷走神經(jīng)恢復較弱，最終導致交感神經(jīng)亢進迷走神經(jīng)損傷，交感和迷走神經(jīng)平衡紊亂，引發(fā)心臟自主神經(jīng)功能變化［20］。因此，血糖波動可能通過多個神經(jīng)因子的改變從而導致心臟自主神經(jīng)調(diào)節(jié)的異常，最終引起糖尿自主神經(jīng)病變的發(fā)生。相對于持續(xù)高血糖，血糖波動帶來的神經(jīng)因子表達水平改變更顯著，從而心臟自主神經(jīng)功能的損害也更明顯。

然而，血糖波動如何促使神經(jīng)因子異常表達進而導致心臟自主神經(jīng)病變的發(fā)生、發(fā)展尚未明確。既往研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子與神經(jīng)因子存在顯著的關(guān)聯(lián)［21］。在中心性肥胖的人群［22］或帕金森的患者中，CHAT 和TH 與炎癥因子如IL-1β和IL-6 存在相關(guān)性［23］。而在炎癥因子與GAP-43 相關(guān)性分析的研究中，GU 等［24］發(fā)現(xiàn)，在使用木犀草素進行干預的糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中，GAP-43 的升高與IL-1β和TNF-α的變化相關(guān)。體外及體內(nèi)研究均已明確，NGF 可顯著減少血糖升高所引起的炎癥因子釋放，從而緩解糖尿病并發(fā)癥［25-26］。然而血糖波動與炎癥因子及神經(jīng)因子的關(guān)聯(lián)卻尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著血糖波動增大，神經(jīng)因子變化的同時伴隨著炎癥因子的顯著升高，提示炎癥因子在血糖波動時，在自主神經(jīng)功能發(fā)生異常過程中發(fā)揮重要的橋梁作用。這可能是由于血糖波動引發(fā)神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)生變化，誘導神經(jīng)損傷，而血糖波動亦可能促使TNF-α和IL-1β水平升高，促進髓鞘磷脂的吞噬，加重神經(jīng)的損傷，出現(xiàn)神經(jīng)因子的異常［22-27］。另外，炎癥因子也參與血管內(nèi)皮損傷及胰島素抵抗，在一定程度上加重微血管損傷，進而引發(fā)心臟自主神經(jīng)損傷［28］。因此筆者認為，在糖尿病大鼠中，血糖波動導致炎癥因子與神經(jīng)相關(guān)因子相互影響，從而損害心臟自主神經(jīng)功能。

本研究探討血糖波動影響心臟自主神經(jīng)功能的可能機制，分析炎癥因子在其中可能的影響，為今后的心臟自主神經(jīng)病變提供可能的靶點［29］。然而本研究尚存在一定的局限：（1）本研究未深入探討血糖波動、炎癥因子及心臟自主神經(jīng)功能改變間相互影響的可能的信號通路；（2）本研究未進一步對血糖波動及炎癥因子進行干預，明確改善心臟自主神經(jīng)的方式。

綜上所述，血糖波動可通過影響神經(jīng)營養(yǎng)因子及炎癥因子水平，引發(fā)交感-迷走神經(jīng)紊亂，加劇大鼠心臟自主神經(jīng)功能改變［30］；血糖波動比持續(xù)性高血糖對相關(guān)指標的影響更大；故而減少血糖波動進一步減輕炎癥因子的影響可能成為改善糖尿病心臟自主神經(jīng)病變的新治療靶點。在本研究的基礎(chǔ)上，下一步將通過對信號通路的研究深入分析血糖波動引起炎癥因子釋放導致心臟自主神經(jīng)病變的機制，并擬采用藥物干預的措施探討減少血糖波動而帶來的心臟自主神經(jīng)功能的改善。