楊 柳，陳子怡，喬 晨，楊澤康，萬舒凡，祁勇剛，吳勇超，高 冰，柳志杰*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430068；2.湖北聚匯農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，湖北 荊門 431821）

納豆（Natto）是一種工藝簡(jiǎn)單且營(yíng)養(yǎng)豐富的食品[1-2]，其含有的納豆激酶具有溶栓效果[3-5]。黃璇等[6]采用固相微萃取法鑒定納豆揮發(fā)性成分為47種，包括酮類、吡嗪類、醇類、酸類等15類有機(jī)揮發(fā)物，主要為川芎嗪（26.223%）、2,5-二甲基吡嗪（23.835%）、2,3-丁二酮（15.648%）、3-羥基-2-丁酮（1.676%）；TANAKA T等[7]檢測(cè)出74種納豆揮發(fā)性成分，丙酮（70.84%）和異丁酸甲酯（13.35%）是其主要揮發(fā)性成分；劉野等[8]對(duì)2種國(guó)內(nèi)納豆和5種日本納豆揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)日本納豆中吡嗪類和酮類物質(zhì)比國(guó)內(nèi)納豆含量高，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚為日本納豆特有揮發(fā)性成分。

鷹嘴豆是一種分布廣泛且營(yíng)養(yǎng)全面的豆科植物，以其極高的營(yíng)養(yǎng)與健康價(jià)值引起研究者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)代藥理研究表明鷹嘴豆提取物尤其是鷹嘴豆異黃酮類和皂苷類化合物具有降血糖、降血脂、降膽固醇、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、驅(qū)蟲等藥理活性[9-13]。羅倉(cāng)學(xué)等[15]以納豆激酶活性為指標(biāo)優(yōu)化了鷹嘴豆納豆發(fā)酵條件，最佳工藝為基質(zhì)含水量50%、接種量6%、發(fā)酵溫度34 ℃、發(fā)酵時(shí)間48 h、后熟時(shí)間20 h；張俊杰等[16]對(duì)采用篩選的三株菌發(fā)酵鷹嘴豆納豆進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，金黃色、表面有白色分泌物、濕潤(rùn)有光澤，并進(jìn)行了感官評(píng)分；金爽等[17]采用固載納豆菌發(fā)酵制備鷹嘴豆納豆，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其在硬度、光澤度、氣味和溶解性等方面都優(yōu)于以大豆制備的納豆，但未研究揮發(fā)性風(fēng)味成分。

學(xué)者們對(duì)以大豆為原料制備的納豆的揮發(fā)性成分進(jìn)行了較多的研究[6-8，18-22]，KIMURA K等[21]研究了大豆納豆發(fā)酵3 h、7 h、12 h、18 h時(shí)揮發(fā)性成分的變化，檢測(cè)到38種揮發(fā)性成分，蒸煮的大豆發(fā)酵后揮發(fā)性成分增加5種、減少6種，貢獻(xiàn)大的揮發(fā)性成分有12種，包括吡嗪類和支鏈脂肪酸。關(guān)于鷹嘴豆納豆揮發(fā)性成分的研究極少，該實(shí)驗(yàn)以鷹嘴豆為原料，接種納豆芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，采用頂空固相微萃?。╤ead space-solid phase micro-extraction，HS-SPME）和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）分析鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分，以初步探索鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中氣味物質(zhì)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

鷹嘴豆：廣州新糧年農(nóng)產(chǎn)品有限公司。

1.1.2 試劑氯化鈉（分析純）、蛋白胨（生化試劑）、酵母膏（生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 菌種與培養(yǎng)基

納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisNatto）：湖北工業(yè)大學(xué)食品釀造團(tuán)隊(duì)保藏菌種，菌種編號(hào)SPNA04。

液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPME手動(dòng)進(jìn)樣器、75 μm CAR-PDMS、100 μm PDMS萃取頭：美國(guó)Supelco公司；7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）：美國(guó)安捷倫公司；PC-420磁力恒溫?cái)嚢杵鳎好绹?guó)Corning公司；SW-CJ-2D凈化工作臺(tái)：廣州瑞智科學(xué)儀器有限公司；LHS-250SC型智能型恒溫恒濕箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；大型SLY-2112B型立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；YM系列A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鷹嘴豆納豆的制作工藝流程與操作要點(diǎn)

鷹嘴豆→浸泡→蒸煮→接種種子液→培養(yǎng)發(fā)酵→鷹嘴豆納豆

操作要點(diǎn)：

浸泡：100 g清洗好的鷹嘴豆在400 mL去離子水中20 ℃浸泡18 h。

蒸煮：將浸泡好的鷹嘴豆置于121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮30 min。

接種發(fā)酵：蒸熟的鷹嘴豆接種5 mL納豆菌種子液（菌落數(shù)為1.24×108CFU/mL）后置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，開始計(jì)時(shí)，將納豆在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)取出，攪拌觀察黏液類物質(zhì)量和拉絲狀態(tài)，測(cè)定理化指標(biāo)以及揮發(fā)性物質(zhì)。

1.3.2 樣品處理

稱量15 g納豆樣品置于50 mL樣品瓶中，放入50 ℃恒溫水浴鍋保溫20 min。將SPME萃取頭插入樣品瓶，推出纖維頭，50 ℃頂空吸附40 min，萃取完成后抽回纖維頭，從樣品瓶中拔出萃取頭，再將萃取頭插入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口進(jìn)行解吸。

1.3.3 HS-SPME-GC-MS分析鷹嘴豆納豆揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

氣相色譜條件：HP-5ms毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣：氦氣（He）；前進(jìn)樣口總流量：4 mL/min，不分流，前段樣口溫度260 ℃；Aux-2溫度：260 ℃；離子源溫度：230 ℃；MS四級(jí)桿溫度：150 ℃；柱溫：起始溫度40 ℃，以5 ℃/min升溫至150 ℃，再以10 ℃/min升溫至260 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，四級(jí)桿溫度150 ℃，傳輸線溫度280 ℃，掃描質(zhì)量范圍10～500 amu。

定性定量方法：通過美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）14標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，按照標(biāo)準(zhǔn)譜圖及保留指數(shù)對(duì)機(jī)檢結(jié)果進(jìn)行定性，采用面積歸一法對(duì)各組分進(jìn)行定量。

1.3.4 測(cè)定方法

還原糖的測(cè)定：參考GB 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》[23]；氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：參考GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[24]；納豆激酶活性的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鷹嘴豆納豆質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1.1 納豆感官評(píng)價(jià)

鷹嘴豆發(fā)酵制備的納豆，體態(tài)均一、豆粒飽滿，與傳統(tǒng)大豆納豆相比，鷹嘴豆納豆口感更酥軟，滋味方面差異不顯著，發(fā)酵過程中有濃郁的氨臭味。

2.1.2 發(fā)酵過程中鷹嘴豆納豆黏液類物質(zhì)變化

鷹嘴豆納豆分別發(fā)酵24 h、36 h、48 h、60 h的黏液類物質(zhì)變化見表1。由表1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，黏液物質(zhì)含量和拉絲長(zhǎng)度均是先增大后減小，發(fā)酵48 h的鷹嘴豆納豆攪拌后黏液類物質(zhì)量最大、拉絲最長(zhǎng)，發(fā)酵效果較理想，而其他發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的黏液量較少、且拉絲易斷。

表1 鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中黏液物質(zhì)分析Table1 Analysis of mucus substances in chickpea natto during fermentation process

2.1.3 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

從表2可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，鷹嘴豆納豆納豆激酶活性先增大而后有所減小，在48 h時(shí)最大，而還原糖和氨基酸態(tài)氮?jiǎng)t是逐漸減小?？赡苁请S著納豆菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，碳源和氮源逐漸降低，而納豆激酶活性隨納豆菌的代謝達(dá)到最高值時(shí)而后趨于穩(wěn)定。

表2 鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Table2 Determination results of physical and chemical indicators of chickpea natto during fermentation process

2.2 鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分分析

根據(jù)鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS總離子流色譜圖，對(duì)所有成分經(jīng)譜庫(kù)檢索和其他方法核實(shí)，從四個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的鷹嘴豆納豆中共鑒定出57種揮發(fā)性化合物，分別占各自總揮發(fā)性成分的73.34%、79.85%、82.0%、79.6%，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table3 Results of volatile components in chickpea natto during fermentation process analyzed by GC-MS

續(xù)表

鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量見圖1。由圖1和表3可知，鷹嘴豆納豆發(fā)酵24 h時(shí)揮發(fā)性成分為54種，其中主要揮發(fā)性成分為酸類，其次為酯類，主要揮發(fā)性成分為4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（7.49%）、3-甲氧基-4-羥基肉桂酸（阿魏酸，7.37%）、反式阿魏酸（6.31%）、乙酸乙酯（3.99%）；發(fā)酵36 h時(shí)揮發(fā)性成分為50種，其中主要揮發(fā)性成分為吡嗪類，其次是酸類，主要揮發(fā)性成分為2,3,5-三甲基吡嗪（14.55%）、反式阿魏酸（13.91%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（12.64%）、乙酸（2.96%）、3-甲氧基-4-羥基肉桂酸（2.74%）；發(fā)酵48 h為39種，其中主要揮發(fā)性成分與36 h一致,主要揮發(fā)性成分為2,3,5-三甲基吡嗪（21.12%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（17.95%）、反式阿魏酸（15.16%）、乙酸（3.22%）、3-甲氧基-4-羥基肉桂酸（2.85%）；發(fā)酵60 h的揮發(fā)性成分為37種，其中最主要的揮發(fā)性成分也與36 h一致，主要揮發(fā)性成分為2,3,5-三甲基吡嗪（23.32%）、反式阿魏酸（14.64%）、3-甲氧基-4-羥基肉桂酸（11.88%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（5.03%）、2,5-二甲基吡嗪（3.80%）。吡嗪類物質(zhì)相對(duì)含量先增大后減小，可能是其為美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，隨著發(fā)酵時(shí)間其相對(duì)含量逐漸增大，也會(huì)進(jìn)一步反應(yīng)生成其他復(fù)雜化合物；阿魏酸在鷹嘴豆中以酯化物的形式存在，納豆菌可能是分泌降解酯化物的酶系，從而是阿魏酸或反式阿魏酸百分比增大，同時(shí)其也會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為復(fù)雜酚類物質(zhì)。

圖1 鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量Fig.1 Types and contents of volatile components in chickpea natto during fermentation

2.3 鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分對(duì)比分析

鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分會(huì)有一定的變化。從表3可以看出，發(fā)酵24 h、36 h、48 h及60 h的鷹嘴豆納豆中分別鑒定出54、50、39和37種揮發(fā)性成分，分別占各自總揮發(fā)性成分的73.34%、79.85%、82%和79.6%，發(fā)酵24 h、36 h、48 h和60 h的納豆相同的揮發(fā)性成分共有35種，其中醇類9種（甲醇、乙醇、1-丁醇、1,4-戊二醇、2-戊醇、2-己醇、苯乙醇、苯甲醇、L-薄荷醇），醛類2種（乙醛、甘油醛），酮類4種（3-羥基-2-丁酮、4-羥基-2-丁酮、苯氧基-2-丙酮、8-羥基-2-辛酮），酸類7種（乙酸、丁酸、3-羥基丁酸、異丁酸、異戊酸、3-甲氧基-4-羥基肉桂酸、反式阿魏酸），酯類5種（乙酸乙酯、異丁酸甲酯、丁酸異丙酯、3-羥基丁酸乙酯、苯乙酸甲酯），烴類5種（2-甲基戊烷、十二烷、1-碘十二烷、十六烷、2,3,4-三甲基正己烷），其他3種（氨氣、N-（羥甲基）乙酰胺、2-甲基呋喃）。

鷹嘴豆納豆發(fā)酵過程中，含量較高的揮發(fā)性成分為乙醇、3-羥基-2-丁酮、乙酸、反式阿魏酸等，其中，乙醇、異丁酸甲酯及3-羥基丁酸乙酯的含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸減少，乙酸的含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈一直上升的趨勢(shì)，3-羥基-2-丁酮和3-甲氧基-4-羥基肉桂酸的含量呈現(xiàn)先減少后增多的變化趨勢(shì)，反式阿魏酸的含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)先大幅度增多后緩慢減少的變化趨勢(shì)，且反式阿魏酸為出現(xiàn)在發(fā)酵過程中含量最高的揮發(fā)性成分，這可能與鷹嘴豆的營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)。

相比于發(fā)酵36 h、48 h、60 h的鷹嘴豆納豆，發(fā)酵24 h的鷹嘴豆納豆中特有的成分有7種，分別為2-羥基-5-甲基苯乙酮（0.07%）、脫氫乙酸（6.23%）、5-甲基壬酸乙酯（0.30%）、亞油酸乙酯（0.32%）、油酸乙酯（0.16%）、9-十六碳烯酸乙酯（1.3%）、5-甲基十一烷（1.63%），總量為10.01%，鷹嘴豆納豆發(fā)酵24 h后揮發(fā)性成分減少7種，可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酯類物質(zhì)會(huì)分解為酸和醇類物質(zhì)，而醇類、酮類、烷烴類物質(zhì)會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)。

在36 h、48 h、60 h時(shí)新增了三種吡嗪類物質(zhì)，分別為2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪，三種吡嗪類物質(zhì)在發(fā)酵36 h時(shí)百分比大幅提高，含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，到達(dá)48 h后含量最高，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪（川芎嗪）在48 h含量最高，占比17.95%；酸類物質(zhì)含量隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)先減少后增加，其中在48 h時(shí)，反式阿魏酸占比15.16%；酯類物質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸從17.54%減少到2.89%，因此發(fā)酵48 h的鷹嘴豆納豆最好。

3 結(jié)論

鷹嘴豆納豆在發(fā)酵24 h、36 h、48 h及60 h時(shí)分別鑒定出54、50、39和37種揮發(fā)性成分，分別占各自總揮發(fā)性成分的73.34%、79.85%、82%和79.6%，皆含有醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、吡嗪類、烴類、氨氣、苯酚和其他類物質(zhì)，其中吡嗪類、酸類、酯類是主要的鷹嘴豆納豆揮發(fā)性成分。含量較高的相同揮發(fā)性成分乙醇、異丁酸甲酯及3-羥基丁酸乙酯的含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸減少，乙酸的含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈一直上升的趨勢(shì)，3-羥基-2-丁酮和3-甲氧基-4-羥基肉桂酸的含量呈現(xiàn)先減少后增多的變化趨勢(shì)，反式阿魏酸百分比隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增多后緩慢減少的趨勢(shì)，且反式阿魏酸為四種發(fā)酵時(shí)間中相對(duì)含量最高的揮發(fā)性成分。

發(fā)酵24 h鷹嘴豆納豆未檢出吡嗪類物質(zhì)，而發(fā)酵36 h、48 h、60 h均可檢出，包括2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，鷹嘴豆納豆揮發(fā)性成分種類逐漸減少，但在發(fā)酵48 h時(shí)，2,3,5,6-四甲基吡嗪和反式阿魏酸的相對(duì)含量達(dá)到峰值，此時(shí)黏液含量最大，且拉絲最長(zhǎng)，因此發(fā)酵時(shí)間為48 h的鷹嘴豆納豆品質(zhì)高于其它3個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的鷹嘴豆納豆。