劉靖晶，張欣蕊，程 麗，孫來軍，李沖偉*

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；3.黑龍江大學(xué) 電子工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080）

酒精工業(yè)作為國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)，在釀酒、醫(yī)藥衛(wèi)生、新能源等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-2]。人們對酒精溶液的研究已有較長歷史，早期以酒精質(zhì)量檢測為主[3-5]，近十幾年來，隨著燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們開始關(guān)注不同濃度乙醇燃燒熱值的差異原因；在食品產(chǎn)業(yè)方面，人們希望利用簡便快捷的方法鑒別出發(fā)酵酒和配制酒[6]，然而，這些都與乙醇溶液的微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)[7-8]。因此，各國學(xué)者將紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜和X-射線衍射等多種光譜學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，開展對乙醇-水溶液微觀結(jié)構(gòu)的研究[9-15]。盡管國內(nèi)外學(xué)者采用實驗和理論模擬方法相結(jié)合對乙醇-水溶液微觀結(jié)構(gòu)做了大量研究[16-17]，但至今仍未得到統(tǒng)一的結(jié)論，特別是乙醇-水溶液微觀結(jié)構(gòu)變化對食品質(zhì)量的影響鮮有報道。

水分活度表示食品中水逸出的程度，間接反映食品中自由水?dāng)?shù)量，與食品保藏時間密切相關(guān)[18]。電導(dǎo)率表示液體溶液的導(dǎo)電能力，受到液體中乙醇濃度和離子數(shù)量的影響[19]。聲速值表示聲音在溶液中的傳播速度，與溶液微觀結(jié)構(gòu)的疏密程度有關(guān)[20]。本實驗通過測定乙醇溶液不同質(zhì)量濃度和時間聲速、水分活度和電導(dǎo)率的變化，結(jié)合乙醇溶液分子基團(tuán)振動頻率的響應(yīng)、探究乙醇溶液宏觀物理參數(shù)與微觀結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系，以期更好地闡明乙醇溶液物理特性的變化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇（99.99%）（優(yōu)級純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氯化鈉、尿素（均為分析純）：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DSA48密度聲速儀（density and sound velocitymeter，DSV）：奧地利安東帕有限公司；HD-4水分活度測量儀（water activity meter，WAM）：上海精密儀器儀表有限公司；FT-NIR傅里葉變換近紅外光譜（near infrared spectrometer，NIR）儀：美國Perkin Elmer公司；EC 214電導(dǎo)率儀（conductivity meter，CM）：上海加惠儀器儀表有限公司；LCQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Finnigan公司；HP 1100高效液相色譜系統(tǒng)：美國惠普公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

乙醇溶液（不加尿素）組：乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為5%、14%、38%和45%（20 ℃）；

乙醇溶液（加尿素）組，添加尿素0.5 g/100 mL：乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為5%、14%、38%和45%（20 ℃）。由于溶質(zhì)的介入會影響溶液中分子間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，尿素作為生物體內(nèi)常見的小分子有機(jī)滲透劑，加入尿素破壞乙醇溶液中乙醇分子與水分子的氫鍵作用，探究乙醇分子與水分子氫鍵作用對乙醇溶液物理特性的影響[21]。

1.3.2 聲速的測定

利用密度聲速儀測定不同體積分?jǐn)?shù)乙醇樣品在貯藏不同時間（5 d、15 d、30 d和60 d）的聲速[22]。

1.3.3 水分活度的測定

利用水分活度儀測定不同體積分?jǐn)?shù)乙醇樣品在貯藏不同時間（5 d、15 d、30 d和60 d）的水分活度[23]。水分活度儀開機(jī)預(yù)熱30 min，利用配制24 h飽和氯化鈉溶液進(jìn)行儀器校正，測定時把測量樣品放置在20 ℃恒溫槽中，保持測量溶液溫度一致。

1.3.4 電導(dǎo)率的測定

利用電導(dǎo)率儀測定不同體積分?jǐn)?shù)乙醇樣品在貯藏不同時間（5 d、15 d、30 d和60 d）的電導(dǎo)率[24]。電導(dǎo)率儀開機(jī)預(yù)熱30 min，利用0.1%KCl溶液進(jìn)行校正，把測量樣品放置在20 ℃恒溫槽中，保持測量溶液溫度一致。

1.3.5 近紅外光譜的測定

利用傅里葉變換近紅外光譜儀測定不同體積分?jǐn)?shù)乙醇樣品貯藏不同時間（5 d和60 d）以及添加尿素不同體積分?jǐn)?shù)乙醇樣品在貯藏5 d的近紅外光譜。光譜采集參數(shù)：儀器信號能量為5 eV，參比材料為石英比色皿，光程為1 mm，掃描分辨率16 cm-1，掃描次數(shù)為32次。對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行移動窗口平均平滑處理，提高譜圖的信噪比；以馬氏距離為指標(biāo)對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，剔除異常光譜數(shù)據(jù)[25]。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件版本16.0處理數(shù)據(jù)，結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SD），通過單因素方差分析（analysisof variance，ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，進(jìn)行最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法檢驗，P＜0.05表示數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)和貯存時間對乙醇溶液聲速的影響

由圖1可知，對于不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，隨著貯存時間增加，聲速變化完全不同。乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%、38%和45%總體呈現(xiàn)下降趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%在貯存時間內(nèi)變化較小。對于不同貯存時間，4種體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（5%、14%、38%和45%）聲速變化趨勢基本一致，即隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，聲速呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)為38%的聲速最高。由于液體沒有剪切彈性，只能縱波形式傳播，在線性聲學(xué)條件下，溶液的聲速由溶液本身的體積彈性模量和密度決定，介質(zhì)的彈性模量愈大，密度愈小，聲速愈大[26]。乙醇溶液密度隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈線性下降，說明乙醇聲速變化主要由體積彈性模量引起的，而體積彈性模量強(qiáng)弱取決于分子結(jié)構(gòu)[27]，可見，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液微觀結(jié)構(gòu)存在顯著差異（P＜0.05）。

圖1 4個貯存時間不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的聲速值Fig.1 Sound velocity of ethanol solutions of different concentration for 4 storage time

盡管尿素添加能夠破壞乙醇溶液分子結(jié)構(gòu)的氫鍵作用，導(dǎo)致乙醇溶液聲速變化，但這種變化不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），對聲速變化趨勢無影響，說明尿素添加只是破壞了部分氫鍵，還有許多氫鍵維持著乙醇溶液不同的空間結(jié)構(gòu)。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)和貯存時間對乙醇溶液水分活度的影響

由圖2可知，對于體積分?jǐn)?shù)為5%和14%的乙醇溶液，在貯存時間水分活度的變化趨勢基本一致。第5天開始急劇上升，15 d后急劇下降，即乙醇分子與水分子形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。對于體積分?jǐn)?shù)為38%和45%的乙醇溶液，在貯存時間水分活度變化趨勢基本一致，第5天開始急劇上升，與38%相比45%體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液上升速率更快。15 d均達(dá)到最高，然后緩慢下降。說明高濃度乙醇溶液，形成空間穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的速度更慢，而且在形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)過程中，存在著水分子氫鍵的斷裂和重新結(jié)合，有自由水釋放和結(jié)合的變化[28]。在不同貯存時間，4種體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（5%、14%、38%和45%）的相關(guān)關(guān)系基本一致，水分活度值差異均不顯著（P＞0.05），但低濃度組（5%和14%）和高濃度組（38%和45%）乙醇溶液間水分活度值存在顯著差異（P＜0.05）。說明高濃度乙醇溶液乙醇分子與水分子形成更多的共價鍵，使溶液中自由水含量降低，這和水分活度基本理論是一致的。

圖2 4個貯存時間不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的水分活度Fig.2 Water activity of ethanol solutions of different concentration for 4 storage time

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)和貯存時間對乙醇溶液電導(dǎo)率的影響

由圖3可知，對于體積分?jǐn)?shù)為5%和14%的乙醇溶液，隨著貯存時間的增加，電導(dǎo)率先緩慢下降，15 d和30 d無明顯變化，30 d后開始轉(zhuǎn)為上升，60 d電導(dǎo)率回到起點。對于體積分?jǐn)?shù)為38%和45%的乙醇溶液，隨著貯存時間的增加，電導(dǎo)率先急劇上升，再急劇下降，30 d后開始轉(zhuǎn)為上升，60 d電導(dǎo)率又回到起點。在不同貯存時間，4種體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的電導(dǎo)率基本保持相同線性關(guān)系。乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)從5%、14%到38%，電導(dǎo)率始終保持下降趨勢（P＜0.05），乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為38%和45%時電導(dǎo)率差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 4個貯存時間不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的電導(dǎo)率Fig.3 Conductivity of ethanol solutions of different concentration for 4 storage time

由此說明，隨著貯存時間的增加，乙醇分子與水分子的結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生著變化，電導(dǎo)率下降后又上升，空間結(jié)構(gòu)從疏松到致密，再到疏松穩(wěn)定，體積分?jǐn)?shù)38%和45%乙醇溶液電導(dǎo)率無顯著差異。

2.4 不同貯存時間乙醇溶液的近紅外光譜圖

圖4為貯存時間5 d和60 d，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的近紅外光譜圖，由圖4可知，波長960 nm處為非鍵合羥基伸縮振動二級倍頻吸收峰，該處吸收峰為氫鍵的研究提供重要的信息；波長1 190 nm處為甲基二級倍頻吸收峰；波長1 460～1 600 nm處寬吸收峰為氫鍵鍵合的醇，歸為羥基的分子內(nèi)鍵合；波長1 701 nm和1 732 nm處為甲基吸收峰；波長1 762 nm處為亞甲基一級倍頻吸收峰，表示-CH2的對稱伸縮振動。

從圖4短波區(qū)可見，波長960 nm處，體積分?jǐn)?shù)5%和14%乙醇溶液吸收峰強(qiáng)于38%和45%，說明體積分?jǐn)?shù)5%和14%乙醇空間結(jié)構(gòu)游離羥基多于38%和45%，38%和45%更多的羥基與周圍水分子形成了氫鍵，可以證實，5%和14%羥基掛在外側(cè)，體積分?jǐn)?shù)越高，羥基越多，和38%（或45%）的外層結(jié)構(gòu)完全不同。波長1 190 nm和1 701 nm兩處甲基吸收峰顯示乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，吸收峰越強(qiáng)，這符合高濃度乙醇溶液甲基基團(tuán)多的規(guī)律[25]。在波長1 732 nm 吸收峰處，體積分?jǐn)?shù)5%和14%乙醇溶液沒有吸收峰，更說明與38%（或45%）微觀結(jié)構(gòu)不同。1 762 nm處為亞甲基一級倍頻吸收峰處，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)越低，吸收峰強(qiáng)度越強(qiáng)，且明顯發(fā)生藍(lán)移（向波長增大方向移動），說明低濃度時CH-基團(tuán)與水分子發(fā)生作用，導(dǎo)致-CH2伸縮振動頻率隨濃度降低發(fā)生進(jìn)一步藍(lán)移。

圖4 5 d和60 d對照組不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液紅外光譜及短波區(qū)和長波區(qū)譜圖Fig.4 Infrared spectra and the short-wave and long-wave regions spectra of different concentrations ethanol solutions of the control group for 5 d and 60 d

從圖5短波區(qū)可見，960 nm吸收峰處，體積分?jǐn)?shù)為5%和14%乙醇溶液加尿素破壞氫鍵，卻導(dǎo)致非鍵合羥基較少，又因為尿素添加對亞甲基上的氫鍵影響不大（1 762 nm處吸收峰無明顯變化），推測尿素更多是破壞了水之間氫鍵，造成水多聚體產(chǎn)生較多空洞，這可能提高溶液導(dǎo)電性能。1 701 nm和1 732 nm處為甲基吸收峰，體積分?jǐn)?shù)為5%和14%乙醇溶液均未出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，而體積分?jǐn)?shù)為38%和45%均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，同前面的結(jié)論一樣，證明乙醇體積分?jǐn)?shù)＞38%，乙醇微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，在1 732 nm吸收峰通常是線型C-H化合物在一級倍頻區(qū)最強(qiáng)的譜帶，亞甲基發(fā)生扭擺彎曲，實驗組添加尿素吸收峰強(qiáng)度沒有改變，更加證實了高濃度乙醇溶液籠狀穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的猜想。

圖5 5 d實驗組和對照組不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液紅外光譜及短波區(qū)和長波區(qū)譜圖Fig.5 Infrared spectra and the short-wave and long-wave regions spectra of different concentrations ethanol solutions of the experimental group and control group for 5 d

3 討論

測定4種體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的聲速，結(jié)果表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，聲速呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，體積分?jǐn)?shù)38%乙醇溶液聲速最高。根據(jù)聲速值的定義可知，不同濃度乙醇溶液微觀結(jié)構(gòu)存在差異，體積分?jǐn)?shù)38%附近正好是乙醇-水分子微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的區(qū)域，這與吳斌[11]的結(jié)論一致。

測定4種體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的水分活度，結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)越高，水分活度越低，說明自由水含量越低，說明乙醇分子和水分子形成結(jié)合共價鍵。隨著貯存時間延長，4種乙醇溶液變化趨勢不一致，體積分?jǐn)?shù)5%和14%乙醇溶液水分活度呈下降趨勢，體積分?jǐn)?shù)38%和45%乙醇溶液水分活度貯存15 d達(dá)到最高值，說明高濃度乙醇溶液形成穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)的過程更漫長，推測分子間氫鍵形成可能存在前后關(guān)系或持續(xù)變化，乙醇-水分子的空間微觀結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定和致密。尿素添加能夠破壞一部分氫鍵作用，但對乙醇-水分子微觀結(jié)構(gòu)無顯著影響。

測定4種體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的電導(dǎo)率和近紅外光譜，5%、14%和38%差異顯著（P＜0.05），38%和45%差異不顯著（P＞0.05），說明體積分?jǐn)?shù)5%、14%和38%空間微觀結(jié)構(gòu)差異較大，體積分?jǐn)?shù)為38%和45%結(jié)構(gòu)微觀結(jié)構(gòu)差別不大。隨著貯存時間延長，4種體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的電導(dǎo)率均出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，表明乙醇溶液微觀結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化；體積分?jǐn)?shù)為38%和45%乙醇溶液再次表現(xiàn)出近似一致的變化趨勢，也說明兩種乙醇溶液微觀結(jié)構(gòu)近似。這與DIXIT S等[29]對甲醇-水溶液的紅外光譜分析一致。這一結(jié)論可以用于酒類發(fā)酵年份和真假酒類鑒別，為酒類飲品智能化管理提供了新的方法。

4 結(jié)論

通過測定乙醇溶液宏觀物理參數(shù)，發(fā)現(xiàn)這些物理參數(shù)的變化規(guī)律，并利用NIR從微觀結(jié)構(gòu)水平解釋乙醇溶液物理參數(shù)與氫鍵作用的相互關(guān)系。結(jié)果表明，聲速值與乙醇體積分?jǐn)?shù)并不存在線性關(guān)系。加入尿素，對不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液聲速值影響不同，但不會影響任何乙醇溶液的總體變化趨勢。乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，水分活度越低。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，4種體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液電導(dǎo)率呈下降趨勢。隨著貯存時間的延長，乙醇溶液微觀結(jié)構(gòu)不斷變化。盡管本論文僅用NIR解釋氫鍵作用略顯匱乏，但從乙醇分子微觀結(jié)構(gòu)去解釋乙醇產(chǎn)品質(zhì)量特性，在食品領(lǐng)域具有較好的創(chuàng)新價值，具有重要的理論意義。