王撼宇，孫曉仲，雷志鵬，陳 歡，王 剛，張斯童，陳 光，孫 旸*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 秸稈生物學(xué)與利用教育部重點實驗室，吉林 長春 130118；2.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，吉林 長春 130118）

微生物感染致死已經(jīng)可以影響全球死亡的趨勢?？股氐某霈F(xiàn)則打破了這種趨勢，并給予了人們戰(zhàn)勝病原微生物的希望。雖然抗生素曾經(jīng)能夠治療生物體內(nèi)絕大多數(shù)的感染，但使用抗生素后生物體內(nèi)不斷產(chǎn)生的耐藥性會逐漸減弱抗生素的作用效果。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了人體內(nèi)許多部位（如泌尿道、呼吸道等）的病原體會產(chǎn)生出對抗生素的耐藥性。所以說設(shè)計出比傳統(tǒng)抗生素更不易受進(jìn)化抗性機(jī)制影響的抗菌藥物是一個新的挑戰(zhàn)。抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物在長期進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境、求得生存而最早產(chǎn)生的免疫活性分子，是天然免疫的重要介質(zhì)，在宿主對抗病原入侵的免疫防御中起著極其重要的作用，被形象地稱為“天然抗菌劑”。抗菌肽在體內(nèi)除了能以直接殺死病原菌的方式起作用外，更多的時候是作為免疫效應(yīng)分子來啟動、調(diào)節(jié)宿主免疫防御體系。它們的工作原理是破壞細(xì)胞膜，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減緩炎癥。由于它們引起抗藥性的可能性相對較低，因此一直認(rèn)為AMPs是常規(guī)抗生素的潛在替代品。因此，AMPs成為國內(nèi)外研究和開發(fā)的熱點，具有著廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。本文對抗菌肽殺滅細(xì)菌作用機(jī)理及病原微生物耐受抗菌肽的基本原理進(jìn)行綜述，旨在深入了解AMPs的抗菌機(jī)制和微生物對其耐藥機(jī)制，將為AMPs進(jìn)一步開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 抗生素的發(fā)展史

目前可能存在一個誤解，誤認(rèn)為人類最早接觸抗生素的時間在20世紀(jì)初，但其實際接觸的時間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于這個時間。早在古埃及、中國、希臘和羅馬中都有記載使用抗生素來治療細(xì)菌感染的記錄，當(dāng)時使用發(fā)霉的面包對感染的患者進(jìn)行治療[1]。在古蘇丹努比亞人（公元350-550年）和古埃及人的骨骼遺骸中發(fā)現(xiàn)了與現(xiàn)代抗生素有關(guān)的四環(huán)素結(jié)構(gòu)物質(zhì)等[2-4]。因此從這些證據(jù)可以看出，人類接觸并使用抗生素要比認(rèn)知的時間早得多。

GERHARD DOMAGK于1935年介紹了第一個廣泛使用的抗生素，即磺胺嘧啶，在多種傳染性疾病中均具有抗菌活性。隨后發(fā)現(xiàn)偶氮磺胺是合成對氨基苯磺胺的前體，并且還沒有申請相對應(yīng)的專利，這才導(dǎo)致了后續(xù)其衍生物以及磺酰胺類抗生素的時代的到來[5]。青霉素是最著名的抗生素之一，于1928年由亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)，在第二次世界大戰(zhàn)期間開始大規(guī)模生產(chǎn)以及使用，隨后霍華德·弗洛里和歐內(nèi)斯特·鏈進(jìn)行了合成和純化[2，6]。1944年，塞爾曼·瓦克斯曼從灰鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了一種氨基糖苷類抗生素，并將其命名為鏈霉素[7-8]，因此他被稱為是“抗生素之父”，這標(biāo)志著抗生素黃金時代的開始。在隨后的幾十年中，發(fā)現(xiàn)了20多種不同類型的抗生素，包括幾種不同的類型：磺酰胺，β-內(nèi)酰胺類（青霉素、頭孢菌素），氨基糖苷類，喹諾酮類，環(huán)肽（包括短桿菌肽、多粘菌素、糖肽、脂肽和脂糖肽），四環(huán)素，大環(huán)內(nèi)酯類（包括酮醇類），苯甲酚，硝基咪唑，二氫葉酸還原酶抑制劑，林沙酰胺等。自從抗生素首次出現(xiàn)以來，它已經(jīng)改變了醫(yī)學(xué)的進(jìn)程，并且拯救了全世界無數(shù)的生命。以前無法治療的傳染病及其災(zāi)難性后果現(xiàn)在可以很容易控制。但是，耐藥性問題隨之也出現(xiàn)了。在1940年，青霉素還沒有開始大規(guī)模生產(chǎn)時候，就已經(jīng)報道出了葡萄球菌對青霉素產(chǎn)生了耐藥性。在1958年，古霉素被報道出現(xiàn)了耐藥性。在那個抗生素生產(chǎn)的黃金時代，新型抗生素不斷被發(fā)現(xiàn)和開發(fā)用于臨床。但耐藥性的細(xì)菌以及真菌也在不斷的進(jìn)化，因此，迫切需要具有替代作用模式的新型抗感染藥物來對抗不斷進(jìn)化的耐藥性的細(xì)菌與真菌。AMPs被認(rèn)為是傳統(tǒng)抗生素在某些治療用途上的可能替代品，它引起耐藥性[9]的可能性相對較小，因此有很大的應(yīng)用和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2 抗菌肽介紹

AMPs是生物體內(nèi)由特定基因編碼并通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的，以一種非常重要的防御體系廣泛的存在與植物、動物以及微生物中。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)許多不同AMPs，據(jù)報道，它們對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌、感染性真菌均有抗菌活性，有時還具有對病毒、寄生蟲或瘧原蟲的抗菌抗活性[10-11]。其中許多還被證明通過激活免疫細(xì)胞來調(diào)節(jié)宿主免疫、炎癥或者抑制炎癥。為了強(qiáng)調(diào)其在高等生物中的多效性，天然AMPs通常被稱為“宿主防御肽”（host defense peptide，HDP），或者稱為“先天性防御調(diào)節(jié)肽（innate defense regulatory peptide，IDR）”。關(guān)于其免疫調(diào)節(jié)活性的報告大多在先天免疫水平上[12]。它們在所有真核生物（真菌、藻類、植物、無脊椎動物和脊椎動物）中含量豐富，分布在宿主防御感染前線的細(xì)胞和組織中（主要是循環(huán)免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞），證明了它們對先天免疫的影響和重要性?？刮⑸镫牡膶ｉT收集數(shù)據(jù)庫中（CAMPR3）目前包含8164個肽條目，一個特別豐富的來源是無尾物種，已經(jīng)報告了近2 000個肽序列[13]。然而，AMPs在原核生物中也有很好的代表性，由革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌產(chǎn)生，其中一個豐富的類別就是細(xì)菌素[14]。AMPs是一種天然的低分子質(zhì)量多聚肽，長度為9～100個氨基酸。盡管AMPs在結(jié)構(gòu)和生化特性上具有高度的多樣性，但大多數(shù)AMPs都含有帶正電荷的氨基酸殘基、疏水或親水基序，這些決定了它們的水溶性且可以與帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜相互作用[15-19]。雖然抗菌肽的抗菌作用機(jī)制比較復(fù)雜，但許多抗菌肽通過與細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)合和改變細(xì)胞膜的通透性來快速殺傷細(xì)胞或穿透細(xì)胞，抑制蛋白質(zhì)合成、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）轉(zhuǎn)錄/復(fù)制、細(xì)胞壁生物合成或使基本酶活性失活。革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生的AMPs具有特殊的抑制譜，并且已經(jīng)應(yīng)用在很多方面[20-25]。AMPs除了用于治療感染外，還可用于控制植物病害。天然AMPs的合成類似物已在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，以保護(hù)植物免受感染，或被微生物分泌，然后用作商業(yè)生物農(nóng)藥的活性成分。重組或合成的AMPs可以安全地用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的治療、牲畜的食品添加劑或食品防腐劑。

3 AMPs的抗菌機(jī)制

3.1 靶點結(jié)合

盡管已經(jīng)證實了AMPs是通過讓細(xì)胞膜破裂來使細(xì)胞溶解，達(dá)到抗菌作用[26]（見圖1）。

圖1 抗菌肽對細(xì)胞膜的作用機(jī)制Fig.1 Mechanism of antimicrobial peptides on cell membrane

但隨后發(fā)現(xiàn)抗菌機(jī)制不只有這一種，在致病細(xì)菌中加入AMPs后所進(jìn)行的分析中發(fā)現(xiàn)，有些AMPs并沒有改變致病細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，但卻仍然能夠起到了抗菌的效果，因此AMPs除了形成細(xì)胞膜孔隙之外，還與細(xì)胞內(nèi)的肽作用靶點相結(jié)合[27-28]，且許多微生物即使在其膜受到廣泛損害后仍能存活，這表明不涉及膜溶解的其他機(jī)制可能也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[29]。需要注意的是，為了使AMPs和靶細(xì)胞內(nèi)成分之間發(fā)生相互作用，肽需要通過易位過程被運(yùn)輸?shù)轿⑸镏衃30]。但這一過程的機(jī)制尚未明確，但推測細(xì)胞膜上的孔隙在AMPs的促進(jìn)下，使得一些肽轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)部，并將作用于細(xì)胞內(nèi)靶點。AMPs進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)并與其靶點結(jié)合，起到抗菌的效果[31-32]。

3.2 干擾細(xì)胞壁的合成

羊毛硫抗生素是由革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生的一類細(xì)菌素，其中有些AMPs作為酶抑制劑，主要干擾競爭性微生物的細(xì)胞壁合成。其機(jī)制是AMPs與脂質(zhì)II結(jié)合，從而阻止合成細(xì)胞壁的前體—肽聚糖的聚合[33-34]。這種抑制作用也可能是由AMPs與細(xì)胞壁合成過程中的其他酶（如與肽聚糖易位有關(guān)的酶）結(jié)合引起的。一般來說，這是一種對抗革蘭氏陽性細(xì)菌更有效的方法，因為它們的細(xì)胞壁中含有大量的肽聚糖[35]。從植物和昆蟲中分離到了有效的抗真菌抗菌肽。ZENG H等[36]通過研究從阿克蘇芽孢桿菌中提取出來的TUBP1蛋白，發(fā)現(xiàn)破壞真菌細(xì)胞壁合成（由幾丁質(zhì)組成）也是由一些以AMPs主導(dǎo)的機(jī)制。KLAUS K等[37]從甜菜（Beta vulgarisL.）中提取的IWF4是一種富含半胱氨酸和甘氨酸的30個氨基酸肽，顯示出一個具有幾丁質(zhì)結(jié)合特性的結(jié)構(gòu)域，能夠有效的抵抗真菌對于甜菜的破壞。FEHLBAUM P等[38]從果蠅昆蟲中分離出來的一種44氨基酸的抗真菌果蠅霉素。

3.3 其他機(jī)制

其他機(jī)制，如作用在細(xì)胞生長和增殖所必需的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中，AMPs可以與DNA和RNA的結(jié)合，致使涉及這些核酸的合成過程受到抑制（見圖2）。

圖2 抗菌肽對細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制Fig.2 Mechanism of antimicrobial peptides in cells

如抑制主要的DNA復(fù)制酶，這已經(jīng)是一種非常普遍的抗菌機(jī)制[39-40]。通過對CF-14肽抗菌作用觀察發(fā)現(xiàn)，其對DNA具有高度親和力，因此可以導(dǎo)致微生物功能的改變，達(dá)到抗菌效果[41]。通過對富含脯氨酸的抗菌肽觀察發(fā)現(xiàn)，其中含有其他配體，它們與主要熱休克蛋白特異結(jié)合，而與細(xì)菌伴侶無特異性結(jié)合。這些機(jī)制抑制了這些蛋白質(zhì)的活性，從而破壞基本的細(xì)胞合成過程[42-43]。一些AMPs可能與真菌細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，促進(jìn)其插入細(xì)胞質(zhì)，然后以非溶解方式誘導(dǎo)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的丟失，這將會破壞細(xì)胞周期，導(dǎo)致對細(xì)胞有毒有害的活性氧的產(chǎn)生[44]，致使細(xì)胞死亡。

4 微生物對AMPs的耐藥機(jī)制

多年來，由于濫用和不加控制地使用抗菌物質(zhì)導(dǎo)致了過去一些非常高效的抗生素和抗菌分子已經(jīng)不能夠有效的抑菌抵抗，盡管這種現(xiàn)象是微生物進(jìn)化的自然現(xiàn)象[45]，但這對人類抵抗致病微生物是一個非常大的挑戰(zhàn)。對于微生物來說，仍然有很多機(jī)制來應(yīng)對抗生素和抗菌分子對其造成的威脅?？傮w來說，微生物應(yīng)對AMPs的主要策略為：組成型抗性和誘導(dǎo)型抗性。組成型抗性，也稱為被動型抗性，表現(xiàn)出利用微生物機(jī)體固有的用來抵抗的機(jī)制（見圖2）。誘導(dǎo)或適應(yīng)型抗性是為了響應(yīng)AMPs的存在或其作用而觸發(fā)的機(jī)制[46]。

4.1 組成型抗性

組成型抗性的形成是由膜能量的改變和靜電屏蔽所形成的。膜能量的改變主要是堿性氨基酸向膜表面的移位，這將會導(dǎo)致其液體電荷發(fā)生變化。這樣一來，AMPs與膜的親和力降低，從而改變了它們的連接機(jī)制，這也是靜電屏蔽形成的結(jié)果，電荷變化主要是發(fā)生在革蘭氏陽性菌（外膜）中[47-48]。組成型抗性的一個例子是金黃色葡萄球菌中dlt操縱子的激活，dltA，dltB，dltC和dltD基因通過將堿性氨基酸D-丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到膜的表面來影響菌壁磷壁酸的電荷，主要表現(xiàn)為電荷的減少。膜上電荷的這種變化降低了膜與AMPs的親和力，破壞了最開始形成的和隨后形成的的抗菌作用。在其他革蘭氏陽性細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了類似的機(jī)制[49-50]。在革蘭氏陰性中，組成型抗性有兩個主要機(jī)理。其中一種抗性機(jī)制的形成是在外膜上的脂多糖類的脂質(zhì)A形成靜電屏蔽來減少外膜凈負(fù)電荷來實現(xiàn)的[51-52]。另外一種抗性機(jī)制是因為脂質(zhì)A之間的疏水相互作用增加，改變了膜的通透性，從而減少或完全阻止了AMPs的插入以及隨后形成的孔和分子的移位[53]。

圖3 微生物對抗菌肽的抗性機(jī)制Fig.3 Resistance mechanism of microbial to antimicrobial peptides

4.2 誘導(dǎo)型抗性

在誘導(dǎo)型抗性的機(jī)制中，主要是指蛋白酶和肽酶的流動、外排泵的激活以及靶點的突變修飾。第一種機(jī)制是指使用降解蛋白質(zhì)和肽的酶來“殺死”威脅細(xì)胞活力的AMPs。這些酶可以被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外環(huán)境中起到作用，也可以作用于受到攻擊的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，降解轉(zhuǎn)位肽并阻止它們作用于細(xì)胞內(nèi)靶點[54]。在這種情況下，外排泵被激活并開始工作，將轉(zhuǎn)運(yùn)肽泵回到細(xì)胞外環(huán)境并保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部[55-56]。SHAFER W M等[57]在觀察淋病奈瑟菌在暴露于蛋白朊pro tegrin-1和人源抗菌肽LL-37之后，這種外排泵激活才被發(fā)現(xiàn)。SIEPRAWSKA-LUPA M等[58]研究發(fā)現(xiàn)，人源抗菌肽LL-37會被金黃色葡萄球菌溶血素蛋白酶所滅活。最后，靶點的突變修飾是需要更詳細(xì)地闡明的機(jī)制，它被認(rèn)為是基于細(xì)胞膜和胞內(nèi)AMPs靶點的瞬時突變，以減少甚至阻止肽與其受體的結(jié)合[59-60]。如VISSER L G等[61]研究發(fā)現(xiàn)，病原體小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌會改變外膜蛋白的產(chǎn)生，以防止AMPs相互作用。NURI R等[62]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)部吞噬作用的發(fā)生會受到細(xì)胞外信號（如pH和鹽濃度變化，例如鎂和鈣）的調(diào)節(jié)影響。

5 AMPs的應(yīng)用前景展望

目前，AMPs在人類和動物健康以及食品工業(yè)中的應(yīng)用越來越多，人們逐漸的在尋找傳統(tǒng)合成化學(xué)品的替代品，因為這些傳統(tǒng)的化學(xué)品已經(jīng)失去了有效性或消費(fèi)者的可接受性。

據(jù)報道，MARTINEZ M等[63]通過人工設(shè)計并合成的陽離子抗菌肽P5通過增加質(zhì)膜的通透性來抑制耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌（該耐藥微生物是引起醫(yī)院感染的主要病原體之一），此外，P5肽還能抑制生物膜產(chǎn)生的能力，這是為了應(yīng)對出現(xiàn)的持續(xù)和反復(fù)的污染。類似的研究表明，BUONOCORE F等[64]從南極冰魚中提取出的氯霉素m3a肽對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腸球菌屬（與抗生素耐藥感染相關(guān)的重要病原體）都具有很好的抗菌效果。這些研究證明了AMPs在治療中的巨大潛力。

盡管已經(jīng)研究了AMPs的幾種功能，但是由于缺乏對其觀察和使用可行模式的研究，其應(yīng)用仍然受到限制。很少有AMPs被批準(zhǔn)用于臨床用途，MARGIT M等[65]研究發(fā)現(xiàn)，多粘菌素B可以用于治療具有多重耐藥性的革蘭氏陰性細(xì)菌感染。大多數(shù)研究集中在AMPs的使用，如包裝和醫(yī)院用品。例如，與標(biāo)準(zhǔn)衛(wèi)生技術(shù)相比，RIORDAN L等[66]在醫(yī)院使用的金屬表面加入了合成的人類抗生素，可有效降低微生物數(shù)量，減少耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、腸球菌和銅綠假單胞菌的數(shù)量。對于AMPs的生物活性改性包裝，這不僅是將其高科技的應(yīng)用還具有潛在的消費(fèi)市場。研究表明，與直接在食品中施用相比，乳鏈菌肽在包裝中的應(yīng)用具有優(yōu)越性，可降低生產(chǎn)成本并改善抗菌作用。IMRAN M等[67]將乳鏈菌肽Z（nisin Z）制成生物可降解薄膜，SOTO K M等[68]將Nisin制成電紡纖維，BARBOSA A A T等[69]所研制的乳鏈菌素纖維素膜，這些在運(yùn)用于食品包裝時，能夠有效的減少與食物中毒和/或腐敗相關(guān)的李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸膜明串珠菌、金黃色葡萄球菌、酸熱脂環(huán)酸桿菌和蠟狀芽孢桿菌的數(shù)量。其他幾種多肽也在被研究應(yīng)用在食品工業(yè)中，如SHWAIKI L N等[70]通過人工合成肽Dip KK-14和KK-14 R10能夠良好的抵抗食物之中的食品腐敗菌，然而對于其的包裝應(yīng)用在食品工業(yè)還需要進(jìn)一步研究。

考慮到當(dāng)前對傳統(tǒng)消毒和治療物質(zhì)的抗性問題，AMPs的使用已成為將來控制病原體的主要替代方法之一。AMPs的副作用小，同時對于耐藥性細(xì)菌能夠產(chǎn)生出很好的抑菌效果，這些特點表明著AMPs和抗生素在未來可以進(jìn)行相互結(jié)合，應(yīng)用于治療多種耐藥性的細(xì)菌病癥，從而降低藥物對人體產(chǎn)生的毒性。同時AMPs同樣也可在人體內(nèi)進(jìn)行作用，因為其可以發(fā)揮人體內(nèi)部免疫調(diào)節(jié)的作用，刺激血管的生成，促進(jìn)損傷的修復(fù)，代表著AMPs未來可以作為醫(yī)療產(chǎn)品從而更加方便且安全的調(diào)節(jié)人體內(nèi)部的免疫系統(tǒng)。因此，該領(lǐng)域的研究需要不斷增加，對AMPs的功能分子原理的深入了解將使研究人員能夠更好地設(shè)計該領(lǐng)域的項目，防止浪費(fèi)人力和財力并掌握成果。

6 結(jié)束語

深入了解AMPs的抗菌機(jī)制對于成功應(yīng)用具有重要意義。在AMPs的抗菌機(jī)制上了解與微生物對AMPs耐藥性機(jī)制，對其從宏觀到微觀方面充分的理解，可以使研究人員開發(fā)出更好的方法來探索和評估AMPs的潛力。了解AMPs對病原微生物的抗菌以及病原微生物對抗菌肽的耐藥機(jī)制，有助于研究開發(fā)出更加完備的AMPs。目前，對AMPs的合成研究較多，隨著對其機(jī)理的進(jìn)一步了解，對這些工程肽的優(yōu)化迫在眉睫。盡管大多數(shù)AMPs抗性機(jī)制尚未得到證實和/或充分闡明，但新的研究和技術(shù)可以對其探究。需要注意的是，現(xiàn)在許多AMPs分子之間起共同作用，并且還有一些其他互補(bǔ)因素會影響抗菌作用。對AMPs研究中，不同肽之間協(xié)同作用的出現(xiàn)是一個日益突出的話題，并且也顯示出巨大的研究潛力。最后需要強(qiáng)調(diào)的是有時候AMPs作用和抗性的分子機(jī)制卻被多次忽略，因此需要進(jìn)行基礎(chǔ)研究以闡明AMP的作用基礎(chǔ)機(jī)制，以避免資源浪費(fèi)和優(yōu)化適用結(jié)果。