于鎧銘，包曉棟，李備，洪喜，劉景鑫

1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.手外科；b.醫(yī)學影像工程中心；c.放射科，吉林 長春 130033；2.長春長光辰英生物科學儀器有限公司，吉林 長春 130033；3.中國科學院 長春光學精密機械與物理研究所，吉林 長春 130033

引言

近年來，將拉曼光譜分析用于生物醫(yī)學檢測成為新的研究熱點，特別是新冠疫情出現(xiàn)后，由于核酸檢測對硬件和人員要求較高，一般醫(yī)院難以完成。因此，建立便捷快速的創(chuàng)新檢測方法對疫情防控具有重要意義，采用拉曼光譜進行快速生物醫(yī)學檢測成為國內外科學家探索的新方向。

拉曼光譜分析法基于拉曼散射效應，具有快速、無損、非接觸的優(yōu)勢[1-3]，已在有機化學、高分子材料、材料科學等研究領域應用多年[4-5]。但是由于拉曼光譜數(shù)據(jù)采集處理分析時間太長，因此在醫(yī)學檢測領域發(fā)展緩慢。近年來，隨著光學技術和計算機技術的發(fā)展，大大縮短了拉曼光譜的采集處理時間，使它應用于生物醫(yī)學檢測領域成為可能[6-8]。使用拉曼光譜檢測時，生物樣品用量很少，且無須前置處理，大大降低了操作難度，保護了樣本原始性，因而可以采集到生物樣品最真實的信息[9-11]。另外，拉曼光譜對于研究生物大分子的結構與性能，單細胞的核酸、蛋白質、脂質含量信息[12]以及細胞分子結構實時變化的信息等都具有顯著優(yōu)勢[13-14]。

在使用拉曼光譜進行生物醫(yī)學檢測時，存在數(shù)據(jù)量大、數(shù)據(jù)維度高、光譜特征峰值多等問題。為此，需要通過計算機對數(shù)據(jù)進行降維和聚類分析處理，最終可以達到生物醫(yī)學檢測的效果[15-18]。

1 方法

由于生物檢測具有復雜的環(huán)境和多樣的生物，使用無監(jiān)督學習在復雜乙肝血清環(huán)境中進行檢測和分析，基于t分布隨機近鄰嵌入（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding，t-SNE）[19]非線性拉曼光譜數(shù)據(jù)壓縮，將高維拉曼光譜投影到低維平面，實現(xiàn)在低維空間的可視化聚類。

使用K最近鄰算法（K-Nearest Neighbor，KNN）[20]，廣泛適用于增量模型下的模式識別領域。它是一種在線學習技術，新學習樣本可以直接加入訓練好的訓練集，而不需要重新進行學習訓練從而提高了模型訓練速度，且分類準確度高，對異常值的噪聲有較高的容忍度，對復雜血清樣品鑒別有著天生的優(yōu)勢。

1.1 t-SNE聚類算法

SNE算法可以保持數(shù)據(jù)在進行降維處理前后各數(shù)據(jù)點間遠近關系的概率，從而可以保持降維前后的數(shù)據(jù)內部結構。SNE算法的基本思想：① 利用復雜度因子，選取近鄰樣本；② 用概率的形式將近鄰樣本間的歐氏距離轉化成樣本相似度；③ 利用相對熵目標函數(shù)算得降維后的數(shù)據(jù)表達。其中，xi和xj間的相似度由條件概率表達，即為xi選取xj作為近鄰的概率；其對應的嵌入子空間yi和yj間的相似度使用相似的表達。

應用中發(fā)現(xiàn)，原算法存在著低維度數(shù)據(jù)擁擠和價值方程優(yōu)化困難的問題，因而在原SNE算法基礎上又提出了基于t分布的t-SNE算法。t-SNE算法較原算法的優(yōu)點：① xi和xj間的相似度由聯(lián)合概率表達，聯(lián)合概率具有對稱性；② 嵌入子空間yi和yj間的相似度則用t分布表達。

設X={x1,x2,…,xn}，其中xi為d維向量，聯(lián)合概率pij表示數(shù)據(jù)xi和xj之間的相似度，即原空間中xi選取xj作為鄰近的概率，即式(1)：

其中，λ是高斯函數(shù)的方差，pij=0數(shù)據(jù)間相似度概率總和為1。

取n個r維向量Y={y1,y2,…,yn}（r遠小于d），作為X對應的子空間數(shù)據(jù)，利用t分布qij表示子空間yi和yj間的相似度，即子空間數(shù)據(jù)間的概率，即式(2)：

t-SNE通過最小化目標函數(shù)，即式(3)：

獲取最佳子空間的向量表達，即最小化原空間和子空間兩個概率分布的相對熵，其本質就是最大限度地匹配pij和qij，再利用梯度下降法計算式(3)最優(yōu)值。

求解時，最優(yōu)化過程中存在振蕩現(xiàn)象，為了改善這個問題，并加快最優(yōu)化過程，在式(3)上添加一個動量項，從而有了帶動量的梯度，見式(4)：

1.2 KNN分類算法

在N個訓練樣本中，找到測試樣本x的k個近鄰。設數(shù)據(jù)集中有m個訓練樣本，并有c個類別，即{ω1,…,ωc}，測試樣本為x。則KNN算法可描述為：在m個訓練樣本中找到x的k個鄰域，其中x的k個近鄰中屬于類別wi的樣本數(shù)戶分別為k1,k2,…,kn則判別函數(shù)見式(5)：

決策規(guī)則為式(6)：

則決策x∈ωj。

KNN的思想是給出一個樣本集合和一個合適的距離度量方式，對任意的一個測試樣本，找到離它最近的k個樣本，根據(jù)這k個樣本的類別統(tǒng)計信息決定此測試樣本的類別歸屬問題，即將待分樣本x歸類為與其k個近鄰中出現(xiàn)次數(shù)最多的類別。KNN算法的基本要素為：k值，距離度量方式和分類的決策規(guī)則。

KNN分類步驟：① 準備訓練樣本集X，其中包含n個訓練樣本，根據(jù)具體要求選擇一個合適的距離度量方式，用dis(xa,xb)表示樣本集中的xa、xb這兩點的距離；② 對于測試樣本x，利用距離度量公式計算測試樣本x與n個樣本的距離，得到距離集合Dis，其中Dis={dis(x,x1),dis(x,x1),…,dis(x,xn),}；③ 對距離集合進行排序，從中選擇最小的k個元素，從而得到k個元素對應的k個樣本；④ 對這k個樣本所屬類別進行統(tǒng)計，用投票的方式得到最終分類結果。

2 結果

為驗證本研究中提出的拉曼光譜數(shù)據(jù)處理方法，我們使用乙肝感染血清及正常人血清進行了實驗驗證。驗證實驗使用了2位乙肝患者血清和2位正常人血清。每個樣品取中心位置，各測試50組拉曼數(shù)據(jù)。樣品前置處理使用離心取全血的血清（其中每組各有一份樣品有輕微溶血現(xiàn)象，血清偏紅色，有血紅素干擾）；將血清用棉簽點樣于檢測芯片上，風干后待測。在對血清進行拉曼光譜檢測后，首先對數(shù)據(jù)進行預處理，進行宇宙射線、平滑、基線校正處理，再以最高峰為標準對所有光譜進行歸一化，生成光譜圖。

2.1 拉曼光譜測試結果

經檢測，分別得到2位正常人血清拉曼光譜測試區(qū)域及光譜圖（圖1和圖2）和2位乙肝患者血清（圖3和圖4）。

圖1 對照-1實驗拉曼光譜測試區(qū)域及光譜圖

圖2 對照-2實驗拉曼光譜測試區(qū)域及光譜圖

圖3 陽性-1實驗拉曼光譜測試區(qū)域及光譜圖

圖4 陽性-2實驗拉曼光譜測試區(qū)域及光譜圖

2.2 聚類算法分析結果

經過t-SNE算法處理后，直接可以得到聚類分析結果圖（圖5）。從圖5中可以看出，陽性組數(shù)據(jù)與對照組存在明顯差異，但對照組數(shù)據(jù)的類內聚合度較低，組內差異比較大。

圖5 聚類分析結果圖

2.3 分類算法分析結果

使用KNN分類算法，實驗數(shù)據(jù)進行分類分析，得到分類分析結果圖（圖6）。從圖6中可以看出，基于目前的數(shù)據(jù)，可以根據(jù)拉曼光譜對陽性組與對照組進行區(qū)分，驗證了拉曼光譜進行生物醫(yī)學檢測可行性及相關算法分析處理檢測數(shù)據(jù)的可行性。

圖6 分類分析結果

3 討論

我們利用機器學習的方法，對拉曼光譜進行生物醫(yī)學檢測的數(shù)據(jù)進行處理分析，從乙肝感染血清驗證實驗的結果來看：陽性組與對照組的拉曼光譜圖像存在差異，可以進行區(qū)分；從驗證實驗的數(shù)據(jù)分析來看：對每個樣品的數(shù)據(jù)進行分析，陽性組的2個樣品數(shù)據(jù)的類內聚合度較高，而對照組的2組數(shù)據(jù)差異較大。由此可見，生物的拉曼光譜圖像數(shù)據(jù)是可以表征生物特性的，t-SNE聚類算法、KNN分類算法等機器學習算法在對生物醫(yī)學拉曼光譜數(shù)據(jù)處理方面也是可行的，特別在同類組別的區(qū)分上顯示出了算法的有效性。

然而，同組內個體間的差異也較為明顯，數(shù)據(jù)結果受樣本自身反應變化影響較多，對于此問題，后續(xù)工作將從兩個方面展開：① 優(yōu)化樣本的采集、制作和保存，保證樣本的完整性和統(tǒng)一性；② 項目正式開展后采集更多的樣本數(shù)據(jù)，探究個體差異原因，并根據(jù)差異的特點開發(fā)相應算法，提高檢測準確率。

目前，我們對于拉曼光譜用于生物醫(yī)學檢測的數(shù)據(jù)處理分析方法研究取得了初步的結果。同時，我們也在嘗試把深度學習方法應用到拉曼光譜檢測數(shù)據(jù)的處理中，以求可以更加準確高效地完成生物醫(yī)療檢測，獲得更高的檢測結果。后續(xù)我們還需要從算法優(yōu)化、樣品制備、檢測流程標準化等角度加以優(yōu)化和完善，通過大量細菌、病毒微生物檢測實驗分析以提升拉曼光譜在生物醫(yī)學檢測領域的檢測范圍與檢測精度。

將拉曼光譜分析應用到生物醫(yī)學檢測中，可以形成檢測細胞、細菌甚至病毒微生物的一種新型快速便捷的檢測技術，拉曼光譜也將有希望成為快速檢測新型冠狀病毒的新方法。