蔣 帥，畢家豪，范宇光，曾念開▲

(1海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199；2海南熱帶雨林國(guó)家公園管理局鸚哥嶺分局，海南 白沙 572800)

韋伯靈芝Ganodermaweberianum(Bres.& Henn.ex Sacc.) Steyaert在分類上隸屬于多孔菌目Polyporales、靈芝科Ganodermataceae[1]。該菌最早描述于薩摩亞[2]，之后在中國(guó)臺(tái)灣、云南西雙版納等地有分布的報(bào)道[3-5]；2018年，作者在海南省萬寧市也發(fā)現(xiàn)了韋伯靈芝的分布。該菌在海南民間作為“靈芝”使用，以泡酒、煮水等方式入藥，認(rèn)為其對(duì)身體有保健作用[6，7]。現(xiàn)代研究表明，韋伯靈芝栽培的子實(shí)體含有g(shù)anoweberianones A和B、ganoweberianic acids A-G、ganohainanic acid A、Ganodermanontriol及其Ganodermanontriol異構(gòu)體等化合物，其中g(shù)anoweberianones A具有良好的抗瘧活性[8]；同時(shí)該菌的液體發(fā)酵產(chǎn)物還具有抗黑色素生成的作用[9]。因此韋伯靈芝是一種極具研究?jī)r(jià)值的藥用真菌。近年來由于對(duì)包括韋伯靈芝在內(nèi)的靈芝屬真菌的過度采挖，使其野生資源逐年減少[10]。因此加強(qiáng)對(duì)韋伯靈芝的研究，對(duì)該菌的可持續(xù)利用具有重要意義。為此，本研究從韋伯靈芝生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)的環(huán)境因素對(duì)該菌菌絲的培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，以期為該菌的人工馴化栽培提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

韋伯靈芝G.weberianum菌株分離自海南省萬寧市興隆鎮(zhèn)。分離菌株的子實(shí)體保存于海南醫(yī)學(xué)院真菌標(biāo)本館(FHMU)。

1.2 供試培養(yǎng)基

1.2.1 PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基(不含氯霉素)。

1.2.2 碳源實(shí)驗(yàn)所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CK1)

MgSO40.05%、KH2PO40.1%、瓊脂粉2%、蛋白胨0.2%。

1.2.3 氮源實(shí)驗(yàn)所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CK2)

MgSO40.05%、KH2PO40.1%、瓊脂粉2%、葡萄糖2%。

1.3 菌種活化

將供試的韋伯靈芝菌種移至PDA培養(yǎng)基平板中心，控制培養(yǎng)條件，待菌落直徑長(zhǎng)至6～8 cm時(shí)，用無菌打孔器在離平板中心等距離處(同菌齡菌絲體)打孔，獲得活化菌種塊，供接種用。

1.4 接種培養(yǎng)與觀測(cè)方法

滅過菌的培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中趁熱定量倒入滅過菌的9 cm培養(yǎng)皿中制成平板，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，每平板中心接入1塊直徑約0.5 cm的活化菌種塊，每一處理4次重復(fù)；置于培養(yǎng)箱黑暗條件下培養(yǎng)；每隔2 d測(cè)量菌落半徑，觀察菌落的變化及其生長(zhǎng)勢(shì)。

1.5 處理方法

1.5.1 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

分別用2%葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、木糖、糊精、可溶性淀粉加入碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基CK1中，接種韋伯靈芝菌種，于26 ℃下培養(yǎng)6 d。

1.5.2 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

分別用0.2%蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨加入氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基CK2中，接種韋伯靈芝菌種，于26 ℃下培養(yǎng)5 d。

1.5.3 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用PDA培養(yǎng)基，分別在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃下，接種韋伯靈芝菌種，培養(yǎng)4 d。

1.5.4 起始pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用PDA培養(yǎng)基，分別用2 mol/L氫氧化鈉溶液和2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的起始pH值為 4、5、6、7、8，接種韋伯靈芝菌種，于26 ℃下培養(yǎng)5 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)韋伯靈芝菌絲生長(zhǎng)的影響

在供試的7種碳源中，韋伯靈芝菌絲接種后的第2天均能萌發(fā)，但不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不同。從生長(zhǎng)勢(shì)來看，糊精為碳源的菌落生長(zhǎng)最為密集，其后是可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和木糖(圖1和表1)；從菌落半徑來看，培養(yǎng)6 d的菌落半徑從大到小依次為：糊精>果糖>可溶性淀粉>麥芽糖>葡萄糖>蔗糖>木糖(表1)。統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示，以糊精為碳源時(shí)，培養(yǎng)6 d的菌落半徑和其他碳源進(jìn)行培養(yǎng)所得的菌落半徑相比具有顯著性差異(表1)。因此，以糊精為碳源，不僅菌絲生長(zhǎng)最為快速，而且菌絲生長(zhǎng)濃密。所以判斷韋伯靈芝的最適碳源為糊精。

a-葡萄糖；b-麥芽糖；c-果糖；d-蔗糖；e-木糖；f-糊精；g-可溶性淀粉。圖1 不同碳源下培養(yǎng)6 d的韋伯靈芝菌落Fig.1 The colony of G.weberianum after 6 d culturewith different carbon sources

表1 不同碳源下培養(yǎng)6 d的韋伯靈芝菌落半徑及生長(zhǎng)勢(shì)Tab.1 The colony radius s.d.，n=6) andmycelial growth of G.weberianum after 6 d culture withdifferent carbon sources

續(xù)表1

2.2 氮源對(duì)韋伯靈芝菌絲生長(zhǎng)的影響

在供試的4種氮源中，在接種后1 d均能萌發(fā)，但各個(gè)氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不同。從生長(zhǎng)勢(shì)來看，以酵母粉為氮源的菌落生長(zhǎng)最為密集，其后依次是蛋白胨、牛肉膏和硫酸銨(圖2和表2)；從菌落半徑來看，培養(yǎng)5 d的菌落半徑從大到小依次為：酵母粉>牛肉膏>蛋白胨>硫酸銨(表2)。統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示，以酵母粉為氮源時(shí)，培養(yǎng)5 d的菌落半徑和其他氮源進(jìn)行培養(yǎng)所得的菌落半徑相比具有顯著性差異(表2)。由此可以判斷韋伯靈芝的最適氮源是酵母粉(表2)。

a-蛋白胨；b-酵母粉；c-硫酸銨；d-牛肉膏。圖2 不同氮源下培養(yǎng)5 d的韋伯靈芝菌落Fig.2 The colony of G.weberianum after 5 d culture withdifferent nitrogen sources

表2 不同氮源下培養(yǎng)5 d的韋伯靈芝菌落半徑及生長(zhǎng)勢(shì)

2.3 溫度對(duì)韋伯靈芝菌絲生長(zhǎng)的影響

在供試的6種溫度下，接種后1 d菌絲都能萌發(fā)，說明韋伯靈芝在24～34 ℃都能生長(zhǎng)，但不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響不同。從生長(zhǎng)勢(shì)來看，30 ℃菌絲生長(zhǎng)最為密集，其后依次是32 ℃、28 ℃、26 ℃(圖3和表3)；從菌落半徑來看，培養(yǎng)4 d的菌落半徑從大到小依次為：28 ℃>30 ℃>26 ℃>32 ℃>24 ℃>34 ℃(表3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)溫度為28 ℃與32 ℃時(shí)，對(duì)培養(yǎng)4 d的韋伯靈芝菌落半徑影響差異不顯著，但二者與其他溫度處理下的菌落半徑有顯著性差異(表3)。由此可判斷韋伯靈芝的適宜生長(zhǎng)溫度為28～32 ℃。

a-24℃；b-26 ℃；c-28 ℃；d-30℃；e-32℃；f-34℃。圖3 不同溫度下培養(yǎng)4 d的韋伯靈芝菌落Fig.3 The colony of G.weberianum after 4 d culture atdifferent temperatures

表3 不同溫度下培養(yǎng)4 d的韋伯靈芝菌落半徑及生長(zhǎng)勢(shì)

2.4 起始pH值對(duì)韋伯靈芝菌絲生長(zhǎng)的影響

在供試的5種不同起始pH值下，接種后兩天所有菌絲都能萌發(fā)。從菌絲生長(zhǎng)勢(shì)來看，在起始pH6時(shí)，菌絲最為密集，其后依次是pH7、pH5、pH8、pH4(圖4和表4)。從菌落半徑來看，培養(yǎng)5 d的菌落半徑從大到小依次為：pH6>pH5>pH7>pH8>pH4(表4)。統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示，起始pH6下的菌落半徑與其他pH值下菌落半徑具有顯著性差異，且pH6下菌絲生長(zhǎng)密集(圖4)。由此可判斷韋伯靈芝菌絲生長(zhǎng)的最適起始pH值是6。

表4 不同起始pH值下培養(yǎng)5 d的韋伯靈芝菌落半徑及生長(zhǎng)勢(shì)mycelial growth of G.weberianum after 5 d culture withdifferent initial pH values

a-pH=4；b-pH=5；c-pH=6；d-pH=7；e-pH=8。圖4 不同起始pH值下培養(yǎng)5 d的韋伯靈芝菌落Fig.4 The colony of G.weberianum after 5 d culture withdifferent initial pH values

3 討論

碳源比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，韋伯靈芝菌絲能廣泛利用各種碳源，但最適的碳源是糊精。這與靈芝屬其他種類有所不同，如有柄樹舌G.gibbosum(Blume & T.Nees) Pat.的最適碳源是蔗糖[11]，赤芝G.lingzhiSheng H.Wu，Y.Cao & Y.C.Dai的最適碳源為蔗糖，樹舌靈芝G.applanatum(Pers.) Pat.的最適碳源為葡萄糖，紫芝G.sinenseJ.D.Zhao，L.W.Hsu & X.Q.Zhang的最適碳源為麥芽糖[12]。氮源比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，韋伯靈芝菌絲能利用有機(jī)氮如蛋白胨、酵母粉和牛肉膏，同時(shí)也能利用無機(jī)氮如硫酸銨，但最適的氮源為酵母粉。靈芝屬的其他種類如有柄樹舌、赤芝、樹舌靈芝、紫芝的最適合氮源也是酵母膏[11，12]。溫度比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，韋伯靈芝在24～34 ℃能生長(zhǎng)，但在28 ℃下的菌絲生長(zhǎng)最快，說明該菌是一種高溫型真菌[13]；靈芝屬的其他種類如有柄樹舌菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25 ℃[11]，樹舌靈芝的適合溫度為25～30 ℃，赤芝和紫芝的最適合溫度均為25 ℃[12]。起始pH值比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，韋伯靈芝菌絲的最適起始pH值是6，其他靈芝屬的種類如有柄樹舌菌絲生長(zhǎng)的最適起始pH值為5.5[11]。

在中國(guó)，赤芝、紫芝、白肉靈芝G.leucocontextumT.H.Li，W.Q.Deng，Sheng H.Wu，Dong M.Wang & H.P.Hu、松杉靈芝G.tsugaeMurrill等靈芝屬真菌已經(jīng)有較大規(guī)模的人工栽培[14-16]，為中國(guó)的大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)揮著重要的作用。韋伯靈芝具有良好的藥理活性，且是典型的熱帶物種，因此對(duì)其培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，不僅為該靈芝的人工馴化栽培、菌絲體液體發(fā)酵等提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且為中國(guó)熱帶靈芝屬真菌的保護(hù)提供了參考。