王輝

摘 要：從海南省三亞市崖州區(qū)養(yǎng)殖的羅非魚(yú)中分離得到一株優(yōu)勢(shì)病原菌，命名為HH-0708.經(jīng)由16S rDNA序列測(cè)定、菌落形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)，HH-0708被鑒定為無(wú)乳鏈球菌。HH-0708體外藥敏結(jié)果顯示：其對(duì)青霉素、頭孢呋辛、多西環(huán)素等11種抗生素高度敏感，而對(duì)四環(huán)素、慶大霉素等9種抗生素表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，對(duì)鏈霉素、紅霉素等其他5種抗生素，表現(xiàn)為中度敏感。

關(guān)鍵詞：羅非魚(yú);無(wú)乳鏈球菌;16S rDNA;藥敏試驗(yàn);生化實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S943

自1976年起，于水生生物海豚中首次分離到鏈球菌后，鏈球菌類的細(xì)菌性疾病便在羅非魚(yú)、寶石鱸等水生生物養(yǎng)殖中多次爆發(fā)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。因羅非魚(yú)具有良好的繁殖能力，肉質(zhì)鮮美，無(wú)肌間刺，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，所以成為我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[4-5]。但是由于養(yǎng)殖密度的增高，抗生素濫用等問(wèn)題，鏈球菌等細(xì)菌性疾病頻發(fā)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為更好進(jìn)行疾病防控，需從病魚(yú)中分離病原菌，了解其生理生化特性后，再深入進(jìn)行病原菌耐藥性[6-8]、毒力因子[9]、疫苗方面[10]的研究，方便對(duì)同類疾病進(jìn)行快速、精確防控。

海南省三亞市網(wǎng)箱養(yǎng)殖羅非魚(yú)爆發(fā)細(xì)菌性疾病，從中分離得到一株病原菌，通過(guò)序列比對(duì)和生理生化分子鑒定，確定為羅非魚(yú)源的無(wú)乳鏈球菌，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)利用紙片擴(kuò)散法，對(duì)藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)，為避免羅非魚(yú)源細(xì)菌性病害的大規(guī)模爆發(fā)，以及養(yǎng)殖的進(jìn)一步發(fā)展提供生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2020年7月份，海南省三亞市崖州區(qū)牛落水庫(kù)網(wǎng)箱中羅非魚(yú)出現(xiàn)大量死亡的情況，發(fā)病羅非魚(yú)的體長(zhǎng)為12～15 cm，體質(zhì)量為100～200 g。觀察并記錄魚(yú)體的運(yùn)動(dòng)狀況及病理特征，從羅非魚(yú)養(yǎng)殖網(wǎng)箱內(nèi)撈出10尾瀕死的羅非魚(yú)，塑料袋充氧后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行后續(xù)病原分離、病原鑒定實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用材料見(jiàn)表1。

1.2 病原菌的分離、純化

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用75%乙醇擦拭瀕死的羅非魚(yú)體表，之后進(jìn)行羅非魚(yú)各組織、器官的病原分離，具體包括：肝臟、腦、脾臟、血液、腎臟等，組織樣在腦心津液固體培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)環(huán)境：30 ℃恒溫培養(yǎng)箱;培養(yǎng)時(shí)間：24 h。對(duì)平板上的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行三區(qū)劃線，純化菌株。對(duì)純化后長(zhǎng)出的單一菌落進(jìn)行保種，具體操作：制備好無(wú)菌腦心津液培養(yǎng)基，將單菌落轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)環(huán)境：30 ℃振蕩培養(yǎng)箱;轉(zhuǎn)速設(shè)定：180 r/min;培養(yǎng)時(shí)間：16～20 h，后將培養(yǎng)好的菌液與50%的無(wú)菌甘油混合，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 病原菌形態(tài)觀察 將病原菌劃線、純化的腦心津液培養(yǎng)皿倒置，培養(yǎng)環(huán)境：30 ℃恒溫培養(yǎng)箱;培養(yǎng)時(shí)間：20 h，觀察并記錄菌落形態(tài)。

1.3.2 分子鑒定

1.3.2.1 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 提取菌液DNA后，利用細(xì)菌16S的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，序列預(yù)期長(zhǎng)度為 1 500 bp。取6 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小，部分?jǐn)U增產(chǎn)物寄送基因技術(shù)有限公司，獲取菌株16S核酸序列。

16S通用引物序列為：

27 F ：（ 5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3）

1 492 R ：（ 5- GGTTACCTTGTTACGACTT - 3）

1.3.2.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 登入NCBI官網(wǎng)，將測(cè)序結(jié)果上傳至Microbes，進(jìn)行Blastn同源性分析，記錄查詢結(jié)果，并下載鏈球菌屬核酸序列。利用Mega7.0軟件，生成HH-0708的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，設(shè)定構(gòu)建法則：鄰接法;Bootstrap值：1 000;距離檢測(cè)方法：clustal V。

1.3.3 生理生化鑒定 利用生化鑒定管的反應(yīng)情況，根據(jù)不同功能產(chǎn)生的生理生化反應(yīng)對(duì)菌株種屬進(jìn)行鑒定，觀察其與各種酶類發(fā)生氧化發(fā)酵的能力，水解七葉苷和明膠的能力，利用各種糖類產(chǎn)酸的能力，以及不同鹽度下的生長(zhǎng)能力的變化。對(duì)照菌株：無(wú)乳鏈球菌（NCTC8181）。

1.4 藥敏試驗(yàn)

本次藥敏試驗(yàn)原理為紙片擴(kuò)散法。具體操作：將上述培養(yǎng)好的菌液，吸取100 μL，均勻涂布于LB平板，后取藥敏紙片貼于該涂布平板表面。藥敏平板培養(yǎng)溫度：30 ℃;倒置培養(yǎng);培養(yǎng)時(shí)間：24 h。利用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑，并判斷菌株對(duì)各抗生素的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)腦、肝臟、脾臟等取樣部位進(jìn)行病原菌的分離，長(zhǎng)出的菌落形態(tài)基本一致，認(rèn)定為優(yōu)勢(shì)病原菌落。挑取長(zhǎng)出的單菌落，于無(wú)菌的腦心津液培養(yǎng)基進(jìn)行劃線純化，長(zhǎng)出的菌落形態(tài)一致，均表面光滑、邊緣整齊，呈乳白色。2.2 病原菌的分類鑒定

2.2.1 病原菌系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用細(xì)菌16S通用引物即27 F和1492 R構(gòu)建PCR體系，通過(guò)2720型PCR儀對(duì)HH-0708菌株DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增處理，通過(guò)瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示條帶長(zhǎng)度為1.5 kbp，將測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blastn同源性分析，菌株 HH-0708與結(jié)果中各類無(wú)乳鏈球菌相似性均達(dá)99.67%。下載16S 核酸序列，運(yùn)用MEGA 7.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。由圖1可見(jiàn)，該病原菌株HH-0708與菌株NCTC8187聚為一支。

2.2.2 生理生化特性 為描述HH-0708的生理生化特性，利用生化鑒定管分析該病原菌利用各類物質(zhì)的能力（如表2），結(jié)果顯示，菌株 HH-0708和標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC8181均在MR反應(yīng)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶反應(yīng)、丙氨酸生化反應(yīng)中表現(xiàn)出陽(yáng)性;HH-0708可以利用麥芽糖、甘露糖、蔗糖、蕈糖、果糖、半乳糖、甘露糖、水楊素發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，分解糖類產(chǎn)酸供能。無(wú)法水解七葉苷和明膠進(jìn)行水解反應(yīng);在各梯度鹽度下無(wú)法完成正常的生長(zhǎng);無(wú)法利用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、纖維二糖、木糖、乳糖等低聚糖和甘油、肌醇進(jìn)行產(chǎn)酸反應(yīng)。HH-0708與NCTC8181在利用各類糖類的能力上略有不同。

2.3 藥敏試驗(yàn)

對(duì)致病菌HH-0708進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，在25種藥敏紙片呈現(xiàn)出不同的敏感表現(xiàn)（如表3）。該病原菌對(duì)多西環(huán)素、頭孢他啶、呋喃妥因、左氧氟沙星、大觀霉素、阿莫西林、頭孢呋辛、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、青霉素共11種抗生素敏感，即對(duì)測(cè)定的頭孢類和部分喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為高度敏感;對(duì)多黏菌素B、紅霉素、諾氟沙星、依諾沙星、鏈霉素5種抗生素呈現(xiàn)中度敏感，對(duì)喹諾酮類部分抗生素表現(xiàn)為藥物中度敏感;而對(duì)呋喃唑酮、氨芐西林、新霉素、四環(huán)素、慶大霉素等9種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，主要對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素顯示強(qiáng)耐藥性。

3 討論

3.1 病原分離與鑒定

2020年7月針對(duì)海南養(yǎng)殖網(wǎng)箱患病羅非魚(yú)進(jìn)行研究，從發(fā)病羅非魚(yú)的腦、肝臟、脾臟等部位分離病原菌，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)出的菌落顏色、形態(tài)一致，所以從中挑取一株菌進(jìn)行后續(xù)病原鑒定實(shí)驗(yàn)。通過(guò)菌落形態(tài)記錄，利用BLAST比對(duì)其16S rDNA序列，發(fā)現(xiàn)與NCTC8187標(biāo)準(zhǔn)菌株表現(xiàn)出高度的同源性，并完成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

3.2 藥敏試驗(yàn)及防治措施

將本次藥敏結(jié)果與不同地區(qū)下分離得到的無(wú)乳鏈球菌藥物分析結(jié)果進(jìn)行比較[11-14]，除青霉素外，HH-0708對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氟苯尼考等藥物表現(xiàn)出高度敏感性，但對(duì)紅霉素表現(xiàn)為中度敏感，造成這種差異的原因：一是不同地區(qū)菌株遺傳背景具有差異性，導(dǎo)致部分藥物敏感性不一致[15-16];二是長(zhǎng)期使用、濫用單一抗生素，使細(xì)菌的毒力因子、耐藥因子的表達(dá)發(fā)生變化，病原菌本身耐藥和獲得性耐藥能力不斷提升，造成紅霉素等抗生素藥物敏感性下降，抗生素防治疾病效果下降[17-20];除此之外，還有其他環(huán)境條件等其他因素，導(dǎo)致致病菌株的藥物敏感性不斷變化，出現(xiàn)抗生素“失效”或“低效”的現(xiàn)象。

目前，禁用的漁用抗生素種類不斷增加[21]，一方面有效避免了抗生素的濫用，而另一方面抗生素的使用受限增加了防控細(xì)菌性疾病的難度，所以應(yīng)當(dāng)積極尋找快速、有效的抗生素替代途徑來(lái)治療水生生物的細(xì)菌性疾病，如研制疫苗[22]，開(kāi)發(fā)抗菌肽[23]，進(jìn)行中草藥防治[24-25]等，控制無(wú)乳鏈球菌在羅非魚(yú)中的進(jìn)一步傳播。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)病原菌的形態(tài)特征、生化特性、序列分析等結(jié)果分析，將該菌株鑒定為無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）。目前，抗生素仍是一種主要的疾病防控手段。為了防止抗生素的濫用，可以利用紙片擴(kuò)散法有效篩選目標(biāo)抗生素，迅速、謹(jǐn)慎確定給藥方案，從而高效防控鏈球菌疾病的發(fā)展。

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Abstract：A pathogen named HH-0708 was isolated from tilapia cultured in Yazhou District， Sanya City， Hainan Province. The HH-0708 strain was identified as Streptococcus agalactiae by a series of tests which included morphological observation， 16S rDNA sequencing， physiological and biochemical identification. The antibiotic sensitivity analysis indicated that HH-0708 was extremely susceptible to 11 kinds of drugs including penicillin， ceftriaxone， doxycycline， etc， and medium sensitive to streptomycin， erythromycin and other three drugs. While HH-0708 was resistant to nine drugs， such as tetracycline， gentamicin，etc.

Key words：tilapia;Streptococcus agalactiae;16S rDNA; drug sensitivity test; biochemical test

（收稿日期：2021-06-18）