馬瑞欣

摘 要：通過查閱文獻和實驗，分析總結色譜-質譜分析中內標物的要求與作用，內標法檢測技術使用注意事項、優(yōu)勢與不足。

關鍵詞：內標法;同位素內標;色譜-質譜分析

內標法定量是利用待測物濃度和內標物濃度的比值與待測物響應值和內標物響應值的比值成正比進行定量分析的方法，是經典的色譜-質譜定量分析方法，廣泛應用于食品安全、醫(yī)學、環(huán)境等領域。

本文將對色譜-質譜分析中內標物的要求和常用類型、內標物的作用、內標法使用注意事項、內標法的優(yōu)缺點進行分析總結。

1 內標物的要求及其常用類型

內標物要求其在樣品中不存在，不與樣品發(fā)生反應，與目標物的物理化學性質相似。根據(jù)儀器定性定量原理，色譜分析中要求內標物與樣品中的其他組分有良好的分離，質譜分析中一般要求與目標物的母離子或子離子的質荷比（m/z）不同。有機質譜分析中常用2H、13C、15N、18O、34S等穩(wěn)定同位素內標[1]，農藥、獸藥殘留色譜-質譜分析中最為常見的內標物是2H和13C同位素內標。

2 內標物的作用

2.1 監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性

只用于監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性時，一般在樣品前處理的最后一步加入等量的內標[2-3]，適用于樣品的提取比較充分，基質干擾可以忽略的檢測，內標法所得校準曲線的線性相關系數(shù)和定量結果與外標法相比無顯著差異，內標法、外標法定量均可，但是通過每次進樣時內標物響應值的變化，能夠對儀器的穩(wěn)定性進行判斷，必要時對設備進行維護保養(yǎng)。

2.2 校正基質效應

基質效應是質譜分析普遍存在的一種現(xiàn)象，分為基質抑制效應和基質增強效應。內標物只用于校正基質效應時一般上機分析時在線加入[4]或上機分析前[5]加入。此種情況樣品的提取比較充分，但樣品的基質干擾比較大，基質標準曲線適用性比較差。由于內標價格昂貴，相比于樣品提取前加入同位素內標，在線或上機分析時添加適量低濃度的內標，可以大大減少內標的使用量，節(jié)約檢測成本。同位素內標因與目標物具有相同的化學性質和相同的保留時間而成為消除基質效應首選的內標物。

2.3 校正樣品前處理

內標物在樣品提取前[6-7]或某個步驟前加入[8-9]，用于校正樣品的前處理損失，同時也可以減小基質效應。樣品提取前加入內標比在某個步驟前加入能夠獲得更好的回收率[10]。樣品提取前加入內標，特別是同位素內標，能夠校正前處理過程的損失，降低操作要求，減小基質效應，成為獸藥殘留色譜-質譜分析中非常經典的方法。

3 內標法使用注意事項

3.1 內標加入量

內標法要求內標的加入體積要準確并且濃度適當。內標加入量是影響檢測結果的一個比較重要的因素[11-12]，在標準曲線定量時要求標準曲線、樣品中內標加入量應保持恒定。內標的加入量太低不足以校正儀器波動，對測定結果影響較大;太高不僅造成浪費，還可能造成污染。當前處理過程涉及到分體積操作且用標準曲線定量時，需注意樣品上機液中內標物的理論濃度需與標準系列中內標物的濃度相一致，否則可能產生錯誤的結果。

3.2 內標加入后樣品放置時間

在前處理操作之前加入內標用于校正樣品的前處理損失時，應注意保證內標物被樣品充分吸附，否則會造成檢測結果偏低。為證明加入內標后樣品放置時間對檢測結果的影響，設計實驗如下：稱取14個鯉魚空白樣品，每個樣品5.00 g，同時加入孔雀石綠（MG）和隱色孔雀石綠（LMG）外標混合標準溶液，加標量均為4.0 μg·kg-1，混勻，-20 ℃放置4 d后，按照GB/T 19857-2005中鮮活水產品進行實驗。14個樣品分為7組，每組2個平行樣品，加入內標混合液的體積完全相同，放置時間分別為5 h、4 h、3 h、2 h、1 h、0.5 h、0 h。液相色譜-串聯(lián)質譜分析的實驗結果見圖1。

實驗結果證明：孔雀石綠內標加入后的放置時間對檢測結果影響較大，而隱色孔雀石綠則不受放置時間的影響。這可能與內標物的性質有關?？兹甘G內標物為孔雀石綠-D5苦味酸鹽，隱色孔雀石綠內標物為隱色孔雀石綠-D6，隱色孔雀石綠-D6極性較孔雀石綠-D5苦味酸鹽弱，脂溶性強，極易被魚肉吸附，其提取效率與放置時間無關;孔雀石綠-D5苦味酸鹽極性較強，放置時間越短，吸附量越小，提取出來的越多，導致目標物回收率降低。

4 內標法的優(yōu)勢與不足

4.1 優(yōu)勢

從定性分析來看，同位素內標物峰可以作為目標峰是否發(fā)生漂移的參考依據(jù)，因為同位素內標與分析物的物理化學性質相近，在色譜-質譜分析中常常與目標物有相同的保留時間，可以通過內標物的保留時間是否發(fā)生漂移來確定目標物是否發(fā)生漂移。

從定量分析來看，內標可以校正目標物在樣品前處理中的損失，降低對儀器穩(wěn)定性和進樣量的嚴格要求，降低質譜檢測的基質效應，從而得到更好的準確度和精密度。

從實驗操作來看，提取前加入內標物的前處理方法對實驗操作的要求比外標法有所降低，對體積的準確性要求沒有外標法嚴格。當目標物有對應的同位素內標時，可以直接使用溶劑標準溶液，不必配制基質標準溶液，從而可以減少實驗操作，提高檢測效率。

4.2 不足

同位素內標物價格較貴，在分析中并不是所有目標物都能找到合適的內標物，特別是對于多種物質同時檢測時，由于存在極性差異，即使同類物質的內標同位素也很難抵消基質效應，仍需配制基質匹配標準溶液來進一步抵消基質效應[13-14]。

在定量分析中，我們期望不管在樣品處理和分析過程中有任何變化，分析物和同位素內標物的峰面積比為常數(shù)，但實驗中發(fā)現(xiàn)并非如此[15]。實驗中使用同位素內標有時不能補償基質效應[16]，有時即使有對應的同位素內標仍不能獲得滿意的回收率。分析原因可能是同位素內標與目標物存在極性上的差異，會導致在樣品提取時二者的提取效率有差異或者是色譜—質譜分析中二者到達離子源的時間不同，從而引起基質效應不同。

內標法做為水產品藥物殘留色譜—質譜分析的常用方法，樣品的個體差異需引起重視。有時同種水產品同批次進行檢測，不同個體之間回收率會存在較大差異。分析原因可能是不同的個體對于待測物和其對應內標的回收率造成的影響不同所致。

5 結論

內標法作為一種定量分析方法，雖然存在不足，但在色譜—質譜分析中，同位素內標法仍不失為一種降低基質效應，提高準確定性定量分析的重要方法。

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（收稿日期：2021-07-01）