張 蒙，劉 敏，李夢倩，李 萍，周 蓉，蔣芳玲，吳 震

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，南京 210095)

大蒜(AlliumsativumL.)為藥食兼用的一、二年生草本植物，是中國在國際市場上有較強競爭力的出口蔬菜之一，具有重要的經(jīng)濟和藥用價值[1]。由于育性退化，大蒜主要靠鱗莖進行無性繁殖，導(dǎo)致病毒積累和種性退化嚴重，影響了其遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新[2-3]。利用常規(guī)組織培養(yǎng)技術(shù)進行脫毒快繁，有助于恢復(fù)大蒜種性，但仍存在繁殖系數(shù)低、玻璃化嚴重、變異率高、生根困難、試管苗質(zhì)量差和老化嚴重等問題[4]。

體細胞胚發(fā)生是植物界的普遍現(xiàn)象，是植物細胞全能性的重要體現(xiàn)，為植物離體快繁開創(chuàng)了新的途徑[5-6]。體細胞胚發(fā)生途徑具有發(fā)生速度快、繁殖系數(shù)高、遺傳穩(wěn)定性強和再生個體整齊性好等優(yōu)點[7-8]。雖然大蒜體細胞胚發(fā)生早有報道，但主要集中在培養(yǎng)條件的優(yōu)化、形態(tài)解剖特征觀察及生理生化分析等方面[9-11]。激素是影響大蒜體細胞胚發(fā)生的重要調(diào)控物質(zhì)，但體細胞胚發(fā)生不同階段不同種類激素的變化特征還缺少系統(tǒng)研究，相關(guān)分子調(diào)控特點尚未見報道，阻礙了大蒜體細胞胚發(fā)生體系的完善，影響了該體系優(yōu)勢的發(fā)揮和規(guī)模化生產(chǎn)。因此，明確大蒜體細胞胚發(fā)生過程中的內(nèi)源激素變化及相關(guān)基因表達特征，不僅有助于進一步明確大蒜體細胞胚發(fā)生的機理，更為大蒜種質(zhì)資源創(chuàng)新、基因遺傳轉(zhuǎn)化和人工種子的制備奠定基礎(chǔ)，還可為解決大蒜種性退化和新品種選育開辟途徑。

植物體細胞胚發(fā)生受多種因素影響，是植物體內(nèi)外不同因素綜合作用的結(jié)果，其中植物生長調(diào)節(jié)劑(PGRs)起決定性作用[12-13]。研究表明，外源PGRs在植物體細胞胚發(fā)生過程中的不同階段均有十分重要的調(diào)控作用[14-15]，且外源PGRs必須通過內(nèi)源激素才能發(fā)揮作用[16]，而內(nèi)源生長素、細胞分裂素(CTK)和脫落酸(ABA)水平的時空變化是調(diào)控體細胞胚發(fā)生的重要信號之一[17]。目前，關(guān)于玉米[18]、茶樹[19]、櫟樹[20]、橡膠[21]等經(jīng)濟植物和姜黃[22]、半夏[23]、北五味子[24]、枇杷[25]等藥用植物體細胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源激素的研究已有報道。相關(guān)研究結(jié)果因物種而異，高水平的內(nèi)源IAA能夠促進荔枝和龍眼胚性愈傷組織和球形胚的形成，但過高的內(nèi)源IAA會抑制北五味子體細胞胚的形成[26-27]。也有研究表明，低水平的內(nèi)源ABA有助于姜黃胚性愈傷組織的形成，而石刁柏中內(nèi)源ABA水平在胚性愈傷組織階段達到最高值[28]。關(guān)于內(nèi)源激素對大蒜體細胞胚發(fā)生調(diào)控的研究尚無報道，目前多是參考前人和其他植物的研究結(jié)果來利用外源PGRs調(diào)控大蒜體細胞胚的發(fā)生。

體細胞胚發(fā)生是由激素代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的高度復(fù)雜的分子系統(tǒng)，特別是生長素、CTK和ABA及其激素依賴性基因的表達。為了揭示植物體細胞胚發(fā)生的機理，人們開始研究體細胞胚發(fā)生過程中關(guān)鍵基因和激素信號通路相關(guān)基因的作用。關(guān)于植物體細胞胚發(fā)生分子調(diào)控的研究主要集中在擬南芥[29]和煙草[30]等模式植物中，部分報道涉及大豆[31]、落葉松[32]、棉花[33]、百合[34]、龍眼[35]等，關(guān)于大蒜體細胞胚發(fā)生過程中的分子調(diào)控特點還未見報道。

本研究以大蒜品種‘二水早’為材料，選擇體細胞胚發(fā)生過程中的外植體(花序軸，EX)、愈傷組織(CA)、早期胚性愈傷組織(PC)、后期胚性愈傷組織(LC)與球形胚(GE)5個階段，分析不同階段培養(yǎng)物的5種生長素及其類似物、4種CTK和ABA含量，以及不同階段激素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因相對表達量的變化特征，以期從內(nèi)源激素變化的角度解析大蒜體細胞胚的發(fā)生機制，為建立大蒜體細胞胚高效發(fā)生體系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試植物材料為大蒜品種‘二水早’，以花序軸為外植體。將花序軸接種在B5+ 3.0 mg·L-12,4-D + 0.5 mg·L-1KT + 0.7%瓊脂 + 3%蔗糖，pH 5.8的培養(yǎng)基中，在(25±1) ℃下暗培養(yǎng)。根據(jù)前人研究結(jié)果[9-11]，對大蒜體細胞胚發(fā)生過程中的形態(tài)變化進行觀察，確定大蒜體細胞胚發(fā)生不同階段研究材料，分別選取大蒜體細胞胚發(fā)生的外植體(花序軸)、愈傷組織、早期胚性愈傷組織、后期胚性愈傷組織和球形胚5個階段的材料，經(jīng)液氮固定后于-80 ℃保存，用于后續(xù)內(nèi)源激素和相關(guān)基因表達量的檢測。

1.2 內(nèi)源激素及類似物含量的測定

采用高效液相色譜(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，日本)和串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems 6500 Quadrupole Trap，美國)法進行3類激素及類似物含量的測定，包括5種生長素及其類似物吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-乙酸甲酯(ME-IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-甲醛(ICAld)和吲哚-3-甲酸(ICA)，4種細胞分裂素異戊烯腺嘌呤(IP)、順式玉米素(cZ)、反式玉米素(tZ)和二氫玉米素(DZ)以及脫落酸(ABA)。

1.2.1 樣品提取取上述待測材料研磨至粉狀，稱取50 mg研磨后的樣品，加入適量內(nèi)標，用甲醇∶水∶甲酸=15∶4∶1(V∶V∶V)進行提取，提取液濃縮后用100 μL 80%甲醇-水溶液復(fù)溶，過0.22 μm PTFE濾膜，置于進樣瓶中，用于后續(xù)分析[36]。

1.2.2 色譜質(zhì)譜的采集條件色譜條件主要包括：(1)色譜柱：Waters公司的ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(1.8 μm, 2.1 mm* 100 mm)。(2)流動相：水相為超純水(加入0.05%甲酸)，有機相為乙腈(加入0.05%甲酸)。(3)洗脫梯度：0～1 min水/乙腈(95∶5，V/V)，8～9 min水/乙腈(5∶95，V/V)，9.1～12 min水/乙腈(95∶5，V/V)。(4)流速0.35 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進樣量2 μL[37]。質(zhì)譜條件主要包括：(1)離子源操作參數(shù)：電噴霧離子源(ESI)溫度為500 ℃，質(zhì)譜電壓為4 500 V，簾氣(CUR)設(shè)置為35 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(CAD)參數(shù)設(shè)置為中等(medium)。(2)特征離子對的獲得：在串聯(lián)質(zhì)譜儀中，根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進行掃描檢測得到[38-39]。

1.2.3 激素的定性與定量利用植物激素標準品構(gòu)建植物激素數(shù)據(jù)庫，并基于植物激素數(shù)據(jù)庫對質(zhì)譜檢測的數(shù)據(jù)進行定性分析，利用多反應(yīng)檢測模式(MRM)進行激素定量分析。獲得不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有目標物的色譜峰進行積分，通過內(nèi)標法獲得目標激素的相對含量。

1.3 激素相關(guān)基因表達分析

使用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA后，取質(zhì)量良好的1 μg RNA樣品用于第一鏈的cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄使用5× All-In-One RT MasterMix 試劑盒(abm，中國鎮(zhèn)江)，混勻后在PCR 儀(Mastercycler?ep realplex，德國)上進行反轉(zhuǎn)錄的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用qRT-PCR檢測大蒜體細胞胚發(fā)生過程中生長素、CTK和ABA合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達量，引物序列見表1。

表1 大蒜激素相關(guān)基因的引物序列

按照TOROIVD qRT Master Mix試劑盒操作說明，在QuantStudio 3型實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)上進行擴增反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系為10 μL：5 μL SYBR?Green qPCR Master Mix，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，cDNA 1 μL，3.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，進行40個循環(huán)。以AsACTIN為內(nèi)參基因，運用2-ΔΔCt法計算各個基因的表達量，并計算其平均值和標準差。每個發(fā)育階段取3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)進行3次技術(shù)性重復(fù)，以花序軸基因平均表達量為對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007和IBM SPSS Statistics 25.0軟件進行統(tǒng)計與分析，用Duncan新復(fù)極差法檢驗不同發(fā)育階段之間的差異顯著性(P<0.05)，使用 Graphpad prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜體細胞胚發(fā)生不同階段內(nèi)源激素及類似物含量的動態(tài)變化

2.1.1 內(nèi)源生長素及其類似物含量動態(tài)變化大蒜體細胞胚發(fā)生的5個階段均未檢測到吲哚-3-甲酸(ICA)，其余4種內(nèi)源生長素及其類似物含量和總含量的動態(tài)變化見圖1。隨著大蒜體細胞胚的發(fā)生進程，內(nèi)源生長素的總含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在PC階段達到最高值，在LC階段次之，且兩者顯著高于EX階段；總含量在GE階段降至最低值，且GE和CA階段均與EX階段無顯著差異(圖1，A)。4種不同內(nèi)源生長素及其類似物含量在各階段的變化趨勢與生長素總含量基本一致，但含量值存在差異。其中，內(nèi)源吲哚-3-乙酸(IAA)含量在PC階段達到最高值(21.73 ng·g-1)，在LC階段次之，且兩者顯著高于其余階段；其余階段間無顯著差異，并在GE階段降至最低值(1.54 ng·g-1)(圖1，B)；而內(nèi)源吲哚-3-乙酸甲酯(ME-IAA)含量也在PC階段最高(23.97 ng·g-1)，分別約為EX、CA、LC和GE階段的15、11、13和19倍，但這4個階段之間差異不顯著(圖1，C)；與EX階段相比，吲哚-3-甲醛(ICAld)含量在CA和PC階段顯著升高，在PC階段達到最大值(6.33 ng·g-1)，隨后顯著下降，并稍低于EX階段(圖1，D)；吲哚-3-丁酸(IBA)在EX和GE階段中均未檢測到，其含量在PC階段達到最大值(0.91 ng·g-1)，在LC階段顯著下降(圖1，E)?？梢?，在大蒜體細胞胚發(fā)生過程中，4種內(nèi)源生長素及其類似物均在早期胚性愈傷組織階段達到最高值，在愈傷組織和早期胚性愈傷組織階段有大量的內(nèi)源ICAld和IBA的積累，而在球形胚階段4種內(nèi)源生長素及其類似物含量均降至最低值。由此推測，大蒜早期胚性愈傷組織的形成需要較多的內(nèi)源生長素，且內(nèi)源IAA和ME-IAA可能起主要作用；較高的內(nèi)源ICAld和IBA有助于大蒜愈傷組織和早期胚性愈傷組織的形成，但過高水平的內(nèi)源生長素不利于大蒜球形胚的形成。

EX.外植體(花序軸);CA.愈傷組織;PC.早期胚性愈傷組織;LC.后期胚性愈傷組織;GE.球形胚；不同小寫字母表示發(fā)育時期間在0.05水平差異顯著(P<0.05)，下同圖1 大蒜體細胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源生長素及其類似物含量的變化EX. Explant (inflorescence axis); CA. Callus; PC. Primary embryogenic callus; LC. Late embryonic callus; GE. Globular embryo; Different lowercase letters indicate significant difference among development stages at 0.05 level (P<0.05), the same as belowFig.1 Changes in the contents of auxin and its analogs during garlic somatic embryogenesis

2.1.2 內(nèi)源細胞分裂素含量的動態(tài)變化在大蒜體細胞胚發(fā)生的5個階段均未檢測到的二氫玉米素(DZ)，其余3種CTK含量和總含量在大蒜體細胞發(fā)生過程中的變化見圖2。其中，在大蒜體細胞胚發(fā)生的5個階段，總CTK和內(nèi)源反式玉米素(tZ)、異戊烯腺嘌呤(IP)的含量均在EX階段最高，并與其余階段差異顯著，然后從CA階段降低至GE階段，且4個階段間均無顯著差異；而順式玉米素(cZ)在CA和PC階段含量較高，在EX和LC階段較低，在GE階段降至最低。由此推測，反式玉米素和異戊烯腺嘌呤含量的降低可能有利于大蒜愈傷組織的形成，而較高水平的順式玉米素則有利于大蒜愈傷組織和早期胚性愈傷組織的形成；總CTK含量的降低，可能是大蒜體細胞胚發(fā)生所必需的。

圖2 大蒜體細胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源細胞分裂素含量的變化Fig.2 Changes in endogenous cytokinin content during garlic somatic embryogenesis

2.1.3 內(nèi)源脫落酸含量動態(tài)變化圖3，A顯示，在大蒜體細胞胚發(fā)生的5個階段，其內(nèi)源ABA含量在EX階段最高，達到了51.3 ng·g-1，是其他階段的4～138倍；隨著大蒜體細胞胚的形成，ABA含量在CA階段顯著降低，并持續(xù)到GE階段，但這4個階段之間無顯著差異。由此推測，低水平的ABA可能有利于大蒜體細胞胚的發(fā)生。

2.1.4 3類內(nèi)源激素含量動態(tài)變化比較及其比值分析大蒜體細胞胚發(fā)生過程中，比較3類內(nèi)源激素含量發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源生長素及其類似物的含量普遍比3種CTK的含量高(圖1-3，A)。在4種內(nèi)源生長素及其類似物中，內(nèi)源IAA和ME-IAA含量比內(nèi)源ICAld和IBA含量高，內(nèi)源IAA和ME-IAA最高值分別約為ICAld和IBA最高值的3～4和21～24倍；在同一時期生長素及其類似物含量的比較中發(fā)現(xiàn)，在EX、LC和GE階段以IAA含量最高，在CA階段以ICAld含量最高，在PC階段以ME-IAA含量最高，IAA含量次之。在3種CTK中，tZ含量最高，約為cZ和IP含量的3～5倍；在同一時期3種CTK含量的比較中發(fā)現(xiàn)，tZ含量在EX、CA、LC和GE階段最高，cZ含量在PC階段最高。內(nèi)源ABA含量在EX階段高達51.3 ng·g-1，僅低于PC階段的總生長素含量。

另外，比較3類內(nèi)源激素含量變化趨勢發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源生長素及其類似物的含量變化趨勢與3種CTK和ABA含量的變化趨勢不同，而tZ、IP和ABA含量的變化趨勢基本一致。為了進一步探討3類激素總含量的變化趨勢與大蒜體細胞胚發(fā)生之間的關(guān)系，我們進行了各個階段內(nèi)源激素總含量的比值分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大蒜體細胞胚發(fā)生過程中，ABA/AUXIN比值隨著大蒜體細胞胚的形成顯著降低，在PC和GE階段比值較低；ABA/CTK比值在CA階段顯著下降，在PC階段迅速回升，隨后在GE階段又顯著下降；ABA/(AUXIN+CTK)比值在EX階段最高，LC階段次之，在GE階段降至最低值(圖3，B-D)。由此推測，較低的ABA/CTK和ABA/(AUXIN+CTK)比值有助于大蒜愈傷組織和球形胚的形成，較低的ABA/AUXIN和較高的ABA/CTK比值有助于大蒜早期胚性愈傷組織的形成，而較高ABA/(AUXIN+CTK)有助于大蒜后期胚性愈傷組織的形成，這3種激素之間含量的動態(tài)變化調(diào)控了大蒜體細胞胚的發(fā)生。

圖3 大蒜體細胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源ABA含量和各激素之間比值的變化趨勢Fig.3 Changes in endogenous ABA content and mass ratios of various hormones during garlic somatic embryogenesis

2.2 大蒜體細胞胚發(fā)生不同階段內(nèi)源激素相關(guān)基因表達的動態(tài)變化

2.2.1 生長素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達分析在大蒜體細胞胚發(fā)生過程中，IAA合成相關(guān)基因AsYUCCA1和AsTA1的表達量在PC階段達到峰值，與內(nèi)源IAA含量變化趨勢基本一致(圖4，A、B)；生長素應(yīng)答基因AsTIR1表達量在GE階段達到最高值，生長素結(jié)合蛋白基因AsABP1表達量在CA階段最高(圖4，C、D)；內(nèi)源IAA運輸相關(guān)基因AsABCB1、AsAUX1和AsAUX2表達量呈現(xiàn)出不同的趨勢，生長素外運載體基因AsABCB1在PC階段達到最高值，顯著高于其他階段，而生長素內(nèi)運載體基因AsAUX1在LC階段達到最高值，AsAUX2在GE階段達到高值(圖4，E-G)；生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因AsARF1和AsARF2隨著大蒜體細胞胚的發(fā)生逐漸升高，在PC階段達到最高值，隨后又顯著降低(圖4，H、I)；AsIAA1基因表達量在大蒜體細胞胚發(fā)生的過程中呈先升高后降低的變化趨勢，在LC階段達到最高值(圖4，J)；AsAUX22D和AsSAUR1基因表達量在LC階段升至最高值，且均在GE階段維持高表達(圖4，K、L)。

圖4 大蒜體細胞胚發(fā)生過程中生長素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的相對表達量變化Fig.4 Changes in the relative expression of genes related to auxin synthesis and signal transduction during garlic somatic embryogenesis

2.2.2 細胞分裂素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達分析IP合成相關(guān)基因AsIPT1表達量在大蒜體細胞胚發(fā)生后4個階段顯著低于EX階段，且這4個階段之間無顯著性差異，這與IP含量在大蒜體細胞胚發(fā)生過程中的變化趨勢一致(圖5，A)?；駻sKNOX1表達量在后4個階段顯著低于EX階段，在PC和CA階段表達量較高，隨后顯著降低(圖5，B)。cZ合成相關(guān)基因AsLOG1的表達量在CA階段最高，在PC階段顯著降低(圖5，C)。細胞分裂素運輸相關(guān)基因AsENT1和AsENT2在大蒜體細胞胚發(fā)生過程中變化趨勢不同，AsENT1在體細胞胚發(fā)生各階段的表達量無顯著差異，而AsENT2隨著體細胞胚的形成而先升高后降低，在PC階段達到最高值(圖5，D、E)。細胞分裂素受體基因AsHK1表達量在PC、LC和GE階段顯著高于EX和CA階段；AsHK2在后4個階段維持高水平表達，在LC階段達到最高值，顯著高于GE階段(圖5，F(xiàn)、G)。隨著大蒜體細胞胚的發(fā)生，CTK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因AsORR-A1和AsORR-A2表達量均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在PC階段達到峰值，隨后顯著降低；AsORR-B1表達量從CA階段顯著升高，在PC階段達到最高值，而AsORR-B2表達量在各階段之間無顯著差異(圖5，H-K)。

圖5 大蒜體細胞胚發(fā)生過程中細胞分裂素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的相對表達量變化Fig.5 Changes in relative expression levels of genes related to cytokine synthesis and signal transduction during garlic somatic embryogenesis

2.2.3 脫落酸合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達分析隨著大蒜體細胞胚的發(fā)生，ABA合成相關(guān)基因AsZEP1的表達量先升高后降低，在LC階段達到最大值(圖6，A)。ABA合成限速酶基因AsNCED1和AsNCED2在后4個階段的表達量顯著低于EX階段，其中AsNCED1在LC階段略有回升，而AsNCED2表達量從PC階段降低至GE階段(圖6，B、C)。轉(zhuǎn)錄因子基因AsHDG表達量在PC階段達到峰值，顯著高于其他階段(圖6，D)。ABA受體基因AsPYL1表達量在GE階段達到最高值，顯著高于其他階段，而AsPYL2的表達量也在GE階段達到最大值，并顯著高于EX和CA階段(圖6，E、F)。PYL下游基因AsPP2C表達量隨著大蒜體細胞胚的發(fā)生呈先升高后降低的變化趨勢，在PC階段達到最高值，在GE階段降到最低值(圖6，G)。ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因AsSnRK2表達量在大蒜體細胞胚發(fā)生的各個階段無顯著差異(圖6，H)。ABFs轉(zhuǎn)錄因子家族中的AsABI1基因表達量在LC階段達到最高值，顯著高于其他階段(圖6，I)。

圖6 大蒜體細胞胚發(fā)生過程中脫落酸合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的相對表達量變化Fig.6 Changes in the relative expression of genes related to abscisic acid synthesis and signal transduction during garlic somatic embryogenesis

3 討 論

3.1 大蒜體細胞胚發(fā)生不同發(fā)育階段主要內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律

植物體細胞胚發(fā)生過程中的內(nèi)源激素含量因物種和檢測方法不同而異。高效液相色譜法(HPLC)檢測枇杷[25]胚性愈傷組織中的內(nèi)源IAA含量可高達1 000 ng·g-1，用同樣的方法檢測茶樹[19]體細胞胚發(fā)生過程中的內(nèi)源IAA含量最高只有27 ng·g-1，而用LC-MS/MS方法檢測胡椒中內(nèi)源IAA含量更低，最高只有6.21 ng·g-1[40]。本試驗使用LC-MS/MS檢測發(fā)現(xiàn)大蒜體細胞胚內(nèi)源IAA含量最高為21.73 ng·g-1。

不同植物的體細胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源生長素含量的變化趨勢不同。在玉米[15]和姜黃[19]的體細胞胚發(fā)生過程中，內(nèi)源IAA先上升后下降，在胚性愈傷組織時達到峰值，而北五味子[21]則在球形胚時期達到峰值。本研究中，大蒜體細胞胚形成過程中內(nèi)源IAA含量先逐漸升高，在PC階段達到最高值，隨后降低，與玉米和姜黃體細胞胚中內(nèi)源IAA含量的變化趨勢基本一致。除內(nèi)源IAA外，本研究還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源IBA、ME-IAA和ICAld含量均在大蒜體細胞胚形成的PC階段達到最高值，在GE階段降至最低值。

在紅豆和碧桃中，非胚性愈傷組織的內(nèi)源細胞分裂素tZ和cZ含量高于胚性愈傷組織[41-42]。本研究發(fā)現(xiàn)，tZ含量在EX階段最高，隨后顯著降低，而內(nèi)源cZ含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，在CA和PC階段較高，這與前人研究結(jié)果有所不同。吉訓(xùn)志等[40]發(fā)現(xiàn)IP含量在胚性愈傷組織與體細胞胚混合階段顯著高于其他階段，但含量較低。而在本研究中，IP含量在EX階段顯著高于其他階段，但總體含量也較低，這與前人研究結(jié)果有所不同，這可能是由于不同物種體細胞胚發(fā)生過程中起主要作用CTK類型不同導(dǎo)致的。

高含量內(nèi)源ABA對棉花和蘋果胚性愈傷組織的形成有促進作用[43-44]，而龍眼和荔枝在胚性愈傷組織和球形胚形成的過程中，都伴隨著內(nèi)源ABA的增加，且在球形胚階段達到最高值[23-24]。本研究則發(fā)現(xiàn)EX階段內(nèi)源ABA含量很高，但隨著大蒜愈傷組織的形成，內(nèi)源ABA含量顯著降低，并在球形胚階段降至最低值，這與前人研究結(jié)果不一致。有研究表明，在人參和紅豆體細胞胚胎發(fā)育后期內(nèi)源ABA顯著升高，但在早期胚階段達到最低值[41,45]。由此推測，因為本研究中的大蒜球形胚處于胚性早期，所以內(nèi)源ABA含量無明顯上升。

3.2 內(nèi)源激素在大蒜體細胞胚發(fā)生中的調(diào)控作用

前人普遍認為生長素在植物體細胞胚發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用，外源生長素的添加是誘導(dǎo)體細胞胚不可或缺的一步，而內(nèi)源IAA含量的上升可能是胚性細胞形成的一個重要標志[46-48]。本研究發(fā)現(xiàn)，生長素及其類似物含量均在PC階段升至最高，在GE階段降至最低，由此推測內(nèi)源IAA、IBA、ME-IAA和ICAld含量的升高可能促進大蒜早期胚性愈傷組織的形成，但過高的內(nèi)源生長素及其類似物可能會抑制大蒜球形胚的形成。有研究表明，CTK雖不是啟動胚性必需的，但是在某些植物中這類物質(zhì)對其胚狀體的發(fā)生也起著關(guān)鍵的作用[49]。本研究發(fā)現(xiàn)，cZ含量在大蒜體細胞胚發(fā)生的CA和PC階段有大量積累，而tZ和IP含量在愈傷組織形成時持續(xù)下降至球形胚階段。由此推測，CTK不是大蒜胚性啟動的必要物質(zhì)，但是cZ含量的積累和tZ、IP含量的降低可能有助于促進大蒜愈傷組織的形成。有研究表明，高水平的內(nèi)源ABA與胚性能力的啟動有關(guān)，它可能通過參與碳水化合物的代謝調(diào)節(jié)植物體細胞胚胎的發(fā)育[50-51]。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA在大蒜體細胞胚發(fā)生的GE階段含量最低，并未出現(xiàn)ABA的積累，因此推測低水平的ABA有助于大蒜體細胞胚的發(fā)生，但對球形胚的發(fā)育作用，還有待深入研究。

3.3 激素相關(guān)基因參與體細胞胚發(fā)生調(diào)控的機理

有研究表明，內(nèi)源性信號和基因的重編程啟動了胚胎發(fā)生過程的信號鏈，從而共同調(diào)控了體細胞胚的發(fā)生[52]。本研究根據(jù)內(nèi)源激素含量在大蒜體細胞胚發(fā)生各階段的變化趨勢，結(jié)合內(nèi)源激素代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達，初步構(gòu)建了大蒜體細胞胚發(fā)生過程中激素水平變化與相關(guān)基因表達之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖7)。

外源施加生長素類物質(zhì)能夠激活生長素合成相關(guān)基因YUC2和YUC4的表達，改變內(nèi)源IAA含量，促進了體細胞胚的發(fā)生[53-54]。本研究中發(fā)現(xiàn)，AsYUCCA1和AsTA1基因相對表達量的變化與內(nèi)源IAA含量的變化趨勢基本一致，這說明AsYUCCA1和AsTA1正調(diào)節(jié)IAA的合成，這與前人研究結(jié)果一致。有研究表明，生長素抑制因子Aux/IAA抑制ARFs的表達，而ARFs激活或抑制下游基因的表達[55-56]。由此推測，低水平的內(nèi)源IAA會減少AsIAA1和AsAUX22D的泛素化降解，抑制AsARF1、AsARF2的表達來調(diào)節(jié)AsSAUR1的表達，進而促進大蒜球形胚的形成(圖7)。

本研究發(fā)現(xiàn)大蒜體細胞胚發(fā)生過程中AsIPT1和AsKNOX1表達量低于EX階段，IP含量的降低可能是因為AsIPT1和AsKNOX1表達量降低導(dǎo)致的。除此之外，AsLOG1的表達也影響cZ含量的變化，而cZ可能通過激活A(yù)sENT2的表達來加速cZ的運輸，進而促進大蒜愈傷組織和早期胚性愈傷組織的形成。植物體內(nèi)CTK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個“磷酸傳遞”的過程，結(jié)合本研究結(jié)果推測，cZ可能通過激活A(yù)sHK2來誘導(dǎo)B型AsORRs的表達，進而調(diào)節(jié)下游A型AsORRs和其他CTK反應(yīng)，促進大蒜體細胞胚的形成(圖7)。本研究還發(fā)現(xiàn)A型AsORR-A1和AsORR-A2表達量在LC和GE階段顯著下降，而B型AsORR-B1和AsORR-B2在LC和GE階段仍維持高水平表達，可能是因為A型AsORRs對B型AsORRs存在負反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致的。

轉(zhuǎn)錄因子HDG可以直接或間接激活NCED3的表達，而NCED上調(diào)表達對ABA的合成具有積極的促進作用[57-58]。本研究中發(fā)現(xiàn)大蒜體細胞胚發(fā)生過程中AsNCED1和AsNCED2表達量低于EX階段，這導(dǎo)致ABA含量顯著降低，而AsHDG和AsNCED2表達量在PC階段升高，這說明AsHDG可能參與調(diào)節(jié)AsNCED2的表達，與前人研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)AsPYL1基因表達量在GE階段最高，與AsPP2C基因表達量變化趨勢相反，所以推測AsHDG和AsNCED2影響內(nèi)源ABA合成，而內(nèi)源ABA影響了AsPYL1的表達；AsPYL1通過抑制AsPP2C基因的表達來促進AsABI1的表達，進而促進了大蒜球形胚的形成(圖7)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)AsSnRK2表達量在大蒜體細胞胚發(fā)生各個階段無顯著差異，可能存在其他調(diào)控途徑，尚需要進一步進行研究。

圖中不同顏色的曲線表示不同內(nèi)源激素含量的變化趨勢；切角矩形框表示不同基因；橢圓框表示不同內(nèi)源激素含量圖7 大蒜體細胞胚發(fā)生過程中激素水平與相關(guān)基因變化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖The curves of different colors in the figure indicate the changing trend of the contents of different endogenous hormones；Tangential rectangular boxes indicate different genes; Oval boxes indicate different endogenous hormone contentsFig.7 Regulatory network diagram of hormone levels and related gene changes during garlic somatic embryogenesis development

4 結(jié) 論

大蒜體細胞胚的發(fā)生是個極其復(fù)雜的動態(tài)過程，內(nèi)源生長素、CTK和ABA含量及相關(guān)基因表達的動態(tài)變化共同調(diào)控了大蒜體細胞胚的形成。在大蒜體細胞胚發(fā)生過程中，大蒜愈傷組織的形成可能需要ICAld、IBA和cZ的積累，高水平的生長素及其類似物和低水平的IP、tZ可能是大蒜早期胚性愈傷組織形成所必需的，而低水平的生長素及其類似物、CTK和ABA可能有利于大蒜球形胚的形成；激素合成相關(guān)基因調(diào)控內(nèi)源激素含量的變化，內(nèi)源激素含量的變化激活激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達，從而共同調(diào)控大蒜體細胞胚的發(fā)生。