鐘淮欽，林榕燕，吳建設(shè)，林 兵，葉秀仙

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心，福州 350013)

雜交蘭(Cymbidiumhybrid)是國蘭(ChineseCymbidium)和大花蕙蘭(Cymbidiumhybridum)種間雜交培育而成的一類蘭花的特稱，兼具國蘭的植株小巧、幽香、典雅和大花蕙蘭的花大、色艷、花期長等優(yōu)異特性，觀賞和經(jīng)濟價值高，極具發(fā)展?jié)摿1-2]。雜交蘭在長期的人工選育培養(yǎng)過程中，獲得一批穩(wěn)定的葉色變異新種質(zhì)，即葉片上不同位置鑲嵌著或金黃、或銀白、或朱紅的條紋或斑塊，稱之為線藝或葉藝；葉藝品種觀賞和商品價值成倍增加，成為了育種的重要目標(biāo)[3-4]。鑒于雜交蘭葉藝性狀對其商品性的重要作用，研究其形成機理，對人工誘發(fā)葉藝具有重要意義。

葉色突變通常是由于葉綠素的代謝過程直接或間接受到突變基因的影響，從而引起葉綠素的含量和比例發(fā)生變化[5-7]。葉色突變體不僅是遺傳和育種研究中的重要材料，還是研究光合機制、葉綠素代謝、激素生理等的理想材料[8]，同時在觀賞植物中能夠極大地提高觀賞價值。國內(nèi)外學(xué)者已在擬南芥[9]、煙草[10]、水稻[11]、大豆[12]、玉米[13]和番茄[14]等模式植物和大宗作物中獲得、鑒定出不同類型的葉色突變體，對其結(jié)構(gòu)、功能、作用等進行了大量研究。而在蘭屬[15-18]、文心蘭[19]、鐵皮石斛[20]、菊花[21]和紅掌[22]等觀賞植物中雖然發(fā)現(xiàn)了多種類型的葉色突變體，但對其變異機理研究的相關(guān)報道較少，研究結(jié)果也不盡相同。目前尚未見有關(guān)雜交蘭葉色突變體的研究報道。

本研究以雜交蘭品種‘紫妍氏’(綠葉)及突變選育的3個穩(wěn)定葉色變異(葉藝)新品系‘福韻西施’、‘爪藝紫妍氏’和‘中透紫妍氏’為材料，從生理學(xué)和細(xì)胞學(xué)角度分析葉片綠色區(qū)域與黃色、銀色區(qū)域的光合色素、葉綠素合成前體物質(zhì)、葉綠素合成相關(guān)酶活性、葉綠素?zé)晒馓匦约叭~片顯微結(jié)構(gòu)、葉綠體超微結(jié)構(gòu)的差異，旨在探討雜交蘭葉色變異的生理基礎(chǔ)，為進一步揭示其形成的分子機理奠定基礎(chǔ)，也為合理利用這一新種質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所花卉研究室種質(zhì)資源圃保存的長勢基本一致且生長狀況良好的雜交蘭‘紫妍氏’(K21)及其3個葉藝品系‘福韻西施’(K21-1)、‘爪藝紫妍氏’(K21-2)和‘中透紫妍氏’(K21-3)。其中，‘紫妍氏’葉片綠色，‘福韻西施’葉片綠色，葉尖至葉片中部邊沿具黃色條紋(爪藝)，‘爪藝紫妍氏’葉片綠色，葉尖至葉片中部邊沿具銀色條紋(爪藝)，‘中透紫妍氏’葉片中間具黃白色寬條紋，葉尖至葉片中部邊沿為綠色。

試驗于2019年9月在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉生理實驗室進行，每組樣品設(shè)置3個重復(fù)，具體用量見測定指標(biāo)與方法。文中用編號和字母表示各品系葉片取樣測定部位，即‘紫妍氏’綠色葉片為K21-G；‘福韻西施’葉片綠色部位為K21-1G，黃色部位為K21-1Y；‘爪藝紫妍氏’葉片綠色部位為K21-2G，銀色部位為K21-2Y；‘中透紫妍氏’葉片綠色部位為K21-3G，黃白部位為K21-3Y。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 光合色素含量測定參考彭運生等[23]、王學(xué)奎[24]的方法，并做適當(dāng)修改。用ddH2O清洗葉片樣品，晾干后，分別剪取4個供試材料葉片中的綠色、黃色或銀色部位，剪碎后稱取0.1 g置于20 mL離心管中，加入10 mL萃取液(丙酮∶無水乙醇=2∶1)，黑暗放置24 h直至葉片完全失綠。用紫外分光光度計分別在470 nm、645 nm和663 nm波長下測定浸提液的吸光度A470、A645和A663，共3次重復(fù)，最后依據(jù)以下公式計算各光合色素含量：

葉綠素a 含量(Chl a)=(12.21A663-2.81A645)V/(1 000W)；

葉綠素b 含量(Chl b)=(20.13A645-5.03A663)V/(1 000W)；

類胡蘿卜素含量(Car)=(1 000A470+483.193 3A663-2 084.331 3A645)V/(229 000W)；

式中，V為提取液體積，W為樣品鮮重。

1.2.2 葉綠素合成前體物質(zhì)含量參照韓巧紅[25]的方法，略作修改，對供試材料的δ-氨基乙酰丙酸(ALA)和膽色素原(PBG)含量進行測定；參照毛晶晶等[26]的方法，略作修改，對供試材料的尿卟啉原 Ⅲ(Urogen Ⅲ)含量和糞卟啉原 Ⅲ(Coprogen Ⅲ)含量進行測定；參照田韋韋[27]的方法，對供試材料的原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)、鎂原卟啉Ⅸ(Mg-Proto Ⅸ)和原葉綠素酸酯(Pchlide)含量進行測定。將‘紫妍氏’綠色葉片的7種葉綠素合成前體物質(zhì)含量設(shè)為100%，葉藝品系葉綠素合成前體物質(zhì)含量以相對于‘紫妍氏’的百分比表示。

1.2.3 葉綠素合成途徑相關(guān)酶活性稱取一定量的樣品材料，以1∶9的比例加入濃度為0.01 mol/L 的PBS緩沖液(pH 7.4)，迅速將樣品勻漿化，2 500 r/min離心20 min后，收集上清夜，用離心管分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩０被阴Ｃ摎涿?ALAD)、膽色素原脫氨酶(PBGD)、尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)、尿卟啉原Ⅲ脫羧酶(UROD)、糞卟啉原Ⅲ氧化酶(CPOX)和原卟啉原氧化酶(PPOX)活性的測定使用對應(yīng)的測定試劑盒(均購置于上海晶抗生物工程有限公司)，操作步驟參照各試劑盒說明書。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)參照GFS-3000光合儀(德國WALZ公司)使用說明書，選擇在上午9:00-11:00于室內(nèi)測定4個供試材料葉片綠色、黃色或銀色部位的葉綠素?zé)晒鈪?shù)PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率Y(Ⅱ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和非化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)。其中Fv/Fm值是在葉片經(jīng)20 min暗處理后于室溫下測定，其余參數(shù)值則直接在室溫下測定，共3次重復(fù)。

1.2.5 葉片顯微結(jié)構(gòu)參照翁伯琦等[28]的方法，對4個供試材料葉片綠色、黃色或銀色部位的顯微結(jié)構(gòu)進行觀察。取樣后，經(jīng)固定、漂洗、脫水、干燥、噴涂等步驟，在掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)下觀察，并采集圖像進行分析。

1.2.6 葉綠體超微結(jié)構(gòu)取4個供試材料葉片綠色、黃色或銀色部位，經(jīng)電鏡固定液4 ℃固定，離心，電鏡固定液4 ℃再固定，PBS緩沖液(pH 7.4)漂洗，鋨酸-磷酸緩沖液PBS(pH 7.4) 20 ℃固定，PBS緩沖液(pH 7.4)漂洗等步驟完成材料的固定程序。而后將材料脫水、滲透、包埋、切片、染色，最后再用透射電子顯微鏡(美國FEI公司)觀察并采集圖像進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件對文中涉及的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，利用SPSS 20.0軟件中的Duncan’s multiple range test方法對統(tǒng)計后的數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交蘭‘紫妍氏’及其葉藝品系葉片光合色素含量比較

由表1可見，3個葉藝品系葉片綠色區(qū)域(K21-1G、K21-2G和K21-3G)的光合色素含量均不同程度地低于‘紫妍氏’綠葉(K21-G)；三者的類胡蘿卜素(Car)含量均與K21-G差異不顯著(P>0.05)，而它們的葉綠素b(Chl b)和總?cè)~綠素(Chl)含量以及K21-2G和K21-3G的葉綠素a(Chl a)含量降幅均達(dá)到顯著水平(P<0.05)； 3個葉藝品系葉片綠色區(qū)域的Car/Chl值均與K21-G差異不顯著，而其Chla/b值均明顯高于K21-G，且K21-3G的增幅還達(dá)到顯著水平。說明雜交蘭葉藝品系葉片綠色區(qū)域的葉綠素含量比‘紫妍氏’顯著降低，且以葉綠素b降低幅度更大，而其類胡蘿卜素含量則無顯著變化。

表1 ‘紫妍氏’不同品系葉片光合色素含量及比值

同時，3個葉藝品系葉片葉藝區(qū)域(K21-1Y、K21-2Y和K21-3Y)的光合色素含量均顯著低于其相應(yīng)的綠色區(qū)域，三者的Chl含量降幅分別達(dá)到79.5%、78.4%和98.3%，Car含量降幅分別達(dá)到88.7%、85.2%和90.9%(P<0.05)。與葉藝品系相應(yīng)綠色區(qū)域相比較，Car/Chl值在K21-3Y中顯著增加了4.39倍(P<0.05)，而在K21-1Y、K21-2Y中分別減少了45.0%和30.6%(P>0.05)，說明葉藝品系葉藝區(qū)域光合色素含量和比例的變化導(dǎo)致植株葉色黃化。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Chla/b值在K21-1Y、K21-2Y中也顯著低于其相應(yīng)的綠色區(qū)域，說明‘福韻西施’和‘爪藝紫妍氏’葉藝區(qū)域葉綠素a含量降低程度明顯高于葉綠素b含量，推測葉綠素a缺乏是其葉片變異的主因； Chla/b值在K21-3Y中顯著高于其相應(yīng)的綠色區(qū)域，說明‘中透紫妍氏’葉藝區(qū)域葉綠素b含量降低程度明顯高于葉綠素a，推測葉綠素b缺乏是其葉片黃化的主因。

2.2 雜交蘭‘紫妍氏’及其葉藝品系葉片葉綠素合成前體物質(zhì)相對含量比較

葉綠素生物合成代謝過程中的某一步發(fā)生障礙，就會導(dǎo)致該反應(yīng)的前體物質(zhì)積累，其后的物質(zhì)積累降低。因此，通過比較突變品系和親本葉綠素生物合成過程中的一些中間產(chǎn)物量，即主要前體物質(zhì)的累積量，可以來初步判斷發(fā)生障礙部位所在。本研究測定了3個葉藝新品系和親本葉片葉藝區(qū)域與綠色區(qū)域葉綠素生物合成前體物質(zhì)δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、膽色素原(PBG)、尿卟啉原 Ⅲ(Urogen Ⅲ)、糞卟啉原 Ⅲ(Coprogen Ⅲ)、原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)、鎂原卟啉Ⅸ(Mg-Proto Ⅸ)和原葉綠素酸酯(Pchlide)的含量。將‘紫妍氏’綠葉7種葉綠素合成前體物質(zhì)含量均設(shè)為100%，葉藝品系材料相應(yīng)葉綠素合成前體物質(zhì)含量以相對于‘紫妍氏’綠葉的百分比表示。

圖1顯示，與‘紫妍氏’綠葉(K21-G)相比，‘福韻西施’和‘爪藝紫妍氏’葉片綠色區(qū)域(K21-1G和K21-2G)的ALA、PBG、Urogen Ⅲ相對含量大多顯著提高，其Coprogen Ⅲ、ProtoⅨ及Mg-Proto Ⅸ相對含量均變化不顯著(P>0.05)，而它們的Pchlide相對含量則顯著降低(P<0.05)；‘中透紫妍氏’葉片綠色區(qū)域(K21-3G)除了Pchlide相對含量比K21-G顯著降低(P<0.05)外，其余6個前體物質(zhì)相對含量均與K21-G差異不顯著(P>0.05)。

ALA. δ-氨基乙酰丙酸；PBG. 膽色素原； Urogen Ⅲ. 尿卟啉原 Ⅲ；Coprogen Ⅲ. 糞卟啉原 Ⅲ；ProtoⅨ. 原卟啉Ⅸ；Mg-Proto Ⅸ. 鎂原卟啉Ⅸ；Pchlide. 原葉綠素酸酯圖1 ‘紫妍氏’不同葉藝品系葉片葉綠素合成前體物質(zhì)相對含量ALA. δ-aminolevulinic acid; PBG. Porphobilinogen; Urogen Ⅲ. Uroporphyrinogen Ⅲ； Coprogen Ⅲ. Coproporphyrinogen Ⅲ；ProtoⅨ. Protoporphyrin Ⅸ； Mg-Proto Ⅸ. Mg-protoporphyrin Ⅸ； Pchlide. ProtochlorophyllideFig.1 Relative contents of precursor materials of chlorophyll in leaves of different ‘Purple Element’ strains

同時，在ALA →PBG→Urogen Ⅲ階段，‘福韻西施’和‘爪藝紫妍氏’各前體物質(zhì)相對含量在K21-1Y和K21-2Y中均不同程度地高于其相應(yīng)的綠色區(qū)域，且隨著進程呈逐漸迅速增加的趨勢(ALA

2.3 雜交蘭‘紫妍氏’及其葉藝品系葉片葉綠素合成相關(guān)酶活性比較

在葉綠素生物合成代謝過程中，催化從ALA到ProtoⅨ反應(yīng)的酶有氨基乙酰脫氫酶(ALAD)、膽色素原脫氨酶(PBGD)、尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)、尿卟啉原Ⅲ脫羧酶(UROD)、糞卟啉原Ⅲ氧化酶(CPOX)和原卟啉原氧化酶(PPOX)。本研究測定了親本‘紫妍氏’葉片及其3個葉藝新品系葉藝區(qū)域與綠色區(qū)域中這6種葉綠素合成相關(guān)酶的活性。將親本‘紫妍氏’綠葉6種葉綠素合成相關(guān)酶活性均設(shè)為100%，3個葉藝品系葉綠素合成相關(guān)酶活性以相對于親本綠葉的百分比表示。

從圖2可知，與‘紫妍氏’綠葉(K21-G)相比，3個葉藝品系葉片綠色區(qū)域的ALAD相對活性有不同程度的提升，其中‘中透紫妍氏’葉片綠色區(qū)域(K21-3G)顯著提高；三者的PBGD、CPOX和PPOX相對活性的變化不顯著(P>0.05)；而UROS和UROD相對活性則顯著下降(P<0.05)。3個葉藝品系葉片葉藝區(qū)域的ALAD相對活性均高于其相應(yīng)的綠色區(qū)域，其中K21-3Y和K21-2Y顯著高于K21-3G和K21-2G；K21-1Y和K21-2Y的PBGD、UROS相對活性顯著高于其相應(yīng)的綠色區(qū)域，其UROD、PPOX相對活性則與其相應(yīng)的綠色區(qū)域差異不顯著，其COPX相對活性卻顯著低于其相應(yīng)的綠色區(qū)域。同時，K21-3Y的PBGD、UROD、COPX相對活性與K21-3G差異不顯著，其UROS和PPOX相對活性顯著低于K21-3G。因此，葉藝區(qū)域葉綠素合成相關(guān)酶活性表現(xiàn)與上述葉綠素生物合成前體物質(zhì)含量測定的結(jié)果相似，都表明K21-1和K21-2葉藝區(qū)域葉綠素合成受阻于尿卟啉原 Ⅲ(Urogen Ⅲ)與糞卟啉原 Ⅲ(Coprogen Ⅲ)之間，K21-3 葉藝區(qū)域葉綠素合成受阻于膽色素原(PBG)與尿卟啉原Ⅲ(Urogen Ⅲ)之間。

ALAD. 氨基乙酰脫氫酶；PBGD. 膽色素原脫氨酶；UROS. 尿卟啉原Ⅲ合成酶；UROD. 尿卟啉原Ⅲ脫羧酶；CPOX. 糞卟啉原Ⅲ氧化酶；PPOX. 原卟啉原氧化酶圖2 ‘紫妍氏’不同品系葉片葉綠素合成代謝途徑相關(guān)酶活性ALAD. Aminoacetyl dehydrogenase; PBGD. Porphobilinogen deaminase; UROS. Uroporphyrinogen Ⅲ synthase; UROD. Uroporphyrinogen Ⅲ decarboxylase; CPOX. Coproporphyrinogen Ⅲ oxidase; PPOX. Proporphyrinogen oxidaseFig.2 Relative activities of chlorophyll synthesis pathways related enzymes in leaves of different ‘Purple Element’ strains

2.4 ‘紫妍氏’與葉藝品系葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)比較

葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)能夠有效地表征光能的利用、傳遞和耗散等作用。光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)反映PS Ⅱ反應(yīng)中心處于開放時的量子產(chǎn)量，是PS Ⅱ最大的光化學(xué)量子產(chǎn)量，能夠反映PS Ⅱ天線色素捕光效率；實際光化學(xué)效率Y(Ⅱ)反映實際光化學(xué)量子產(chǎn)量，較高的Y(Ⅱ)值表示其光能轉(zhuǎn)化效率高，利于合成更多的ATP和NADPH。同時，光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)反映的是PSⅡ天線色素吸收并用于光化學(xué)電子傳遞的那部分光能，其在一定程度上反映了PSⅡ反應(yīng)中心開放部分的比例；非化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)反映的是PSⅡ天線色素吸收并以熱能方式耗散掉的那部分光能，其值越高，說明對光合機構(gòu)的保護作用越強。由表2可見，各葉藝品系綠色區(qū)域的Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qP值，以及K21-1G和K21-3G的NPQ值均與K21-G差異不顯著，但K21-2G的NPQ值卻顯著低于K21-G，即葉藝品系綠色區(qū)域PS Ⅱ天線色素捕光效率、光能轉(zhuǎn)化效率和光化學(xué)電子傳遞均沒有受到顯著影響。與相應(yīng)的綠色區(qū)域相比，各葉藝品系葉藝區(qū)域的Fv/Fm、Y(Ⅱ)值均顯著降低，其qP值均顯著提高，K21-1Y、K21-2Y的NPQ值顯著降低，K21-3Y的NPQ值卻顯著提高。其中，K21-1Y、K21-2Y和K21-3Y的Fv/Fm分別為其相應(yīng)綠色區(qū)域的31.45%、69.69%、80.23%，Y(Ⅱ)值分別為其相應(yīng)綠色區(qū)域的53.22%、63.82%、78.42%，qP值分別為其相應(yīng)綠色區(qū)域的3.43、3.05、3.03倍，NPQ值分別為其相應(yīng)綠色區(qū)域的37.43%、81.95%、128.70%?？梢?，葉藝品系葉藝區(qū)域光化學(xué)能力下降，光能轉(zhuǎn)化效率變低，且K21-1葉片葉藝區(qū)域受影響程度最高，K21-2次之，K21-3最低；K21-1葉片葉藝區(qū)域的PSⅡ反應(yīng)中心開放程度最高，電子傳達(dá)能力最強，K21-2次之，K21-3最弱； K21-3葉片葉藝區(qū)域?qū)夂辖Y(jié)構(gòu)的保護能力最強，K21-2次之，K21-1最弱。

表2 雜交蘭不同品系葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)

2.5 ‘紫妍氏’及其葉藝品系葉片顯微結(jié)構(gòu)

葉片結(jié)構(gòu)與光合作用及生長發(fā)育機理等密切相關(guān)。通過對‘紫妍氏’及其3種葉藝品系的葉片顯微結(jié)構(gòu)進行觀測(圖3)發(fā)現(xiàn)，不同品系葉片均主要由上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮組成，但其中柵欄組織不明顯，主要為海綿組織；親本‘紫妍氏’綠葉(K21-G-A)和3個葉藝品系綠色區(qū)域(K21-1G-A、K21-2G-A、K21-3G-A)的海綿組織細(xì)胞中含有較多的葉綠體淀粉粒，K21-3葉片葉藝區(qū)域(K21-3Y-A)的海綿組織細(xì)胞中含有少量葉綠體淀粉粒，而K21-1、K21-2葉片葉藝區(qū)域(K21-1Y-A、K21-2Y-A)的海綿組織細(xì)胞中未見明顯的葉綠體淀粉粒。同時，一個視野中葉片氣孔數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果表明，K21-3葉片綠色區(qū)域(K21-3G-B)中的氣孔數(shù)量少于親本綠葉(K21-G-B)和其他2個葉藝品系綠色區(qū)域(K21-1G-B、K21-2G-B)；K21-2和K21-3葉片葉藝區(qū)域(K21-2Y-B、K21-3Y-B)的氣孔數(shù)量少于其相應(yīng)的綠色區(qū)域(K21-2G-B、K21-3G-B)。另外，對氣孔的開合程度分析發(fā)現(xiàn)，K21-1和K21-2葉片葉藝區(qū)域(K21-1Y-B、K21-2Y-B)氣孔開度要低于其相應(yīng)的綠色區(qū)域(K21-1G-B、K21-2G-B)。

A.葉片顯微結(jié)構(gòu)； B.葉片氣孔特征圖3 雜交蘭不同品系葉片顯微結(jié)構(gòu)和氣孔特征A. Leaf microstructure; B. Stomatal characteristics of leavesFig.3 Microstructure and stomatal characteristics in leaves of different strains of Cymbidium hybrid

2.6 ‘紫妍氏’及其葉藝品系葉片葉綠體的超微結(jié)構(gòu)

前面的雜交蘭葉藝品系葉片葉藝區(qū)域的葉綠素含量明顯降低，我們推測葉藝區(qū)域的葉綠體結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化，或者是葉綠體的發(fā)育受到了一定的影響。為了進一步了解葉藝品系葉綠體的發(fā)育情況與葉綠素含量的關(guān)系，本研究利用透射電鏡觀測分析了‘紫妍氏’及其3個葉藝品系葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果(圖4)表明，‘紫妍氏’綠葉(K21-G)和3個葉藝品系葉片綠色區(qū)域(K21-1G、K21-2G、K21-3G)的葉綠體被膜清晰，大而飽滿；葉綠體基粒顏色較深，基粒的片層結(jié)構(gòu)清晰，嗜鋨顆粒分散且數(shù)量較少；其中K21-G和K21-1G、K21-3G的葉綠體中部較厚呈梭形，而K21-2G的葉綠體多為緊湊排列，呈橢圓形。3個葉藝品系葉片葉藝區(qū)域(K21-1Y、K21-2Y和K21-3Y)的超薄切片著色較綠色區(qū)域淺，且葉綠體發(fā)育成熟程度也低于綠色區(qū)域；其中K21-1Y、K21-2Y的葉綠體被膜基本可見，但未看到明顯的基粒片層，嗜鋨顆粒較綠色區(qū)域多，葉綠體內(nèi)有空化小泡，較多而且積聚在一起；K21-3Y的葉綠體被膜模糊且破損嚴(yán)重，基本上不具備正常葉綠體的結(jié)構(gòu)特征，無基粒片層，存在嗜鋨顆粒和空化小泡，幾乎呈現(xiàn)出一種空腔化的結(jié)構(gòu)。

Ce.葉綠體被膜；Og.嗜鋨顆粒；Gl.基粒片層；Sg.淀粉粒: Cv.葉綠體內(nèi)空化小泡圖4 雜交蘭不同品系葉片葉綠體的超微結(jié)構(gòu)Ce. Chloroplast envelope; Og. Osmiophilic granule; Gl. Grana lamella; Sg. Starch granule; Cv. Cavitation vesicles in chloroplastFig.4 Ultrastructure of chloroplast in leaves of different strains in Cymbidium hybrid

3 討 論

植物葉色變異的發(fā)生與色素類物質(zhì)合成與降解、葉綠體發(fā)育與形成、核-質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控這些代謝途徑的相關(guān)基因等因素相關(guān)[29,30]。植物葉色突變體的光合色素含量一般均低于其相應(yīng)的野生型，如鐵皮石斛白綠雜色突變體和綠黃雜色突變體[31]、泡桐黃化突變體[32]、西瓜葉色黃化突變體[33]等。本研究中，3個葉藝品系葉片葉藝區(qū)域中的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量均顯著低于對照(K21綠色葉片和相應(yīng)的葉片綠色區(qū)域)，與前人的研究結(jié)果一致。葉色突變體光合色素的變化不僅體現(xiàn)在含量的減少，其Chl a/b值和Caro/Chl值也常常發(fā)生改變[13]。本研究中K21-3葉片葉藝區(qū)域中Chl a/b值和Car/Chl值均顯著高于對照，說明Chl降低程度大于Car，且 Chl b 降低程度大于 Chl a，推測K21-3葉藝形成與葉綠素b缺乏有關(guān)；而K21-1和K21-2葉片葉藝區(qū)域中僅Chl a/b值顯著低于對照，說明 Chl a 降低程度大于 Chl b，推測K21-1和K21-2葉藝的出現(xiàn)與葉綠素a缺乏有關(guān)。

植物葉綠素?zé)晒馓匦耘c葉綠素含量密切相關(guān)，其常常隨著葉綠素含量的變化而發(fā)生改變，與葉綠體的形成與發(fā)育程度也有一定的相關(guān)性[34]。本研究中，3個葉藝品系葉片葉藝區(qū)域中的Fv/Fm值和Y(Ⅱ)值均顯著低于其相應(yīng)的葉片綠色區(qū)域，而其qP值則顯著高于其相應(yīng)的葉片綠色區(qū)域，推測這3個葉藝品系葉片葉藝區(qū)域在電子傳遞過程或光能轉(zhuǎn)化過程受到影響，光化學(xué)能力下降，光能轉(zhuǎn)化效率降低，但反應(yīng)中心開放程度高，電子傳達(dá)能力強。

植物葉綠素的生物合成是由一系列酶催化反應(yīng)組成的，該途徑中任何一步發(fā)生變化都有可能阻礙葉綠素的生物合成，導(dǎo)致葉色改變[35]。目前，已在植物多種葉色突變體中發(fā)現(xiàn)其葉綠素合成的受阻位點，如水稻葉色突變體在UrogenⅢ到ProtoⅨ合成過程受阻[36]；芥菜型油菜黃化突變體在CoprogenⅢ到ProtoⅨ轉(zhuǎn)化過程中受到了阻遏[37]。本研究中，K21-1和K21-2葉片葉藝區(qū)域葉綠素合成的受阻位點可能在由Urogen Ⅲ脫羧產(chǎn)生Coprogen Ⅲ間的反應(yīng)步驟，而K21-3葉片葉藝區(qū)域葉綠素合成的受阻位點可能在由PBG合成Urogen Ⅲ間的反應(yīng)步驟。

葉色突變體中葉綠體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量往往存在一定的變化[20]。墨蘭葉藝品系葉片綠色區(qū)葉綠體存在不同程度的發(fā)育缺陷，而黃色區(qū)的葉綠體更是沒有完整的葉綠體結(jié)構(gòu)[18]；文心蘭黃化突變體中黃葉組織內(nèi)葉綠體減少，部分葉綠體異常[19]；水稻黃綠葉突變體內(nèi)葉綠體數(shù)量明顯減少，且葉綠體內(nèi)沒有基粒類囊體[38]。本研究中，3個葉藝品系葉片葉藝區(qū)域超薄切片著色較淺，葉綠體發(fā)育成熟程度明顯低于綠色區(qū)域，推測該區(qū)域葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能都已受到影響；同時葉片葉藝區(qū)域的基粒片層結(jié)構(gòu)解體甚至消失，嗜鋨顆粒大量增加，這種變化與衰老葉片中退化葉綠體的結(jié)構(gòu)特點有相似之處，反映了葉綠體內(nèi)膜脂代謝的不平衡[39-40]。

綜上所述，雜交蘭紫妍氏3個葉藝品系葉片的葉藝區(qū)域均存在光合色素含量低，光化學(xué)效率低，葉綠體發(fā)生了不同程度的退化等現(xiàn)象。不同的是，葉藝品系K21-1和K21-2表現(xiàn)為葉綠素a缺乏，且葉綠素生物合成受阻于尿卟啉原 Ⅲ(Urogen Ⅲ)脫羧產(chǎn)生糞卟啉原 III(Coprogen Ⅲ)的反應(yīng)步驟；而K21-3表現(xiàn)為葉綠素b缺乏，且葉綠素生物合成代謝受阻位點可能在由膽色素原(PBG)到尿卟啉原Ⅲ(Urogen Ⅲ)的反應(yīng)步驟。本研究結(jié)果表明葉綠素前體物質(zhì)合成受阻和葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育不良，影響了雜交蘭紫妍氏葉片中葉綠素的正常合成，造成葉綠素含量降低，導(dǎo)致葉藝品系葉色改變，植株光能利用率下降。