胡艷美，呂金朔，孫維兵，張興，陳璐，郭大維，黨秀麗*

（1.沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院，農業(yè)農村部東北耕地保育重點實驗室土肥資源高效利用國家工程實驗室，沈陽 110866；2.沈陽環(huán)境科學研究院，沈陽 110167）

由于工業(yè)活動的快速發(fā)展、過量施肥和污水灌溉，土壤重金屬污染已成為農業(yè)環(huán)境中最亟需解決的問題之一[1]。與其他有毒重金屬相比，Cd 具有很高的遷移性，在同等污染程度下，Cd 的生物有效性要比Pb、As和Hg等其他重金屬高得多[2]；Cd很容易被植物吸收、運輸并在食物鏈中積累，即使在較低濃度下也會危害人類健康[3]。據估計，全世界每年約有1.0×106t 的Cd 被釋放到環(huán)境中；在我國，受Cd 污染的農田近1.0×107hm2，被Cd 污染的農產品（食品中Cd 含量超標）達1.5×106t[4]。Cd 在植物中的過度積累會降低植物對營養(yǎng)元素的吸收，最終損害植株的正常生長降低糧食產量[5]。我國土地資源高度緊張，人均耕地面積不到世界平均水平的一半[4]，為了緩解耕地資源短缺和農產品質量下降等問題，通過農藝調控措施對Cd污染農田進行修復和再利用，對于確保我國糧食安全和農業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

Mn 是植物生長所必需的微量元素之一，由于其具有肥料的屬性，在治理土壤Cd 污染的同時還能夠提高糧食籽粒中的Mn 含量，因此，施加Mn 作為經濟有效的重金屬農藝調控方法也越來越受到人們的關注[6-7]。有研究表明，Mn、Zn等元素與Cd具有相同的粒子結構和相似的化學行為，因此會產生拮抗作用，從而顯著降低作物對Cd 的吸收[8]。向Cd 污染土壤中施加MnO2、Fe2O3可以顯著降低土壤中有效態(tài)Cd含量，這是由于鐵錳氧化礦物對土壤中的Cd有較強的吸附性，且在相同施用量下，MnO2的改良效果優(yōu)于Fe2O3[9]。施用MnSO4和水溶性錳均能抑制Cd對水稻的毒害作用[10]，少量的MnSO4就能有效降低小麥籽粒對Cd 的吸收積累[11]，說明施加Mn對緩解植物Cd毒害有一定的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，外源施加Mn可以促進植株生長，并通過“稀釋”作用降低植株體內的Cd 含量[12]。通過Mn-Cd之間的拮抗作用和改良營養(yǎng)狀況可以減輕Cd對白羽扇豆的毒害作用，但是高量Mn處理會使Cd的毒害作用增強，因為Mn作為一種重金屬元素，過量的積累會導致Mn中毒，從而抑制植物生長[13]。

探究Mn 對Cd 有效性的影響對防治棕壤Cd 污染和農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展非常重要。東北地區(qū)既是我國的老工業(yè)基地，也是重要的玉米生產基地，Cd 污染土壤的修復和再利用有助于保障糧食安全。目前的研究多數(shù)集中在Mn對水稻和蔬菜的Cd改良方面，并且缺乏Cd 脅迫下Mn 對玉米不同部位Cd 含量的影響的研究。因此，本文通過盆栽試驗，以玉米為研究對象，探究外源Mn 添加對土壤中Cd 的有效性、玉米生長及不同部位Cd 含量的影響，并通過分析Cd 在玉米不同部位亞細胞的分布進一步研究Mn 對Cd 的固定機制，為探明Mn、Cd 的相互作用以及Cd 污染土壤修復和玉米的安全生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自遼寧省沈陽市沈陽農業(yè)大學科研基地旱地0～20 cm 表層棕壤，其pH 為6.80，有機質含量為10.45 g·kg-1，堿解氮、速效鉀、速效磷的含量分別為13.21、53.25、32.15 mg·kg-1，未檢測出Cd，Mn 全量為195.30 mg·kg-1。供試作物為玉米（Zea mays），品種為沈峰56。

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗，將土壤風干后過2 mm篩，裝入陶瓷盆中，每盆15 kg（按照土壤容重1.3 g·cm-3計）。向盆內土壤中加入常規(guī)用量的尿素、磷肥和鉀肥，其中氮用量為0.1 g·kg-1，磷（P2O5）用量為0.3 g·kg-1，鉀（K2O）用量為0.2 g·kg-1。調節(jié)土壤含水量為田間持水量的60%。靜置3 d后，以Cd（NO3）2·4H2O（分析純）溶液的形式將Cd 加入土壤中，使Cd 濃度分別達到5 mg·kg-1和10 mg·kg-1，分別用Cd1 和Cd2 表示，室溫下陳化2周后備用。Mn以MnSO4·3H2O溶液加入至土壤中，使加入的Mn 與土壤充分混勻。設置Mn 濃度分別為0、20、200、2 000 mg·kg-1，分別記作Mn0、Mn1、Mn2、Mn3，兩種土壤均以未施加Mn（Mn0）為對照。共設8個處理（表1），每個處理重復3次。將上述土壤陳化2周后播種，每盆播種3顆玉米種子，間苗后使每盆留一株長勢相似的幼苗。種植、管理方式與當?shù)仄胀ù筇镆恢?。玉米成熟后采集土壤及植株樣品進行測定。

表1 不同處理Cd和MnSO4的濃度（mg·kg-1）Table1 Concentrations of Cd and MnSO4 in different treatments（mg·kg-1）

1.3 測定項目及方法

1.3.1 土壤Cd賦存形態(tài)

將玉米收獲之后的土樣自然風干，研磨過篩后保存?zhèn)溆?。在土樣中加入硝酸∶鹽酸∶高氯酸混合液（V∶V∶V=3∶1∶1）[14]于微波消解儀（MARS 6，CLASSIC）中消解，再利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICPMPX，Vista-MPX，Agilent Technologies）測定土壤Cd全量。土壤中的Cd 形態(tài)采用Tessier 連續(xù)提取法測定[15]，其相應的形態(tài)為可交換態(tài)、碳酸鹽結合態(tài)、鐵錳氧化物結合態(tài)、有機結合態(tài)和殘渣態(tài)。利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定各形態(tài)Cd 含量，其中殘渣態(tài)含量通過總量減去其他各形態(tài)含量求得。

1.3.2 玉米根系形態(tài)的測定

玉米成熟后還為新鮮狀態(tài)時將其收獲，將玉米分為根、莖、葉和籽粒，然后用去離子水徹底沖洗。用剪刀將根沿莖基部一條條剪下，盡可能收集土壤中的根和從主根上掉落的側根，將所有根浸泡在裝有去離子水的塑料盆中，防止根系打結。將根分開放入托盤中，噴灑適量蒸餾水使根系充分伸展，避免側根重疊和交叉，然后用根系掃描儀（EXPRESSION 10000XL，EPSON）進行分析。記錄總根長、總根表面積、總根體積和平均根直徑。

1.3.3 玉米產量、生物量及各部位Cd、Mn含量的測定

玉米收獲后，將其分為籽粒、葉、莖和根，將樣品放在105 ℃烘箱中殺青30 min，再于70 ℃下烘干至恒質量，此為玉米各部位生物量；將籽粒生物量作為玉米產量。烘干后的根、莖、葉和籽粒分別置于植物粉碎機中粉碎，過篩保存，將樣品于微波消解儀中進行消解，再利用ICP-MPX測定玉米各部位Cd、Mn含量。

1.3.4 玉米各部位亞細胞Cd含量的測定

采用差速離心法分離不同的細胞組分。分別稱取1.00 g 新鮮玉米根、莖、葉、籽粒于石英研缽內，加入20 mL 預冷的提取液（0.154 g·L-1二硫蘇糖醇、0.25 mol·L-1蔗糖溶液、pH 7.5 50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液）充分研磨后轉移至離心管，在4 000 r·min-1、4 ℃下離心15 min，沉淀為細胞壁部分。將上清液繼續(xù)于16 000 r·min-1、4 ℃下離心45 min，沉淀為細胞器部分，上清液即為細胞可溶性部分[16]。將細胞壁和細胞器部分完全轉移到消解管中，置于微波消解儀中進行消解，采用火焰原子吸收分光光度計法進行3 個組分中亞細胞Cd含量的測定。

1.4 數(shù)據處理

所有數(shù)據均以平均值±標準差表示。采用Excel 2010和SPSS 23.0進行相關數(shù)據的計算、統(tǒng)計與處理，通過Duncan 多重比較法進行單因素方差分析，利用Origin 2019軟件作圖。

各部位亞細胞Cd 所占比例=各部位亞細胞Cd 含量/各部位亞細胞Cd含量總和×100%

2 結果與討論

2.1 Cd 脅迫下不同濃度Mn 處理對土壤Cd 賦存形態(tài)的影響

土壤中重金屬的賦存形態(tài)直接影響其毒性和環(huán)境行為[17]。圖1為不同Mn處理對土壤Cd賦存形態(tài)的影響。由圖1 可知，在Cd1 土壤中，Mn0 土壤中的Cd主要以可交換態(tài)存在，其次是殘渣態(tài)和鐵錳氧化物結合態(tài)，有機結合態(tài)最少；與Mn0 相比，Mn1、Mn2、Mn3處理使可交換態(tài)Cd 分別顯著降低了9.4%、6.29%和4.75%；鐵錳氧化物結合態(tài)以及殘渣態(tài)Cd均有不同程度的增加。在Cd2 土壤中，Mn1、Mn2 和Mn3 處理下可交換態(tài)Cd 分別比Mn0 顯著降低了30.81%、28.78%和13.78%，碳酸鹽結合態(tài)Cd 分別顯著降低了2.79%、1.61%和2.88%，有機結合態(tài)Cd 含量均無顯著變化，鐵錳氧化物結合態(tài)和殘渣態(tài)Cd均顯著增加。向土壤中施加Mn促進了可交換態(tài)Cd向其他形態(tài)轉化，其中鐵錳氧化物結合態(tài)Cd 增幅最大。在兩種Cd 污染土壤中，Mn1 處理下可交換態(tài)Cd 含量降幅最大；而相同Mn 施用量下，土壤中Cd 濃度越高，可交換態(tài)Cd 含量降幅越大。

重金屬可交換態(tài)的活性最強，具有較高的移動性和毒性，能被植物直接吸收；殘渣態(tài)最穩(wěn)定，不能被植物吸收利用；其他形態(tài)的活性較低，但在某些特定條件下會發(fā)生轉化[18]。錳氧化物是細小顆粒形狀的晶體，其內部為層狀結構或大的隧道結構，具有較大的內表面積和比表面積，同時電荷零點也較低，因此其對重金屬有很強的吸附能力，可以通過吸附/共沉淀和氧化還原過程來影響土壤中重金屬的形態(tài)和濃度[19]。由圖1 可以看出，Mn 的施加改變了土壤中Cd的賦存形態(tài)，可以提高鐵錳氧化物結合態(tài)和殘渣態(tài)Cd的含量，降低Cd的有效性。還有研究證明，錳氧化物在氧化還原過程中會對Cd產生吸附固定作用，從而降低土壤中Cd的有效性[20]。施Mn還可以提高土壤膠體中錳氧化物的含量，從而增加土壤膠體表面的負電荷，增強Cd在鐵錳氧化物中的吸附，降低Cd的活性[21]。

2.2 Cd脅迫下不同濃度Mn處理對玉米根系形態(tài)的影響

表2 為土壤Cd 脅迫下施Mn 對玉米根系形態(tài)的影響。由表2 可知，在兩種Cd 污染土壤中，相比Mn0處理，Mn1處理的根長、根表面積、根體積以及根平均直徑均顯著增加，增幅為4.57%～30.69%；Mn3 處理的根長、根表面積、根體積和根平均直徑均低于對照，降幅為5.35%～19.90%。Cd1 污染土壤中，與Mn0 處理相比，Mn2處理根長顯著增加，根表面積顯著降低，但在Cd2污染土壤中根長和根表面積均沒有顯著變化。

表2 玉米根系形態(tài)參數(shù)Table2 Morphological parameters of maize root

本研究結果表明，適量的Mn 可以為玉米生長提供一定的Mn營養(yǎng)，促進玉米根系的生長，同時根系在吸收Cd 和Mn 上存在拮抗作用，Mn 的施加可以緩解Cd 對玉米根系的毒害；而過量的Mn 對根系各形態(tài)參數(shù)產生了負面影響，可能是由于其破壞了玉米根系的完整性和質膜通透性[22]，從而產生毒害作用，這也可能在一定程度上促進玉米被動吸收Cd。在不同Cd污染土壤中施加等量的Mn，土壤的Cd 污染程度越重，根系形態(tài)的各指標數(shù)值越低，說明Mn 在低Cd 污染土壤中更能顯著減緩根部Cd 的毒害作用。有研究表明，適量的Mn 會對美洲商陸的根長和根體積有一定的促進作用[23]。還有研究指出適量的MnSO4促進了馬鈴薯根系的生長發(fā)育，但過量則會產生抑制效果[24]。

2.3 Cd脅迫下不同濃度Mn處理對玉米產量和生物量的影響

玉米產量和不同部位的生物量可以直觀地體現(xiàn)出玉米生長發(fā)育的狀況。圖2 為Cd 脅迫下不同濃度的Mn 處理對玉米產量以及各部位生物量的影響。由圖2A 可知，Cd1 土壤中，Mn1 和Mn2 處理的玉米產量均顯著高于Mn0，Cd2 土壤中，Mn1 處理的玉米產量顯著高于Mn0，而Mn3 處理的玉米產量顯著低于MnO。由圖2B 可知，與MnO 相比，在兩種Cd 污染土壤中，Mn1 處理下玉米根、莖和葉的生物量均顯著增加；Mn2 和Mn3 處理下玉米根生物量顯著增加，但葉的生物量卻在Cd1 土壤中顯著降低。

Mn 不但是植物生長所需的營養(yǎng)元素，同時也是一種重金屬元素，因此其會在植物體內產生兩面性。本試驗表明，低量Mn處理在不同Cd污染土壤中均能增加玉米產量和各部位生物量，但是高量Mn 處理則出現(xiàn)了減產的現(xiàn)象，這很可能是因為植物遭受了過量的Cd、Mn 雙重脅迫，同時高量Mn 處理抑制了根系生長。玉米對低量Mn 和高量Mn 的耐受力不同，當植物積累的Mn含量超過了自身的防御能力，Mn就會對植物細胞造成傷害，破壞正常的生理代謝功能。低量Mn 會減輕Cd 對玉米的毒害作用，但超過一定濃度后玉米對Mn 的耐受性就會降低，反而會對作物造成一定程度的毒害作用。有研究指出，逆境下重金屬的脅迫會激活植物的代謝系統(tǒng)，增加植物本身對重金屬的吸收，從而抑制了植物的代謝活動，導致毒害作用的產生[25]。還有研究表明，過量施加Mn 會抑制植物對Fe、Zn 的積累，而Fe、Zn 也是植物生長過程中的必要元素，從而影響植株的正常生長發(fā)育[26]。此外，Mn 在植物光合作用、抗氧化體系及氮代謝過程中也有重要的作用，其還可以通過改善植物的各項生理功能來緩解植物Cd毒害，促進植株生長發(fā)育。

2.4 Cd 脅迫下不同濃度Mn 處理對玉米Cd、Mn 吸收的影響

圖3 為Mn 處理對玉米各部位Cd 吸收的影響，圖4 為Mn 處理下玉米各部位對Mn 的吸收。由圖3 可知，玉米各部位的Cd 含量依次為籽粒＜莖＜葉＜根，說明施Mn 可以降低Cd 在玉米體內的轉運。Mn1、Mn2和Mn3 處理在Cd1 土壤中使籽粒Cd 含量分別比Mn0降低了35.90%、53.85%和48.72%，在Cd2土壤中分別比Mn0 降低了50.00%、52.33%和38.37%。Cd1 土壤中Mn1 和Mn2 處理下葉、莖和根中Cd 含量均比Mn0有不同程度的降低，但在Cd2土壤中Mn1和Mn2處理下根中Cd 含量卻顯著高于Mn0。與Mn0 相比，在兩種Cd 污染土壤中Mn3 處理使根和莖中的Cd 含量均顯著升高。由圖4 可知，Mn 的施加可以顯著提高玉米各部位中的Mn含量。

本研究結果表明，施Mn 不但可以有效降低玉米體內的Cd含量，還可以提高玉米體內Mn的含量。玉米體內Cd 含量的降低與施Mn 能有效降低土壤中可交換態(tài)Cd 含量有關（圖1）。錳氧化物是土壤黏粒氧化物中最活躍的部分之一，也是土壤無機膠體的主要成分之一，土壤膠體的吸附作用也會影響重金屬的遷移[21]，Mn的施加可提高土壤Eh，有利于促進土壤中錳氧化物形成，從而使土壤膠體表面的負電荷增加[19]，改變土壤中Cd的賦存形態(tài)，加強其對Cd的吸附固定，降低Cd的生物有效性。同時，Cd2+和Mn2+在植物中會使用相同的載體蛋白，因此根附近的Cd與Mn存在拮抗作用，當Cd、Mn共存時，Mn2+會優(yōu)先和細胞膜上的載體蛋白相結合，從而抑制Cd2+在膜上的運輸，減少Cd 向植物地上部分的轉運，緩解Cd對玉米的毒害[26]。還有研究證明，施Mn有利于根表鐵錳膜的形成，從而提高對Cd的富集和固定，阻礙其向根系的遷移[19]。

2.5 Cd脅迫下不同濃度Mn處理對玉米不同部位亞細胞Cd分布的影響

Cd 在亞細胞中的分布會密切影響其對植物的危害程度。當植株受到重金屬的脅迫時，細胞壁會與重金屬離子結合或形成液泡區(qū)隔化，使重金屬成為較低活性的解毒形態(tài)[27]。由圖5 可知，總體看，在玉米籽粒、葉、莖和根中，其亞細胞各組分的Cd 所占比例均表現(xiàn)為細胞壁＞細胞器＞可溶部分；Mn1 和Mn2 處理下，細胞壁中Cd 的比例與Mn0 相比分別增加了3.19%～15.96%，在細胞器中的比例與Mn0 相比分別降低了2.12%～10.73%。由圖6 可知，在玉米籽粒和根中，大部分Cd 存在于細胞壁，可溶部分的Cd 含量最低；而在葉和莖中，Cd在細胞器中的含量最低。

從本研究結果可知，細胞的區(qū)隔化分布在降低植物Cd 毒害中發(fā)揮著重要作用。玉米不同部位中，亞細胞Cd分布存在明顯的差異，其主要分布在細胞壁，其次為細胞器和可溶部分。在亞細胞水平上，液泡區(qū)隔化和細胞壁沉積被認為是兩種最重要的重金屬解毒機制[27]。有研究表明，水稻不同部位的Cd 主要分布在細胞壁中，而細胞器中則相對較少[28]，這和本試驗研究結果相似。徐莜等[29]的研究也發(fā)現(xiàn)，施加Mn能顯著提高水稻地上部分Cd 在細胞壁中所占的比例，降低其在可溶部分中的比例，從而降低植物的Cd毒害。Mn 的施加改變了各組分中Cd 的分配比例，有效提高了細胞壁中亞細胞Cd 的比率，而細胞壁作為重金屬離子進入植株的第一道屏障，其上的分子如多糖、蛋白質分子，擁有大量親金屬離子的配位基團（如醛基、氨基、羥基、羧基等），這些金屬配位基團可以與細胞內的重金屬離子相結合，使重金屬離子的跨膜轉運減少[30]，從而降低細胞內重金屬的濃度，減少重金屬毒性。同時Mn進入植物體內后會形成高價態(tài)的錳氧化物附著在細胞壁上，從而有效增強細胞壁對Cd的固持[31]。Cd 在細胞器中比例的降低可能是由于進入到植物體內的大部分Cd被細胞壁所固持或者積聚在空液泡中，增強了細胞質的區(qū)隔化作用，從而可以有效抵御高濃度的Cd 進入細胞器組分，抵抗Cd 的遷移和轉運，減輕Cd對細胞的傷害，維持植物的正常生理代謝功能[32]。Mn2+和Cd2+具有相似的理化性質，使得它們可能具有相同的運輸?shù)鞍?，在載體蛋白結合或者共用相關離子通道方面會存在一定的競爭關系[32]。本研究表明可溶部分的Cd 所占比例最低，說明細胞中的Mn2+和Cd2+在轉運蛋白的結合上有明顯的拮抗作用，Cd 在細胞可溶組分中比例的降低可以有效減輕細胞的Cd毒害。

3 結論

（1）施Mn 可以促進鐵錳氧化物結合態(tài)Cd 的形成，從而降低可交換態(tài)Cd 含量。在5 mg·kg-1和10 mg·kg-1兩種Cd 污染土壤中，20 mg·kg-1的Mn 處理下可交換態(tài)Cd 含量降幅最大，分別為9.4%和30.81%；相同Mn 施用量下，隨土壤Cd 濃度的增加，可交換態(tài)Cd含量降幅增大。

（2）適量的Mn促進了玉米根系的生長，增加了玉米各部位生物量和產量，但高量的Mn 會抑制根系的生長，對植株產生一定的毒害，導致玉米減產。

（3）施Mn 可以阻礙Cd 向根系遷移，從而降低玉米各部位對Cd的吸收和轉運；同時Mn還提高了根部細胞壁對Cd 的固持，降低了細胞器中Cd 的所占比例，有效抑制玉米體內的Cd 活性。隨著Cd 濃度的增加，Mn對玉米地上部Cd吸收的抑制作用也增強。