劉勇豪，徐淼，吳銘，羅俊，尚佳歧，郭立泉，2*

（1.秸稈生物學(xué)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118；2.國家環(huán)境保護(hù)濕地生態(tài)與植被恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，長春 130024）

4-氯硝基苯（4-chloro-1-nitrobenzene，4-CNB）是一種常見的有機(jī)氯中間體，主要用于合成材料、制備染料、藥品（非那西丁、撲熱息痛）、農(nóng)藥（除草醚）等。當(dāng)前，環(huán)境中的4-CNB 污染問題備受各國政府和學(xué)者關(guān)注，被喻為嚴(yán)重威脅人類生命安全的一個定時炸彈[1]。大量排放到環(huán)境中的4-CNB 會引起神經(jīng)衰弱、溶血性貧血、肝損害、敗血癥等疾病甚至死亡，嚴(yán)重威脅人類和動物的安全與健康。在4-CNB的修復(fù)技術(shù)和方法中，生物降解技術(shù)具有安全、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[2]。目前，研究人員已經(jīng)分離得到了多株4-CNB 降解菌株，如睪丸酮假單胞菌（Comamonassp.）、惡臭假單胞菌（Pseudomonassp.）、紅假單胞菌（Rhodosporidiumsp.）和醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）等[3-6]。這些研究為環(huán)境中4-CNB的生物降解提供了重要的方法和手段。

環(huán)境污染中抗生素往往與4-CNB 共存?？股氐奈廴緺顩r、環(huán)境行為、生態(tài)效應(yīng)等方面均是近年來環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。研究結(jié)果顯示，在全國范圍內(nèi)的河流、湖泊、水庫、近岸及海洋以及其沉積物中均已檢出抗生素。其中，以白洋淀湖污染最為嚴(yán)重，湖水中氟喹諾酮類抗生素的含量最高可達(dá)3 093 ng·L-1，其沉積物中抗生素污染物的含量高達(dá)1 475 ng·g-1[7]。在長江口、東海、南海及各海岸線也相繼檢出了抗生素，包括四環(huán)素類抗生素、大環(huán)內(nèi)脂類抗生素、氨基糖苷類抗生素、β-內(nèi)酰胺類抗生素、磺胺類抗生素，這幾類抗生素為環(huán)境中最常檢出的幾類抗生素，其典型濃度水平為ng·L-1至μg·L-1[8-11]。經(jīng)證實(shí)，殘留在環(huán)境中的抗生素將影響微生物的生物量、群落結(jié)構(gòu)和活性，并誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生抗性基因[12]。

抗菌性是抗生素的本質(zhì)屬性?？股乜蓪?-CNB 降解菌這類環(huán)境有益菌產(chǎn)生生態(tài)效應(yīng)，進(jìn)而影響降解菌對環(huán)境中4-CNB 的降解性能。李祎毅等[13]通過紅霉素對細(xì)菌GY2B 的毒性試驗(yàn)，研究了菌體細(xì)胞在紅霉素作用下的生理、毒理指標(biāo)以及后效應(yīng)期間菌體的變化。研究發(fā)現(xiàn)，GY2B 對紅霉素的最高耐受（99.9%死亡率）濃度為25μg·mL-1，長期接觸低于25μg·mL-1的紅霉素可降低GY2B 對藥物的敏感性，使其產(chǎn)生耐藥性。賈慧等[14]通過對紅霉素對多環(huán)芳烴降解菌的毒性及降解性能影響的研究發(fā)現(xiàn)，多環(huán)芳烴生物降解菌降解性能與紅霉素的濃度有關(guān)。劉靜嫻等[15]通過對抗生素對雌二醇降解菌JX-2 降解性能的研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)各抗生素濃度為10.0 mg·L-1時，混合抗生素顯著抑制了菌株對E2 的降解。目前針對4-CNB 生物降解的研究多集中在菌株篩選、鑒定、馴化和降解特性等方面，而圍繞抗生素對其影響方面報(bào)道較少，而且關(guān)于抗生素對于環(huán)境污染物的微生物降解的影響因素的相關(guān)研究也并不全面，缺少有關(guān)抗生素對細(xì)胞活性及酶活性影響的研究。因此，研究抗生素對4-CNB 微生物降解的影響，對微生物降解清潔技術(shù)的應(yīng)用和保障人類健康安全具有重要的意義。

本文比較了9種4-CNB降解菌株的降解效率，篩選出降解效率最高的菌株——睪丸酮叢毛單胞菌CT1（Comamona stestosteroniATCC11996）。通過藥物敏感性試驗(yàn)，研究了18 種環(huán)境中常見抗生素對CT1的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。采用4-CNB-抗生素聯(lián)合培養(yǎng)法，探討了環(huán)境中檢出率最高的氟喹諾酮類抗生素——環(huán)丙沙星對CT1 菌株生長情況、細(xì)胞活性、總超氧化物歧化酶（SOD）活性以及不同濃度抗生素下對菌株降解能力的影響，以期通過研究抗生素對4-CNB 降解性能的影響和所產(chǎn)生的生態(tài)效應(yīng)，為環(huán)境中4-CNB 的生物降解和應(yīng)用提供技術(shù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonastestosteroni）CT1和KF-1、弧菌（Vibrio）H5、布丘氏菌（Buttiauxella）S19-1、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）PS、紅球菌（Rhodococcussp.）P14、施氏假單胞菌（Pseudomonassp.）JP1、假單胞菌（Pseudomonassp.）LY1 和醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）LM1。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

抗生素：鹽酸四環(huán)素、紅霉素、硫酸慶大霉素、鏈霉素硫酸鹽、氨芐青霉素鈉、氯霉素、卡那霉素硫酸鹽、羧芐青霉素鈉、甲硝唑、鹽酸環(huán)丙沙星、頭孢氨芐、鹽酸土霉素、鹽酸金霉素、阿莫西林、鹽酸克林霉素、磺胺甲惡唑、磺胺二甲惡唑和強(qiáng)力霉素，均購自上海瑞華制藥有限公司。

抗生素配制：所有抗生素溶液均為單標(biāo)，使用5 mL容量瓶進(jìn)行配制。紅霉素、氯霉素分別配制成濃度為5 120μg·mL-1的乙醇溶液，其余抗生素為5 120μg·mL-1的水溶液，即為抗生素母液。試驗(yàn)前均使用無菌水稀釋成濃度為1 280μg·mL-1的溶液，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

色譜純4-CNB（美國Sigma-Aldrich公司）。

4-CNB 溶液的配制：使用無水乙醇配制成10 mmol·L-1的4-CNB 母液，4 ℃儲存?zhèn)溆?。試?yàn)時，吸取20μL 4-CNB 母液，加入2 mL LB 培養(yǎng)基中，即4-CNB的終濃度為0.1 mmol·L-1。

分析純氯仿（北京化工廠）；色譜純甲醇（Fisher Scientific 公司）；CCK-8 試劑（Bio-sharp 公司）；SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

LB 培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 4-CNB提取方法

培養(yǎng)液中的4-CNB 采用氯仿進(jìn)行提取，制備的樣品分別加入500 μL 氯仿進(jìn)行萃取，在搖床上振蕩20 min，然后4 000 r·min-1離心10 min，吸取下相400μL，再13 000 r·min-1離心10 min，取下相300 μL，室溫下真空干燥。

1.3.2 4-CNB檢測方法

采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）（Waters e2695）檢測4-CNB 的含量。檢測器：UV（2988 Water Detector）。色譜柱：C18柱（粒徑5 μm，4.6 mm×150 mm）。液相色譜條件為流動相：甲醇∶水=60∶40（V∶V）；流速：0.7 mL·min-1；檢測波長：λ=275 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：25 ℃。真空干燥后的樣品加入40μL 甲醇復(fù)溶后進(jìn)行檢測。

1.3.3 不同菌株對4-CNB的生物降解

將1.1 中的菌株分別活化后，再將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌懸液用LB 液體培養(yǎng)基調(diào)整至OD600nm=0.1，分別加入終濃度為0.1 mmol·L-14-CNB 標(biāo)準(zhǔn)品，置于27 ℃、180 r·min-1恒溫?fù)u床中培養(yǎng)9 h，按1.3.1方法提取培養(yǎng)液中的4-CNB，HPLC 分別檢測4-CNB 降解前后的含量，計(jì)算得到4-CNB 的降解效率（每組樣品設(shè)置3組平行）。

1.3.4 菌株MIC的測定

菌株對抗生素的MIC：指在體外培養(yǎng)細(xì)菌18～24 h后，能夠抑制培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長的最低藥物濃度[16]。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（NCCLS）關(guān)于抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，采用MH 肉湯稀釋法測定優(yōu)勢降解菌株的MIC。取無菌小試管（15 nm×150 nm）12 支置于試管架上，于第1 管加入MH 肉湯1.6 mL，第2～12管各加MH肉湯1.0 mL。于第1管中加入濃度為1 280μg·mL-1的抗生素0.4 mL，混勻后取1.0 mL 至第2 管，第2 管混勻后取1.0 mL 至第3 管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11 管，并從第11 管中吸取1.0 mL溶液棄去，第12 管為不含抗生素的對照組。此時各試管中抗生素濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg·mL-1和0.25 μg·mL-1。然后將菌懸液濃度校正至OD600nm=0.1，并在每管內(nèi)加入該菌液各1.0 mL。第1 管至第11 管抗生素終濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1和0.125 μg·mL-1。然后將其放至搖床中培養(yǎng)24 h（培養(yǎng)條件為：27 ℃、180 r·min-1）。然后在波長為600 nm 處，測定每管的吸光度值（每組樣品設(shè)置3組平行）。

1.3.5 環(huán)丙沙星對菌株降解性能的影響

菌株活化后，將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌懸液用LB 液體培養(yǎng)基調(diào)整至OD600nm=0.1，分別加入終濃度為0.1 mmol·L-14-CNB 標(biāo)準(zhǔn)品，然后加入1 280 μg·mL-1的環(huán)丙沙星溶液，使溶液中環(huán)丙沙星的終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC 和4 MIC（1、2、4 μg·mL-1和16μg·mL-1）。CK為空白對照組，27 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)9 h 后取樣，分別檢測4-CNB 在降解前后的濃度，計(jì)算得到其降解效率。

1.3.6 生長曲線的測定

將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌懸液用新鮮滅菌的LB培養(yǎng)基調(diào)整至OD600nm=0.1，加入1 280μg·mL-1的環(huán)丙沙星溶液，使溶液中環(huán)丙沙星的終濃度為1/4MIC、1/2MIC、MIC 和4MIC。CK0為不加抗生素和4-CNB 的空白對照組，CKc為加4-CNB、不加抗生素的對照組。27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)4、8、12、24 h 和48 h 后，用酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 公司）于600 nm 波長處測OD值（每組樣品設(shè)置3組平行）。

1.3.7 細(xì)胞活性的測定

將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌懸液用新鮮滅菌的LB培養(yǎng)基調(diào)整至OD600nm=0.1，加入1 280μg·mL-1的環(huán)丙沙星溶液，使溶液中環(huán)丙沙星的終濃度為1/4MIC、1/2MIC、MIC 和4MIC。CK0為不加抗生素和4-CNB 的空白對照組，CKc為加4-CNB、不加抗生素的對照組。27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)4、8、12、24 h 和48 h 后，取每種樣品100μL于96孔板中，迅速分別加入CCK-8（Cell Counting Kit-8）指示劑10 μL 混勻后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置1 h。然后于450 nm 波長處測OD值（每組樣品設(shè)置3組平行）。

1.3.8 SOD酶活力測定

將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌懸液用新鮮滅菌的LB培養(yǎng)基調(diào)整至OD600nm=0.1，加入1 280μg·mL-1的環(huán)丙沙星溶液，使溶液中環(huán)丙沙星的終濃度為1/4MIC、1/2MIC、MIC 和4MIC。CK0為不加抗生素和4-CNB 的空白對照組，CKc為加4-CNB、不加抗生素的對照組。27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 h 后，使用總SOD 活性檢測試劑盒（WST-8 法）測定細(xì)菌培養(yǎng)液中SOD 的活性。每組各設(shè)4個復(fù)孔，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對4-CNB的生物降解

為比較不同菌株對4-CNB 降解效率的差異，利用9 種4-CNB 天然降解菌株分別降解終濃度為0.1 mmol·L-1的4-CNB，結(jié)果如圖1所示。其中，CT1降解能力最強(qiáng)，經(jīng)9 h 降解后其降解率即可達(dá)98.4%±0.2%，與其他菌株降解效率均有顯著差異（P＜0.05）。李明堂等[17]選用惡臭假單胞菌（Pseudomonassp.）和醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）在純培養(yǎng)條件（25 ℃、160 r·min-1）下混合培養(yǎng)6 d，對4-CNB 降解率為94.5%，CT1 與其相比具有明顯優(yōu)勢。因此本研究選擇CT1 開展抗生素對4-CNB 降解影響的研究。

2.2 18種抗生素的MIC

在18種常見抗生素中，僅有6種抗生素存在MIC（表1），其中環(huán)丙沙星的MIC值最低，為4μg·mL-1，鏈霉素MIC 最高，為64μg·mL-1。由于環(huán)丙沙星對CT1的抑制作用最為顯著且環(huán)境中氟諾酮類抗生素的污染比較嚴(yán)重，因此選擇環(huán)丙沙星進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，研究不同濃度環(huán)丙沙星對菌株CT1的影響。

表1 不同抗生素對CT1的最低抑菌濃度Table1 Minimum inhibitory concentration of different antibiotics on CT1

2.3 環(huán)丙沙星對菌株CT1降解4-CNB的影響

環(huán)丙沙星對菌株CT1 降解4-CNB 的影響如圖2所示，不同濃度的環(huán)丙沙星均導(dǎo)致菌株對4-CNB 的降解率顯著低于CK。隨著環(huán)丙沙星濃度的增加，菌株對4-CNB 的降解率隨之降低。當(dāng)環(huán)丙沙星濃度分別為1/4MIC、1/2MIC，MIC 和4MIC 時，4-CNB 降解率分別為87.0%±3.3%、78.5%±2.4%、67.8%±3.7%和35.7%±3.9%。這表明環(huán)丙沙星會抑制CT1 的降解，從而在一定程度上影響環(huán)境中4-CNB 的生物降解。宋國濱等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在亞抑菌濃度的頭孢西丁及阿米卡星作用下，與對照組相比，3 種濃度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）的2 種抗生素對2 種毒力基因均有明顯的抑制作用（P＜0.05）。梁珂娟等[19]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星會抑制DNA 的合成和復(fù)制，因此環(huán)丙沙星可能是通過抑制菌株CT1 的DNA 的合成和復(fù)制，從而抑制菌株的生長，降低4-CNB的降解。

2.4 環(huán)丙沙星對菌株CT1生物量的影響

采用紫外分光光度法研究了不同濃度環(huán)丙沙星對CT1 菌株生物量的影響，結(jié)果如圖3 所示。隨著培養(yǎng)時間延長，CK0和僅添加4-CNB（CKc）的對照組其菌體濃度均顯著增加。但是，在4-CNB 存在條件下，與CK0相比，菌體濃度有所下降。這說明4-CNB作為降解底物會對菌體產(chǎn)生一定的抑制作用。

對比CK0和CKc，加入環(huán)丙沙星后，環(huán)丙沙星明顯抑制了菌體的生長。經(jīng)過48 h的培養(yǎng)，CK0的OD600nm值增至1.030，生長迅速。而當(dāng)環(huán)丙沙星濃度分別為1/4MIC、1/2MIC、MIC、4MIC 時，菌體濃度OD600nm值分別為0.333、0.274、0.239、0.153。但是，當(dāng)環(huán)丙沙星濃度高于MIC時，菌株并沒有被完全殺死，這是因?yàn)楫?dāng)抗生素濃度高于MIC值后，在短時間內(nèi)對受試菌的生長產(chǎn)生了抑制，而并不是完全殺死受試菌[20]；只有當(dāng)抗生素濃度大于等于最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）時，才能殺死99.9%以上的受試菌。

2.5 環(huán)丙沙星脅迫下菌體CT1的細(xì)胞活性的變化

采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法，比較了在不同濃度的環(huán)丙沙星脅迫下CT1細(xì)胞活性的變化，結(jié)果如圖4 所示。由對照組CKc結(jié)果可知，4-CNB 對菌體存在一定的抑制作用，0～12 h 時，抑制作用隨著時間的延長而增強(qiáng)。在12 h 后，隨著4-CNB 的降解，細(xì)胞活性逐漸升高。環(huán)丙沙星的濃度低于MIC時，隨著環(huán)丙沙星濃度的升高，細(xì)胞的抑制率逐漸升高。在0～24 h 時，細(xì)胞的抑制率呈增加趨勢，在24～48 h 時，抑制率的增加趨勢逐漸放緩，即環(huán)丙沙星對CT1的抑制作用達(dá)到最大。這與前述不同濃度環(huán)丙沙星對菌體CT1增殖的影響結(jié)果相同。

2.6 環(huán)丙沙星對細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性的影響

SOD酶廣泛分布于生物中，是生物體內(nèi)用于清除超氧陰離子自由基的重要抗氧化酶[21]。通過測定CT1菌細(xì)胞內(nèi)的總SOD 酶活性，探討CT1菌體在不同濃度環(huán)丙沙星脅迫下細(xì)胞內(nèi)酶活性的變化。由圖5可知，在沒有抗生素但有4-CNB的存在時（CKc），CT1菌體與對照組（CK0）SOD 酶活性沒有顯著差異（P＞0.05），分別為21.0 U·mL-1和20.8 U·mL-1。由此可見，4-CNB 對CT1 菌體細(xì)胞內(nèi)酶活性沒有顯著影響（P＞0.05）。而隨著環(huán)丙沙星濃度的增加，CT1 菌體細(xì)胞內(nèi)SOD 酶活性分別下降了4.5%、18.0%、20.9%和43.2%。由此可見，環(huán)丙沙星對細(xì)胞內(nèi)SOD 酶活性的抑制作用，是細(xì)胞增殖受抑制的主要原因之一。

3 討論

近年來，已有多位學(xué)者篩選得到降解4-CNB 的菌株，LIU 等[22]分離得到的Pseudomonas stutzeri需84 h才能降解0.5 mmol·L-1的鄰氯硝基苯。KATSIVELA等[23]分離得到單一菌株Comamonas.sp，在36 h可降解1.3 mmol·L-1的4-CNB。本文首先通過對比9 株菌降解4-CNB 的差異，選擇降解效果最佳的菌株。結(jié)果表明，睪丸酮叢毛單胞菌CT1 降解4-CNB 效果最佳，在9 h時，可降解98.4%的0.1 mmol·L-1的4-CNB。由此可知，菌株CT1 具有高效降解4-CNB 的能力，因此本研究最終選用菌株CT1開展生物降解的研究。

環(huán)境中的4-CNB 污染物通常與抗生素共存。李威等[24]調(diào)查得知，天津冬季某耕地磺胺類抗生素殘留量為2.6～12.5 μg·kg-1；喹諾酮類抗生素殘留量為10.3～30.1μg·kg-1。朱宇恩等[25]選取山西省汾河沿岸的農(nóng)田土壤為研究對象，檢測到環(huán)丙沙星濃度為0.54 μg·kg-1。在抗生素存在的情況下，細(xì)菌在環(huán)境中能否正常生長，能否實(shí)現(xiàn)本身的降解功能還要視其對應(yīng)的MIC 值和抗生素在環(huán)境中的殘留濃度。因此本試驗(yàn)研究了18 種常用抗生素對菌株CT1 的MIC。結(jié)果顯示：環(huán)丙沙星、四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、紅霉素和鏈霉素的MIC 分別是4、16、16、32、32μg·mL-1和64μg·mL-1。這些抗生素的MIC 濃度遠(yuǎn)比環(huán)境中殘留的濃度高，但某些含抗生素的醫(yī)藥廢棄物、濫用抗生素的人畜產(chǎn)生的糞便隨意排放，可能會造成某污染點(diǎn)瞬時濃度過高甚至遠(yuǎn)超出這個濃度水平，從而影響CT1正常的生理功能。因此在使用菌株CT1進(jìn)行環(huán)境修復(fù)時，也要考慮這些抗生素的不良影響。所以本研究選用環(huán)境中殘留最廣泛和MIC 值最低的環(huán)丙沙星進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

通過4-CNB-環(huán)丙沙星聯(lián)合培養(yǎng)，研究在不同環(huán)丙沙星濃度作用下菌株的生長情況和降解情況。結(jié)果顯示：與CK 相比，不同濃度環(huán)丙沙星均會抑制菌株CT1降解4-CNB，且不同濃度環(huán)丙沙星對菌株CT1的抑制均存在顯著差異（P＜0.05）。黃鶯[26]的研究發(fā)現(xiàn)紅霉素濃度高于0.25μg·mL-1（MIC）即會抑制細(xì)菌的生長和菲的降解，紅霉素脅迫可顯著改變降解菌的蛋白表達(dá)，尤其是降解相關(guān)的蛋白表達(dá)量下調(diào)。因此環(huán)丙沙星可能也是通過抑制降解4-CNB 基因的合成，而降低了4-CNB的降解效率。

CCK-8 法具有靈敏、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，細(xì)胞線粒體中的脫氫酶在電子載體的作用下可將CCK-8 還原為甲臜產(chǎn)物，甲臜產(chǎn)物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，可間接反映出活細(xì)胞的數(shù)量，同時也可間接反映出抗生素的毒性[27]。加入不同濃度環(huán)丙沙星后，菌株的生物量和細(xì)胞活性均受到顯著抑制。且隨著培養(yǎng)時間的延長抑制逐漸增強(qiáng)。菌體的生長繁殖受多種因素的影響。SOD 是生物體內(nèi)用于清除超氧陰離子自由基的重要抗氧化酶[28]，本研究通過測定CT1 的SOD 酶活性來探討環(huán)丙沙星對該菌株生長的抑制情況。細(xì)胞代謝過程中會產(chǎn)生活性氧，活性氧的產(chǎn)生和清除在細(xì)胞正常增殖和代謝時一般會保持動態(tài)平衡。如若失衡則會導(dǎo)致氧化脅迫，并對生物膜、酶等造成可逆或不可逆損傷，損傷嚴(yán)重時還可引起細(xì)胞死亡[29]。本試驗(yàn)中與CK 相比，加入不同濃度的環(huán)丙沙星均會導(dǎo)致菌株SOD 酶活性顯著下降，菌株SOD酶活性的下降可能是菌體生物量下降、細(xì)胞活性受到抑制的主要原因。研究表明[30]，環(huán)丙沙星主要作用于細(xì)胞DNA 解旋酶的A 亞單位，抑制DNA 的合成和復(fù)制，從而起到抗菌作用。因此環(huán)丙沙星可能是通過抑制DNA 的合成和復(fù)制，降低SOD 酶活性，從而引起活性氧對菌體損傷，這可能是環(huán)丙沙星對細(xì)胞毒性機(jī)制的一部分重要內(nèi)容。

由于環(huán)境中抗生素的殘留一般為痕量水平[31]，遠(yuǎn)低于試驗(yàn)中使用的環(huán)丙沙星濃度，而且即使添加高于環(huán)境濃度100～1 000 倍的環(huán)丙沙星（MIC），菌株CT1 仍具有較為良好的降解性能，降解率能達(dá)到67.7%以上。這說明菌株CT1 在自然環(huán)境中的正常生理功能不易受到環(huán)丙沙星的抑制，因此其有望直接應(yīng)用于我國各類環(huán)境介質(zhì)中4-CNB 的去除，具有一定的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

（1）本文比較了9 種4-CNB 降解菌株的降解效率，其中睪丸酮叢毛單胞菌CT1 菌株的降解效率最高。在27 ℃條件下，9 h 的降解效率可達(dá)98.4%±0.2%，與其他菌株相比具有顯著性差異。

（2）18 種常見抗生素中，環(huán)丙沙星對菌株CT1 的MIC最低，而四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、紅霉素、鏈霉素等抗生素對CT1 菌株的MIC 較高，其他12 種抗生素則沒有MIC。這說明不同抗生素對CT1 菌體的抑制作用具有較大的差異性，可以應(yīng)對環(huán)境中復(fù)雜的抗生素污染。

（3）不同濃度的環(huán)丙沙星均會顯著抑制菌株對4-CNB 的降解，在高濃度環(huán)丙沙星（4MIC）脅迫下，4-CNB降解率僅為35.7%±3.9%。

（4）SOD 酶活性結(jié)果顯示，4-CNB 不會對CT1 菌株造成細(xì)胞損傷。而加入環(huán)丙沙星后，CT1 菌體內(nèi)SOD 酶活性顯著降低。這說明了環(huán)丙沙星通過降低CT1細(xì)胞內(nèi)SOD活性從而引起的活性氧對菌體損傷，這可能是CT1 細(xì)胞受到環(huán)丙沙星傷害和其降解4-CNB能力下降的主要原因之一。

（5）本文篩選出了4-CNB 優(yōu)勢降解菌株，并考察了環(huán)境中抗生素對降解產(chǎn)生的影響。本研究將有利于正確評價抗生素和4-CNB 的環(huán)境風(fēng)險，并為4-CNB 降解菌等環(huán)境有益菌在實(shí)際應(yīng)用過程中的有效應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。然而對環(huán)丙沙星抑制CT1 降解4-CNB的分子機(jī)理并不清楚，有待于進(jìn)一步研究。