鄧汝森，張海龍，顏廣智，陳盛楠,2，顧萬軍,2，黃良宗,2*

(1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2. 廣東方道基因科技有限公司，廣東 佛山 528000)

馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)屬于蘭氏分群的C群，是馬鏈球菌的一個(gè)亞種，具有宿主多樣性，可通過外傷、手術(shù)等途徑感染多種動(dòng)物[1-3]，在中國主要流行于豬群和馬群[4]。引起馬腺疫的病原體除了馬鏈球菌馬亞種，還有馬鏈球菌獸疫亞種也是主要病原體之一[5]。馬鏈球菌獸疫亞種主要引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥以及突然死亡等[6]。該菌也可以感染人，是一種重要的人畜共患病病原體[7]。

類M蛋白(SzP)是馬鏈球菌獸疫亞種的重要毒力因子和主要的保護(hù)性抗原[8]，具有多種生物學(xué)功能。SzP作為該菌菌體表面一種生物大分子，與其他表面大分子一樣經(jīng)受各種選擇性壓力作用，在進(jìn)化過程中，會(huì)以一定的頻率發(fā)生變異，特別是因免疫選擇性壓力，其表面保護(hù)性抗原位點(diǎn)會(huì)因點(diǎn)突變而發(fā)生改變[9]。因此，SzP基因的變化能代表馬鏈球菌獸疫亞種的進(jìn)化規(guī)律和趨勢。

2018年7月中旬，廣東省江門市某規(guī)?；i場保育仔豬突然發(fā)生散發(fā)性急性死亡，豬場共有保育豬650頭，發(fā)病76頭，死亡17頭，發(fā)病率11.69%，死亡率2.62%。經(jīng)調(diào)查，該豬場于2018年6月初注射豬鏈球菌2型滅活疫苗，發(fā)病后未用抗菌藥物進(jìn)行治療。隨后立即剖檢病豬，經(jīng)一系列細(xì)菌學(xué)檢測手段判定分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種，通過小鼠致病性試驗(yàn)研究該分離菌對小鼠的致病力以及結(jié)合體外藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，以期為臨床防控馬鏈球菌獸疫亞種引發(fā)的疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

豬腦組織樣品，采集于廣東省江門市某規(guī)模化養(yǎng)殖場臨床表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀的病豬。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

PCR擴(kuò)增試劑盒、DL2000 DNA Marker、Gold view 染料、氨芐青霉素、pMD18-T載體連接試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司；細(xì)菌DNA抽提試劑盒購自美基(Magen)生物公司；大腸埃希菌DH5α和馬鏈球菌獸疫亞種質(zhì)控菌株ATCC 43079由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；藥敏紙片購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；血清營養(yǎng)瓊脂平板(含10%小牛血清)、10%小牛血清肉湯、氨芐平板及LB液體培養(yǎng)基(氨芐濃度：100 mg/mL)和鮮血營養(yǎng)瓊脂平板均由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制。48只5～7 周齡雄性BALB/c小鼠購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK(粵)2019-0035。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定

1.3.1 細(xì)菌分離鑒定與形態(tài)學(xué)觀察

無菌操作采取腦頂葉劃線接種于血清營養(yǎng)瓊脂平板(含0.01% NAD)，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況及形態(tài)，挑取疑似單菌落在血瓊脂平板純化培養(yǎng)。挑取純培養(yǎng)的單菌落制作抹片，革蘭染色，觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.3.2 細(xì)菌生化鑒定

按照單盒生化鑒定管使用說明書，對分離菌進(jìn)行生化鑒定，并與伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第8版)的生化結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.3 細(xì)菌16S rRNA基因序列分析及SzP氨基酸序列分析

挑取純培養(yǎng)單菌落接種于10% 小牛血清肉湯，37 ℃、160 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，按照細(xì)菌DNA抽提試劑盒說明書的操作過程抽提分離菌總DNA 用作PCR反應(yīng)的模板。參考文獻(xiàn)[10]合成馬鏈球菌獸疫亞種SzP基因特異性引物，并用16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性產(chǎn)物做膠回收，并把回收產(chǎn)物連接到 pMD-18T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)混勻，置冰浴30 min，42 ℃水浴熱休克90 s后，迅速置冰浴5 min，加入1 mL LB培養(yǎng)液，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)45 min，4 500 r/min常溫離心5 min，吸取1 mL上清，將余液細(xì)胞均勻涂布于氨芐抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h。各挑取5個(gè)陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司廣州分公司進(jìn)行測序。

表1 引物序列信息

1.4 小鼠毒力試驗(yàn)

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液，4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體。用生理鹽水重懸，調(diào)整原液，使100倍稀釋后的菌液OD600約為0.2，進(jìn)行連續(xù)的10倍梯度稀釋并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)以確定實(shí)際接種量。同時(shí)選取4.87×104～4.87×108CFU細(xì)菌量接種5～7 周齡雄性BALB/c小鼠(腹腔注射0.1 mL/只)，每組8只，另設(shè)陰性對照組注射生理鹽水，連續(xù)觀察7 d，每天記錄小鼠的死亡情況，最后采用Karber法[11]計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)。及時(shí)解剖死亡小鼠，觀察小鼠臟器變化，取腦組織和肺臟抹片，革蘭染色鏡檢；同時(shí)取臟器涂抹鮮血平板，置37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)菌純化鑒定。

1.5 藥敏試驗(yàn)

將純培養(yǎng)的細(xì)菌致密劃線接種于血清營養(yǎng)瓊脂平板表面。用無菌鑷子將氟苯尼考、替米考星、環(huán)丙沙星、大觀霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、林可霉素、頭孢噻肟、氧氟沙星、頭孢曲松、阿莫西林、恩諾沙星、青霉素、阿米卡星、復(fù)方新諾明和復(fù)方阿莫西林16 種藥敏片均勻貼至培養(yǎng)基表面，倒置平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)抑菌圈直徑大小來判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)觀察及生化鑒定

用無菌接種環(huán)將分離單菌落劃線接種于鮮血平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，可見圓形、微隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、灰白色、半透明的菌落，呈現(xiàn)明顯的β溶血(圖1A)，革蘭染色鏡檢可見長短不一的鏈狀球菌(圖1B)，分離菌命名為SEZ20180618。通過細(xì)菌微量生化鑒定管檢測分離菌SEZ20180618的生化指標(biāo)，結(jié)果馬尿酸鹽、山梨醇、海藻糖、甘油和七葉苷呈陽性，6.5%高鹽肉湯、菊糖、阿拉伯糖和甘露醇呈陰性，符合馬鏈球菌獸疫亞種生化特性。結(jié)合細(xì)菌形態(tài)和生化結(jié)果可初步判斷分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種。

2.2 細(xì)菌16S rRNA基因序列分析

采用16S rRNA通用引物對分離菌株SEZ20180618進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后連接pMD18-T載體測序。16S rRNA基因產(chǎn)物大小為1 466 bp(圖2)。將測序結(jié)果與GenBank中參考菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)分離菌株SEZ20180618的16S rRNA與馬鏈球菌獸疫亞種同源性>97%。采用MEGA7.0 軟件對分離菌株與參考菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，菌株SEZ20180618與馬鏈球菌獸疫亞種處于同一分支(圖3)。結(jié)合分離菌株SEZ20180618的形態(tài)觀察、生理生化特性鑒定、16S rRNA基因序列分析，最終判定分離菌株SEZ20180618為馬鏈球菌獸疫亞種。

A.血平板上生長；B. 革蘭染色鏡檢(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker；1. 陰性對照; 2. 16S rRNA基因; 3. 陰性對照; 4. SzP基因

注：▲為本試驗(yàn)分離株

2.3 SzP氨基酸序列分析

對SzP基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為364 bp(圖2)，利用MegAlign軟件中的Clustal W將測序結(jié)果與GenBank登錄的SzP基因序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)分離菌株SEZ20180618與馬鏈球菌獸疫亞種參考菌株CT株(GU332844.1)、Cxy012株(AY263783.1)、SH00166株(AY263784.1)、HNC01株(EF421188.1)、47A株(KF214274.1)、FC04株(EF522946.1)、SEZ9407473D株(AF519472.1)和C3株(MH287001.1)的SzP氨基酸序列同源性達(dá)100%。

2.4 小鼠毒力試驗(yàn)

小鼠腹腔按梯度注射SEZ20180618菌株死亡情況見表2。小鼠在攻毒12 h后出現(xiàn)精神沉郁、食欲降低、打堆等臨床癥狀，之后小鼠接連死亡。剖殺死亡小鼠，取脾臟、肝臟和腦等器官劃線分離細(xì)菌，均可分離出與馬鏈球菌獸疫亞種菌落形態(tài)、生長特性和生化特性相一致的細(xì)菌，并對分離菌用馬鏈球菌獸疫亞種SzP基因特異性引物PCR可擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小的條帶。根據(jù)表2計(jì)算SEZ20180618對小鼠的LD50為1.54×106CFU。

表2 SEZ20180618菌株對小鼠的LD50測定

2.5 藥敏試驗(yàn)

分離菌SEZ20180618對復(fù)方阿莫西林、氟苯尼考、替米考星、環(huán)丙沙星、大觀霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、林可霉素、頭孢噻肟、氧氟沙星、頭孢曲松、阿莫西林、恩諾沙星和青霉素共14 種抗生素均敏感；對阿米卡星、復(fù)方新諾明2種抗生素中度敏感(表3)。

表3 SEZ20180618藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

馬鏈球菌獸疫亞種是引起多種動(dòng)物發(fā)病死亡的重要病原體，同時(shí)該菌經(jīng)特定的途徑也可感染人，是一種重要的人畜共患病病原。本試驗(yàn)對采自廣東省江門市某規(guī)?；i場表現(xiàn)神經(jīng)癥狀并死亡的保育豬的腦組織樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，獲得1株革蘭陽性鏈狀排列的球菌，該株分離菌在鮮血平板上呈現(xiàn)β溶血，結(jié)合細(xì)菌生化鑒定、16S rRNA及SzP基因克隆測序分析，確定該株分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種，命名SEZ20180618。

對分離純化培養(yǎng)的SEZ20180618進(jìn)行小鼠毒力試驗(yàn)，結(jié)果表明該菌株對BALB/c小鼠的LD50為1.54×106CFU，表明該株分離菌是具有較強(qiáng)毒力的馬鏈球菌獸疫亞種，由此推測馬鏈球菌獸疫亞種可能是該場保育豬發(fā)生神經(jīng)癥狀死亡的重要原因之一。

體外藥敏試驗(yàn)對臨床篩選敏感抗菌藥物治療疾病具有指導(dǎo)性作用[12]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：分離菌SEZ20180618對復(fù)方阿莫西林、氟苯尼考、多西環(huán)素、阿莫西林、恩諾沙星、青霉素等14種抗菌藥物均敏感；對阿米卡星、復(fù)方新諾明2種抗菌藥物中度敏感。臨床應(yīng)根據(jù)體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感抗菌藥物進(jìn)行治療，同時(shí)應(yīng)將發(fā)病豬隔離飼養(yǎng)，減少病原菌傳染，加強(qiáng)對豬舍環(huán)境的消毒工作，同時(shí)保持通風(fēng)干燥的環(huán)境，減少病原菌滋生。

本研究通過實(shí)驗(yàn)室診斷方法確診引起該豬場保育豬發(fā)生神經(jīng)癥狀死亡的病原是馬鏈球菌獸疫亞種，為臨床診斷和治療提供可靠依據(jù)，同時(shí)對馬鏈球菌獸疫亞種感染的流行病學(xué)調(diào)查和候選疫苗菌株的選擇提供了實(shí)驗(yàn)室參考依據(jù)。