徐孝宙，胡元亮

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095;2. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400)

幾千年前，微生物發(fā)酵已經(jīng)在中國傳統(tǒng)中藥中得到應(yīng)用。例如，六神曲、淡豆豉等中藥都是由霉菌、酵母菌等微生物發(fā)酵而成。傳統(tǒng)發(fā)酵中草藥是將中藥和輔料混合均勻，在溫度、營養(yǎng)條件都適宜的前提下，經(jīng)微生物發(fā)酵獲得提高藥效、改善藥性、降低毒性的目的[1]。部分中草藥的大量有效成分存在于細(xì)胞壁內(nèi)，由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)的雙重阻礙等影響[2]，所以需要微生物產(chǎn)生的大量纖維素酶、半纖維素酶等多種胞外酶破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及細(xì)胞壁與細(xì)胞間質(zhì)的阻礙，使中藥的有效成分和活性物質(zhì)有足夠的、最大限度的提取[3]。宋艷秋等[4]對紅曲霉轉(zhuǎn)化中藥葛根固態(tài)發(fā)酵條件的研究表明，利用發(fā)酵條件可以提高葛根中主要活性成分的含量，進(jìn)一步說明利用微生物轉(zhuǎn)化提高中藥功效是可行的。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是芽孢桿菌屬的一種，是一類內(nèi)生芽孢的革蘭陽性細(xì)菌[5]。該菌生理特征多樣，在自然界中分布廣泛，易于分離培養(yǎng)，對人畜無害，能分泌多種酶和抗菌肽等活性物質(zhì)，具有良好的發(fā)酵性和抗逆性，應(yīng)用廣泛?？莶菅挎邨U菌比其他益生菌更有優(yōu)勢，制備而成的微生態(tài)制劑具有：①能調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)動(dòng)物生長和提高抗病力；②在不利環(huán)境條件下能以孢子形式存在，在飼料制粒、貯存及胃酸環(huán)境中仍能保持高活性；③能刺激動(dòng)物免疫器官的生長發(fā)育，激活淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高機(jī)體免疫力；④能自身合成消化性酶類，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等，與內(nèi)源消化酶共同發(fā)揮作用，促進(jìn)養(yǎng)分消化吸收等優(yōu)良特性[6]。閆鳳蘭等[7]以添加枯草芽孢桿菌的飼料飼喂肉仔雞發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌穩(wěn)定性較好，并能起到抑制消化道中的大腸桿菌、沙門菌和促進(jìn)乳酸桿菌生長的作用?？莶菅挎邨U菌已被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖、醫(yī)藥、植物生防等多個(gè)領(lǐng)域[8]。

靈芝，擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤靈芝和紫靈芝的總稱，具有補(bǔ)中、固腎、補(bǔ)肺、止血的功效，對多種慢性病有一定療效[9]。靈芝對人體具有雙向調(diào)節(jié)作用，能治療多種疾病，涉及心腦血管、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、呼吸、運(yùn)動(dòng)等多個(gè)系統(tǒng)，特別對腫瘤、肝臟病變和失眠等的防治作用最為顯著[10]。靈芝對于動(dòng)物也具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性，何嘉烽等[11]研究表明，給小鼠飼喂靈芝發(fā)酵干粉后，中、高劑量組小鼠的吞噬能力、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、NK細(xì)胞的殺傷活性和血清溶血素含量顯著提高，具有一定的調(diào)節(jié)免疫活性作用，發(fā)酵后的靈芝添加入飼料中，有利于畜禽的健康。范明君等[12]發(fā)現(xiàn)用靈芝菌糠飼料飼喂家禽、豬、反芻及水產(chǎn)動(dòng)物，既能預(yù)防動(dòng)物疾病、減少動(dòng)物生產(chǎn)中抗生素的使用，同時(shí)還能促生長、降低飼養(yǎng)成本，證明了靈芝具有一定的開發(fā)價(jià)值和利用前景。本試驗(yàn)研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵靈芝的最優(yōu)條件，為進(jìn)一步將靈芝發(fā)酵應(yīng)用在動(dòng)物生產(chǎn)中提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 靈芝

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院江蘇省食用菌研究所提供。將靈芝用粉碎機(jī)粉碎成蓬松的粉末狀，倒入密封袋，標(biāo)注日期，置冰箱冷藏保存待用。

1.1.2 菌種來源

枯草芽孢桿菌由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏提供，編號：14246。40%無菌甘油-20 ℃冷凍保存的枯草芽孢桿菌，經(jīng)牛肉膏蛋白胨液體肉湯2～3次傳代，置冰箱冷藏保存待用。

1.1.3 營養(yǎng)培養(yǎng)基

取牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g加純凈水1 000 mL加熱攪拌，調(diào)pH值至7.2～7.4，加入瓊脂25 g攪拌混勻，倒入錐形瓶，121.3 ℃高壓滅菌15～20 min，倒入高溫滅菌的培養(yǎng)皿制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，等待凝固倒置于冰箱冷藏保存。傳代用液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.1.4 孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基

取蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、孟加拉紅0.03 g、氯霉素0.1 g，調(diào)pH值至7.2～7.4，加入瓊脂15 g攪拌混勻，倒入錐形瓶，121.3 ℃高壓滅菌15～20 min，倒入高溫滅菌的平板制備孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，等待凝固倒置于冰箱冷藏保存。

1.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.1 活菌計(jì)數(shù)方法的優(yōu)化

稱取發(fā)酵后的靈芝粉末1 g，加入9 mL純凈水，震蕩混勻。按10倍比稀釋成6個(gè)階梯濃度，分別取10-5、10-6稀釋后的菌液0.1 mL，涂布到5個(gè)直徑為9 cm的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。觀察固體培養(yǎng)基上芽孢桿菌的生長情況并計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

稱取發(fā)酵后的靈芝粉末各1 g，加入100 mL純凈水震蕩混勻稀釋至10-2，再按10倍比稀釋成5個(gè)階梯濃度，分別取10-5、10-6稀釋后的菌液0.1 mL，涂布到5個(gè)直徑為9 cm的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。觀察固體培養(yǎng)基上芽孢桿菌的生長情況并計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

每克樣品活菌數(shù)(CFU)=平均菌落數(shù)(CFU)×10×稀釋倍數(shù)。其中，平均菌落數(shù)是指取菌落數(shù)20～200個(gè)的平板3個(gè)或3個(gè)以上，計(jì)數(shù)平板內(nèi)菌落的平均數(shù)。

1.2.2 枯草芽孢桿菌接種比例的優(yōu)化

采用單因素設(shè)計(jì)，分為3步：①選擇最小接種比例。稱取5組靈芝粉末各5 g，分別接種1、2、5、10 和20 mL枯草芽孢桿菌菌液，即菌液與靈芝粉之比分別為1∶5、1∶2.5、1∶1、1∶0.5和1∶0.25，攪拌混勻，用封口膜封口，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18 h，活菌計(jì)數(shù)。②測定不同接種比例下枯草芽孢桿菌的生長情況。稱取5 g靈芝粉，分別滴入0.5、1和2 mL枯草芽孢桿菌菌液，即菌液與靈芝粉之比分別為1∶10、1∶5和1∶2.5，攪拌混勻，用封口膜封口，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18 h，活菌計(jì)數(shù)。③驗(yàn)證最佳接種比例。稱取50 g靈芝粉末，分別按比例滴入5、10和20 mL的枯草芽孢桿菌液，即菌液與靈芝粉之比分別為1∶10、1∶5和1∶2.5，攪拌混勻，用封口膜封口，37 ℃培養(yǎng)18 h，活菌計(jì)數(shù)。

小比例接種時(shí)，采用“等量遞增法”混勻接種。例如：1∶10比例接種時(shí)，先用0.5 mL菌液接種于2 g靈芝粉末，再與5 g靈芝粉末混勻。

1.2.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

采取枯草芽孢桿菌菌液與靈芝粉末1∶5比例接種，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃分別培養(yǎng)16、18、20、22和24 h，活菌計(jì)數(shù)。

1.3 質(zhì)量檢測

1.3.1 發(fā)酵產(chǎn)物活菌計(jì)數(shù)

靈芝發(fā)酵產(chǎn)物置于干燥通風(fēng)處放置，稱取室溫放置30 d的靈芝發(fā)酵產(chǎn)物1 g，按1.2.1方法操作，培養(yǎng)18 h，計(jì)數(shù)檢測發(fā)酵產(chǎn)物中活芽孢桿菌數(shù)量。

1.3.2 霉菌檢測

肉眼觀察法：靈芝發(fā)酵產(chǎn)物置于干燥通風(fēng)處放置30 d，肉眼觀察發(fā)酵靈芝是否有霉菌生長。

平板計(jì)數(shù)法：按1.2.1方法操作，1 g發(fā)酵靈芝加入100 mL純凈水稀釋到10-2，放入振蕩培養(yǎng)箱均勻振蕩，取稀釋到10-3和10-4的菌液0.1 mL涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基，貼上封口膜，培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)霉菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 活菌計(jì)數(shù)方法優(yōu)化

發(fā)酵靈芝粉末1 g，加入9 mL純凈水，10倍比稀釋取10-5、10-6稀釋的菌液0.1 mL涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)。活菌計(jì)數(shù)結(jié)果存在菌落數(shù)與稀釋濃度不匹配的現(xiàn)象，如表1。分析原因認(rèn)為靈芝粉為蓬松粉末，靈芝粉與水按1∶10混合，稀釋混勻不充分，需提高稀釋倍數(shù)。

發(fā)酵靈芝粉末1 g，加入100 mL純凈水，震蕩混勻稀釋至10-2，10倍比稀釋取10-5、10-6稀釋的菌液0.1 mL涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；罹?jì)數(shù)結(jié)果顯示菌落數(shù)與稀釋濃度呈正相關(guān)，如表1。

表1 優(yōu)化前后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 個(gè)

2.1.2 接種量對芽孢桿菌含量的影響

最小接種量比例試驗(yàn)，5 g靈芝粉末按1∶5、1∶2.5、1∶1、1∶0.5和1∶0.25接種枯草芽孢桿菌菌液，培養(yǎng)18 h均無肉眼可見霉菌生長，枯草芽孢桿菌活菌計(jì)數(shù)則隨著接種量的增加而增長，呈線性關(guān)系。以1 mL菌液接種于5 g靈芝粉(1∶5)為最小接種比例活菌數(shù)量級達(dá)到108(圖1)。

圖1 不同接種比例枯草芽孢桿菌活菌數(shù)

最佳接種比例試驗(yàn)，5 g靈芝粉末按1∶10、1∶5和1∶2.5接種枯草芽孢桿菌菌液，結(jié)果顯示活菌數(shù)與接種量呈線性關(guān)系。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與之一致(圖2)。

圖2 最佳接種比例及驗(yàn)證結(jié)果

通過3次試驗(yàn)的對比與分析，綜合生產(chǎn)成本等因素，優(yōu)化選用1∶5接種枯草芽孢桿菌菌液，靈芝粉末發(fā)酵良好，節(jié)約原材料，降低生產(chǎn)成本。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對芽孢桿菌含量的影響

按1∶5接種量比例，37 ℃培養(yǎng)16、18、20、22 和24 h。結(jié)果顯示最佳發(fā)酵時(shí)間為22 h，培養(yǎng)20～24 h活菌數(shù)最多(圖3)。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間枯草芽孢桿菌活菌數(shù)

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物活菌計(jì)數(shù)

室溫放置30 d的靈芝發(fā)酵產(chǎn)物，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果與細(xì)菌穩(wěn)定期內(nèi)計(jì)數(shù)無明顯差異，活菌數(shù)為1×108CFU/g。

2.3 霉菌含量的計(jì)數(shù)

靈芝發(fā)酵產(chǎn)物室溫放置30 d，觀察結(jié)果顯示無肉眼可見霉菌生長，孟加拉紅培養(yǎng)基上也無霉菌生長。

3 討論

靈芝粉粗纖維含量高，粉碎后直接飼喂動(dòng)物適口性差，免疫活性物質(zhì)吸收利用率低，益生菌發(fā)酵能提高靈芝的利用率。靈芝基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)含量低，不利于乳酸桿菌等益生菌生長，枯草芽孢桿菌對營養(yǎng)及水分要求不高，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵靈芝可降解纖維素，還可以將部分大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可以直接吸收利用的小分子物質(zhì)[13]。

枯草芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)、對營養(yǎng)要求不嚴(yán)格的特性，在低營養(yǎng)的條件下，以芽孢形式休眠，在適宜條件下，芽孢會萌發(fā)繁殖生長[14]。因此本研究使用枯草芽孢桿菌為對象，開展靈芝發(fā)酵試驗(yàn)。固態(tài)發(fā)酵加水量少，發(fā)酵完成后，由于產(chǎn)品水分含量低，不易霉變，且枯草芽孢桿菌在利用靈芝的營養(yǎng)成分進(jìn)行克隆繁殖，發(fā)酵產(chǎn)熱，會進(jìn)一步降低發(fā)酵物質(zhì)的水分，制成預(yù)混料后，便于飼料混合。因而，本研究采用固態(tài)發(fā)酵形式。

通過枯草芽孢桿菌與靈芝粉的不同接種比例的摸索，結(jié)果表明枯草芽孢桿菌在低接種比例時(shí)，具有較好的發(fā)酵效果，凸顯枯草芽孢桿菌的優(yōu)良生長特性?？莶菅挎邨U菌菌液按1∶5接種于粉碎的靈芝，其適應(yīng)期8～10 h，培養(yǎng)10 h進(jìn)入對數(shù)生長期。芽孢桿菌在適宜條件下，如在液態(tài)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，其適應(yīng)期約為6 h[15]。由于固態(tài)發(fā)酵中水分和營養(yǎng)成分均低于營養(yǎng)瓊脂，本次試驗(yàn)中芽孢桿菌在靈芝發(fā)酵中的適應(yīng)期延長。后進(jìn)入對數(shù)生長期，至培養(yǎng)22 h，隨著靈芝中的營養(yǎng)成分被枯草芽孢桿菌所利用，細(xì)菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期，數(shù)量不再上升。

徐亞英等[16]研究表明，枯草芽孢桿菌液發(fā)酵最佳溫度范圍為32～37 ℃，對營養(yǎng)含量高利于發(fā)酵與產(chǎn)熱的基質(zhì)，可以選擇32 ℃發(fā)酵，而靈芝營養(yǎng)物質(zhì)含量低，發(fā)酵過程中產(chǎn)熱量少，當(dāng)發(fā)酵溫度是37 ℃時(shí)，其菌體生長量達(dá)到最高；溫度高于或低于37 ℃，含菌數(shù)都有所下降。本研究選用37 ℃發(fā)酵溫度達(dá)到滿意的效果。

4 結(jié)論

本研究枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵靈芝表明，1∶5接種比例，37 ℃發(fā)酵22 h，至發(fā)酵完成枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)可達(dá)到1.0×108CFU/g，符合國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求(NY/T1461—2007)。固態(tài)發(fā)酵接種活菌量少，在滿足細(xì)菌生長的同時(shí)節(jié)約了成本；同時(shí)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物易于干燥與保存，常溫下保存不易發(fā)霉，利于畜牧業(yè)的運(yùn)輸與應(yīng)用。但靈芝本身成本較高，如何去降低成本適應(yīng)用量大、成本低的畜牧業(yè)應(yīng)用需求，或應(yīng)用于高回報(bào)的領(lǐng)域尚需進(jìn)一步深入研究。