張靜，張濤，盧昱希，任榮清，黃波，周思旋，王婧，趙春萍，史開(kāi)志，張雄*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽重大疫病監(jiān)測(cè)防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/獸用中草藥研究室，貴州 貴陽(yáng) 550002)

牛鼻咽部是連接外部環(huán)境與機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要部位，也是牛呼吸系統(tǒng)疾病(bovine respiratory disease, BRD)致病微生物入侵機(jī)體的切入點(diǎn)。據(jù)調(diào)查，我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)中65%的疾病為BRD，其中肉牛場(chǎng)的感染率達(dá)90%以上，死亡率達(dá)35%[1]。而這些被診斷患有BRD的牛主要以抗生素治療為主，大量抗生素的使用產(chǎn)生耐藥菌株，最終導(dǎo)致無(wú)藥可治。因此，系統(tǒng)性地了解患BRD牛鼻咽部微生物群落特征及致病性病原體有助于定向治療呼吸系統(tǒng)疾病，減少抗菌藥物濫用。然而，牛鼻咽部是一個(gè)半開(kāi)放的環(huán)境，過(guò)境微生物種類繁多，且存在許多不可離體培養(yǎng)的條件性致病微生物，利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)和常規(guī)PCR檢測(cè)來(lái)探索牛上呼吸道微生物多樣性、分析其功能具有一定局限性；細(xì)菌16S rRNA、真菌18S rRNA和真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使基于培養(yǎng)方法難以或不可能檢測(cè)到的微生物物種的鑒定和定量成為可能[2-4]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外利用微生物擴(kuò)增子測(cè)序?qū)εＯ到y(tǒng)微生物組成和性質(zhì)，以及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化如何影響宿主的健康進(jìn)行了廣泛研究[2，5]。與消化系統(tǒng)微生物群在胃腸道中的作用相似，呼吸道微生物群也是影響呼吸系統(tǒng)健康的重要因素[6]。健康的牛呼吸道菌群處于動(dòng)態(tài)平衡，主要由變形桿菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)5個(gè)門水平下的500余種細(xì)菌種屬組成，每種細(xì)菌種屬的相對(duì)含量較低[7]。牛鼻咽微生物多樣性及每類細(xì)菌的相對(duì)豐度隨牛群所處的生產(chǎn)系統(tǒng)、年齡及健康狀況的變化而變化[8]。Holman等[6]采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)評(píng)估了引種第1天和60 d后健康的牛上呼吸道微生物多樣性，剛進(jìn)入飼養(yǎng)場(chǎng)的牛群鼻咽微生物群主要由假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和肉桿菌屬(Carnobacterium)等構(gòu)成，易發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病；飼養(yǎng)60 d后牛鼻咽部微生物則逐漸趨于一致，主要以葡萄球菌屬(Staphylococcus)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、曼氏桿菌屬(Mannheimia)和莫拉菌屬(Moraxella)為主，2個(gè)時(shí)間點(diǎn)牛群鼻咽微生物群之間存在顯著差異。研究還發(fā)現(xiàn)，乳桿菌(Lactobacillus)/乳球菌(Lactococcus)豐度增加表明宿主處于健康狀態(tài)，而溶血性曼氏桿菌(M.haemolytica)、支原體(Mycoplasmabovis)及多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)等相對(duì)豐度增加則表示宿主處于疾病狀態(tài)[9-10]。Zeineldin等[11]也發(fā)現(xiàn)，門水平下，BRD牛鼻咽部變形桿菌門(32.12%)、放線菌門(38.2%)和梭桿菌門(3.86%)比健康牛多；屬水平下，BRD牛不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter，12.54%)、梭菌屬(Fusobacterium，3.71%)和巴氏桿菌屬(Pasteurella，2.38%)含量比健康牛高，支原體和莫拉菌屬的含量顯著高于健康牛。在BRD致死的牛肺灌洗液和肺組織中，致病性病原菌，如溶血性曼氏桿菌(M.haemolytica)、支原體及昏睡嗜血桿菌(H.somnus)的相對(duì)豐度都大于5%，其他種屬在1%～5%之間，而健康的牛肺灌洗液中未發(fā)現(xiàn)支原體[3，12]。由此可知，鼻咽微生物的組成及豐度能直接影響牛下呼吸道中的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致牛呼吸道疾病加劇。部分研究還表明真菌在慢性呼吸道疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中也具有重要作用，且易產(chǎn)生復(fù)雜的耐藥性[13]。張傳師等[14]總結(jié)了國(guó)外的相關(guān)研究主要集中在鼻咽部細(xì)菌類微生物組與BRD的關(guān)系上，缺乏對(duì)牛呼吸道真菌微生物組學(xué)的研究，在國(guó)內(nèi)則未見(jiàn)對(duì)患呼吸系統(tǒng)疾病牛鼻咽部微生物群的相關(guān)研究報(bào)道。因此，從鼻咽部細(xì)菌組和真菌組群落組成出發(fā)，全面了解并闡述微生物組與BRD之間的關(guān)系，有助于進(jìn)一步探討疾病發(fā)病機(jī)制，輔助臨床防治工作。

本研究以2019—2020年期間采集的貴州省內(nèi)3個(gè)牛場(chǎng)患BRD的牛鼻咽微生物為研究對(duì)象，利用16S rRNA V3-V4區(qū)和ITS1區(qū)Illumina NovaSeq測(cè)序，橫向比較不同地區(qū)患病牛鼻咽部微生物群落組成并預(yù)測(cè)其功能，以期為系統(tǒng)了解養(yǎng)牛場(chǎng)發(fā)病病因，深入研究鼻咽微生物的組成與宿主呼吸系統(tǒng)健康之間的關(guān)系，開(kāi)發(fā)新型微生態(tài)制劑及指導(dǎo)牛呼吸系統(tǒng)疾病防制工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

R1組共14份樣品，2020年4月采自貴州省盤縣某牛場(chǎng)，該牛場(chǎng)患病牛臨床表現(xiàn)為中等以上呼吸系統(tǒng)疾病癥狀，具體表現(xiàn)為咳嗽、鼻腔分泌物多，嚴(yán)重時(shí)鼻腔有出血現(xiàn)象，持續(xù)時(shí)間10～20 d；R2組共6份樣品，2020年5月采自貴州省盤縣某牛場(chǎng)，該牛場(chǎng)患病牛臨床表現(xiàn)為咳嗽，鼻腔分泌物增加，食欲減退，精神不佳的癥狀，持續(xù)時(shí)間為5～15 d；R3組共12份樣品，2019年12月采自貴州省大方縣某牛場(chǎng)，該牛場(chǎng)患病牛臨床表現(xiàn)為流鼻涕、輕微咳嗽、食欲減退，持續(xù)時(shí)間為10～15 d。用無(wú)菌棉簽采集患病牛鼻腔拭子，于無(wú)菌管中保存，放置液氮罐中送回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品中DNA的提取及PCR擴(kuò)增

利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對(duì)鼻拭子樣品基因組DNA進(jìn)行提取。之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，擴(kuò)增細(xì)菌16S V3-V4高變區(qū)(341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′， 806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)和真菌ITS1區(qū)(ITS1-1F-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS1-1F-R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)，文庫(kù)構(gòu)建及Ilumina NovaSeq測(cè)序由北京諾禾致源科技股份有限公司協(xié)助完成。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

將每個(gè)樣本測(cè)序獲得的讀段(reads)進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始標(biāo)簽(raw tags)數(shù)據(jù)。將原始標(biāo)簽序列經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的過(guò)濾處理得到高質(zhì)量的標(biāo)簽數(shù)據(jù)(clean tags)。利用QIIME[15]軟件對(duì)高質(zhì)量的標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，具體操作如下：①標(biāo)簽截?。簩⒃紭?biāo)簽從連續(xù)3個(gè)以上堿基質(zhì)量小于或等于19的第1個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)?；②?biāo)簽長(zhǎng)度過(guò)濾：標(biāo)簽數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)截取后得到的標(biāo)簽數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步過(guò)濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度小于標(biāo)簽長(zhǎng)度75%的標(biāo)簽序列。質(zhì)控后的標(biāo)簽序列去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(effective tags)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用Uparse[16]對(duì)所有樣本的有效序列以97%的一致性聚類成為分類操作單元(operational taxonomic units，OTUs)，為檢驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)是否達(dá)到飽和且符合后續(xù)分析要求，從樣本中隨機(jī)抽取一定測(cè)序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)它們所代表OTUs數(shù)目，以抽取的測(cè)序數(shù)據(jù)量與對(duì)應(yīng)的物種數(shù)來(lái)構(gòu)建稀釋曲線(rarefraction curve)，并根據(jù)樣本中OTUs的相對(duì)豐度繪制等級(jí)聚類曲線(rank abundance curve)。使用QIIME軟件進(jìn)行樣本復(fù)雜度分析(alpha diversity)，包括Chao1，ACE，Shannon，Simpson和Observed species共5個(gè)指數(shù)；計(jì)算Unifrac距離，進(jìn)行多組間比較分析(beta diversity)并繪制PCoA圖。對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur[17]和QIIME分別對(duì)細(xì)菌和真菌進(jìn)行物種注釋，在門和屬分類水平上，統(tǒng)計(jì)不同組中的物種豐度和多樣性，為進(jìn)一步挖掘組間微生物菌落的差異，選用t檢驗(yàn)對(duì)3組樣本兩兩之間的微生物菌落組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出各組存在顯著差異的菌落。

1.5 16S rRNA和ITS功能預(yù)測(cè)分析

為探討牛鼻咽部微生物群落在其體內(nèi)發(fā)揮的功能，使用PICRUSt[18]和FunGuild[19]方法分別對(duì)細(xì)菌和真菌進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)，利用R軟件繪制每組樣本的豐度信息熱圖，并從功能差異層面進(jìn)行聚類。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析選用Tukey檢驗(yàn)，結(jié)果表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列拼接質(zhì)控與OTUs聚類分析

經(jīng)16S rRNA和ITS基因高通量測(cè)序，平均測(cè)得牛上呼吸道內(nèi)細(xì)菌原始序列為87 696條，經(jīng)質(zhì)控后平均得到64 128條有效序列；R1、R2和R3組對(duì)應(yīng)的平均有效序列分別為64 880、63 545和63 959條。平均獲得真菌原始序列105 973條，經(jīng)質(zhì)控后，平均得到有效序列65 472條；R1、R2和R3組對(duì)應(yīng)的平均有效序列分別為64 285、65 560和66 572條(表1)。在97%相似度標(biāo)準(zhǔn)下聚類分析，分別得到細(xì)菌OTU為2 851、2 358和2 728個(gè)，其中3組樣本共有的OTU數(shù)目為1 683，R1、R2和R3組特有的OTU數(shù)目分別為474、225和353；得到的真菌OTU分別為1 766、1 213和2 125個(gè)，其中3組樣本共有的OTU數(shù)目為825個(gè)，R1、R2和R3組特有的OTU數(shù)目分別為263、139和607個(gè)(圖1)。

表1 牛鼻咽部細(xì)菌16S rRNA基因和真菌ITS高通量測(cè)序基本信息表

圖1 3組牛鼻咽部細(xì)菌16S rRNA(A)和真菌ITS(B)聚類OTUs韋恩圖

2.2 微生物群落的Alpha多樣性分析

16S rRNA和ITS測(cè)序數(shù)據(jù)的稀釋曲線和等級(jí)聚類曲線結(jié)果表明，各組樣本量足夠，測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有物種(圖2、圖3)。Alpha多樣性指數(shù)反映樣品微生物群落的多樣性。其中，Chao1、ACE 指數(shù)反映菌群豐度，由表2可知，R1、R2和R3組之間上呼吸道細(xì)菌及真菌菌群豐度相似，R2組細(xì)菌和真菌的菌群豐度都最高，細(xì)菌菌群豐度最低的是R3組，真菌菌群豐度最低的是R1組。菌群的多樣性由Simpson和Shannon指數(shù)反映，數(shù)據(jù)顯示，細(xì)菌群落多樣性最高的是R2組，R1組次之，R3組最低；R1和R2組菌群多樣性顯著(P<0.05)高于R3組，R1組與R2組之間無(wú)顯著差異；真菌菌落多樣性最高的是R3組，其次是R2組，最低的是R1組；R1組菌群多樣性顯著(P<0.05)低于R3組，R1組與R2組之間無(wú)顯著差異。表明3組樣品中菌群豐度雖然相似，但菌落多樣性存在較大差異。

圖2 不同組別中的16S rRNA稀釋曲線(A)和等級(jí)聚類曲線(B)

圖3 不同組別中的ITS稀釋曲線(A)和等級(jí)聚類曲線(B)

表2 3組樣本的Alpha多樣性指數(shù)

2.3 微生物群落的Beta多樣性分析

基于加權(quán)的Unifrac距離進(jìn)行PCoA分析，分析3組樣品間微生物的相似性。由圖4A可知，細(xì)菌類主坐標(biāo)PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為總變量的38.43%和17.81%，3組樣品并沒(méi)有各自單獨(dú)聚類，說(shuō)明9組樣品細(xì)菌微生物群落組成相似。而真菌類微生物PCoA分析結(jié)果顯示(圖4B)，主坐標(biāo)PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為總變量的45.69%和23.87%，R1和R2組聚為一類，R3組則單獨(dú)聚類，表明R3組中的多數(shù)患病牛上呼吸道真菌群落組成與R1、R2組差異較大。

圖4 不同地區(qū)患病牛上呼吸道中細(xì)菌類微生物群落PCoA圖(A)和真菌類微生物群落PCoA圖(B)

2.4 不同地區(qū)患病牛上呼吸道中的微生物品種鑒定及菌群結(jié)構(gòu)分析

3個(gè)不同牛場(chǎng)患病牛上呼吸道中細(xì)菌類微生物門水平分布如表3所示，主要以變形桿菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)及放線菌門(Actinobacteria)為主；與R1組相比，R2組變形桿菌門顯著(P<0.05)減少，R3組擬桿菌門、厚壁菌門及放線菌門顯著減少；與R2組相比，R3組變形桿菌門顯著增加，擬桿菌門則顯著減少。屬水平結(jié)果顯示，3組樣品中排前10的主要菌群屬組成相似，但相對(duì)豐度相差較大。R1組中主要以擬桿菌屬(Bacteroides)、不動(dòng)桿菌屬、卟啉菌屬(Porphyromonas)及梭菌屬(Fusobacterium)，其中不動(dòng)桿菌屬和擬桿菌屬顯著高于R3組；R2組中主要以卟啉菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬及不動(dòng)桿菌屬，其中不動(dòng)桿菌屬顯著高于R3組，R3組中主要以莫拉菌屬(Moraxella)、支原體屬(Mycoplasma)、梭菌屬及卟啉菌屬，其中莫拉菌屬顯著高于R1和R2組。

表3 細(xì)菌分類門水平和排前10的屬水平的相對(duì)分布

真菌類微生物門水平分布如表4所示，3組樣品中，主要以子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)為主，R1組和R2組內(nèi)的擔(dān)子菌門極顯著高于(P<0.01)R3組。屬水平上，3組樣品排前10的主要菌群屬豐度相差較大。R1組主要以克柔氏菌屬(Issatchenkia)、隱毛孢耳屬(Apiotrichum)、假絲酵母屬(Diutina)、毛孢子菌屬(Trichosporon)和曲霉菌屬(Aspergillus)為主；R2組主要以克柔氏菌屬、隱毛孢耳屬和毛孢子菌屬為主；R3組主要以曲霉菌屬、(Millerozyma)和克柔菌屬為主。與R1組相比，R2組假絲酵母屬相對(duì)豐度極顯著減少；與R3組相比，R1組和R2組克柔氏菌屬豐度增加，曲霉菌屬豐度減少，差異極顯著。

表4 真菌分類門水平和排前10的屬水平的相對(duì)分布

2.5 上呼吸道微生物功能預(yù)測(cè)

用PICRUSt對(duì)不同地區(qū)患病牛上呼吸道細(xì)菌類群進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。由圖5可知，KEGG通路二級(jí)功能層面上豐度排名前35的預(yù)測(cè)功能基因及它們?cè)诿總€(gè)組中的豐度信息。R1組樣品有18個(gè)功能基因通路豐度減少，17個(gè)功能基因通路豐度增加；R2組樣品有12個(gè)功能基因通路豐度減少，23個(gè)功能基因通路豐度增加；R3組樣品有21個(gè)功能基因豐度減少，14個(gè)功能基因豐度增加。R1組和R2組功能基因豐度富集相似；然而，R3組中功能基因豐度增加的通路在R1和R2組中的豐度降低。其中，R3組中豐度增加的功能基因通路有：疾病感染、遺傳信息呈遞、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥和神經(jīng)退行性疾病等相關(guān)通路；豐度減少的功能基因通路有：核苷酸代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡、消化系統(tǒng)、代謝疾病、氨基酸代謝和碳水化合物代謝等相關(guān)通路。結(jié)果表明，R1組和R2組患病牛感染的病原能夠?qū)е麓x類的相關(guān)通路豐度增加，其中R2組豐度增加的通路比R1組多；疾病感染、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)通路豐度減少。而R3組患病牛感染的病原功能基因豐度富集的結(jié)果與R2組相反。

圖5 不同地區(qū)患病牛上呼吸道中細(xì)菌類微生物功能注釋聚類熱圖

基于真菌的物種分類，F(xiàn)unGuild可以獲得相應(yīng)真菌的生態(tài)功能。用FunGuild對(duì)不同地區(qū)患病牛上呼吸道真菌類群進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。由圖6可知，3組樣品的上呼吸道中均存在動(dòng)物病原菌富集及豐度增加；其中R1和R2組中的動(dòng)物病原菌分別有2種，R1組種有1種，3組樣品中的病原菌種類各不相同。

圖6 不同地區(qū)患病牛上呼吸道中真菌類微生物功能注釋聚類熱圖

3 討論

3.1 呼吸系統(tǒng)疾病牛鼻咽部菌群多樣性

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)患BRD的牛鼻咽部菌群結(jié)構(gòu)及組成進(jìn)行分析，并基于細(xì)菌和真菌注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行菌群功能預(yù)測(cè)。不同場(chǎng)中微生物Alpha多樣性分析和組間微生物群落Beta多樣性分析結(jié)果表明，不同發(fā)病牛場(chǎng)細(xì)菌和真菌豐度相似；同一地區(qū)不同牛場(chǎng)菌群多樣性及菌落結(jié)構(gòu)組成相似，但不同地區(qū)牛場(chǎng)之間菌群多樣性存在顯著差異，菌落結(jié)構(gòu)組成也有所不同。由此可知，牛慢性呼吸系統(tǒng)疾病受地區(qū)環(huán)境因素影響較大，不同地區(qū)導(dǎo)致發(fā)病的誘因存在差異。臨床上，需進(jìn)一步采用分子生物學(xué)技術(shù)或微生物菌屬注釋確認(rèn)病原后進(jìn)行針對(duì)性的治療，否則會(huì)導(dǎo)致牛場(chǎng)抗生素濫用，產(chǎn)生耐藥性。除此之外，隨著生物安全控制體系在畜禽疫病防控上獲得的顯著成效，牛場(chǎng)生物安全控制體系的建立也應(yīng)該被重視，使其成為控制和預(yù)防地區(qū)性牛呼吸系統(tǒng)疾病蔓延的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果顯示，患病牛呼吸道細(xì)菌類微生物主要由6個(gè)門類組成，與Zeineldin等[11]研究的BRD犢牛鼻咽優(yōu)勢(shì)菌群(變形桿菌門32.12%、放線菌門38.2%和梭桿菌門3.86%)組成相比，本研究的樣品中還存在擬桿菌門(19.19%～47.15%)、厚壁菌門(9.59%～16.65%)和軟壁菌門(1.06%～7.93%)；而放線菌門相對(duì)豐度較低，梭桿菌門相對(duì)豐度較高，可能是由不同地區(qū)及不同環(huán)境所致。與正常肉牛鼻咽部微生物組成[20]相比，患BRD牛能檢測(cè)到擬桿菌門和梭桿菌門的存在，放線桿菌門和軟壁菌門的相對(duì)豐度增加，厚壁菌門和變形桿菌門相對(duì)豐度類似，說(shuō)明BRD可導(dǎo)致部分鼻咽部菌群組成及相對(duì)豐度變化。屬水平上，患BRD牛鼻咽部微生物相對(duì)豐度均小于20%，其中包括莫拉菌屬(1.04%～14.99%)、卟啉菌屬(5.16%～19.35%)、擬桿菌屬(2.12%～16%)、不動(dòng)桿菌屬(0.74%～10.92%)、支原體屬(0.68%～7.82%)和曼氏桿菌屬(0.19%～3.06%)。與大多數(shù)研究結(jié)果[8]一致，支原體屬、莫拉菌屬、曼氏桿菌屬、巴氏桿菌屬在不同地區(qū)的患BRD牛鼻咽部中均存在，推測(cè)這3種菌屬可能在牛呼吸系統(tǒng)疾病中起到關(guān)鍵作用，多重感染的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

研究表明，真菌在人類呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，如真菌與喘息病、耐藥性等相關(guān)，也參與了宿主黏膜免疫反應(yīng)，并證實(shí)了呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致真菌群的變化[21]。本研究對(duì)患BRD牛鼻咽部真菌類微生物進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)與慢性呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的優(yōu)勢(shì)菌屬，如克柔氏菌屬(2.28%～45.1%)、曲霉菌屬(1.19%～16.26%)等，表明患BRD的牛呼吸系統(tǒng)會(huì)受到致病性真菌的入侵，最終導(dǎo)致真菌性感染。

3.2 呼吸系統(tǒng)疾病牛鼻咽部菌群中的致病菌

Lima等[9]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)健康和患BRD牛的鼻咽微生物進(jìn)行了分析，與健康牛相比，患病牛鼻咽部中的微生物多樣性降低，致病性病原菌如：牛支原體、溶血性曼氏桿菌、牛巴氏桿菌等相對(duì)豐度顯著升高。本試驗(yàn)在不同地區(qū)患病牛鼻咽部中也檢測(cè)到以上3種致病性細(xì)菌，除此之外，還檢測(cè)到不動(dòng)桿菌屬和金黃桿菌屬。研究發(fā)現(xiàn)，金黃桿菌感染常發(fā)生在慢性呼吸道疾病和免疫力低下的宿主中[22]；弓清梅等[23]發(fā)現(xiàn)腦膜膿毒金黃桿菌會(huì)導(dǎo)致下呼吸道疾病的發(fā)生，且對(duì)絕大多數(shù)抗生素耐藥。產(chǎn)吲哚金黃桿菌的耐藥性也極其復(fù)雜[24]。不動(dòng)桿菌是一種機(jī)會(huì)性致病菌，常引起肺部炎癥，其易感群體與金黃桿菌相似，該菌對(duì)市面上常用的抗菌素具有耐藥性，導(dǎo)致臨床治療困難，病死率較高[25]。以上結(jié)果表明，除常見(jiàn)的致病性細(xì)菌外，金黃桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬可能導(dǎo)致患慢性呼吸道疾病牛和長(zhǎng)期使用抗菌素的牛場(chǎng)的繼發(fā)性感染。

本試驗(yàn)對(duì)患BRD牛鼻咽真菌菌群進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的真菌屬，如：曲霉菌屬、假絲酵母屬和克柔氏菌屬等，其中，曲霉菌屬在慢性呼吸系統(tǒng)疾病中最為常見(jiàn)[13]。本研究3組樣品中均檢測(cè)曲霉菌屬，R3組中相對(duì)豐度最高，表明曲霉菌屬是R3組的主要致病性真菌。假絲酵母屬也是引起下呼吸道感染的真菌之一，在R1組中的相對(duì)豐度大于5%。陳太方等[26]在研究抗真菌藥物對(duì)下呼吸道感染的抑菌作用中發(fā)現(xiàn)假絲酵母屬檢出率是多種真菌中最高的，且具有一定的耐藥性?？巳崾暇鷮僭赗1和R2組中的相對(duì)豐度均大于30%，該菌屬條件性致病菌，高豐度的克柔氏菌可導(dǎo)致支氣管肺炎的發(fā)生[27]。上述結(jié)果表明了在患呼吸系統(tǒng)疾病牛鼻咽微生物可檢測(cè)出致病性真菌，可能影響呼吸道疾病的發(fā)展，具體致病機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

3.3 呼吸系統(tǒng)疾病牛鼻咽部菌群功能預(yù)測(cè)

鼻咽部微生物作為牛機(jī)體微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，微生物組與機(jī)體的互作對(duì)維持宿主生理穩(wěn)態(tài)和機(jī)體健康至關(guān)重要。在相似的的環(huán)境中，盡管群落結(jié)果發(fā)生了巨大變化，但其功能仍然相對(duì)穩(wěn)定[28]。研究者對(duì)牛瘤胃微生物及腸道微生物功能進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)功能集中在氨基酸運(yùn)輸和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的相關(guān)基因上[2]。大多數(shù)的牛呼吸道疾病微生物研究只分析了結(jié)構(gòu)組成、相對(duì)豐度及其與疾病的相關(guān)性，很少針對(duì)微生物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行功能預(yù)測(cè)[8]?；赑ICRUSt和FunGuild數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究揭示了在患呼吸系統(tǒng)疾病的牛鼻咽部細(xì)菌類KEGG二級(jí)水平的通路中，R1組和R2組細(xì)菌類微生物導(dǎo)致代謝類的相關(guān)通路(氨基酸代謝、碳水化合物代謝、消化系統(tǒng)等)豐度增加，可能是由于細(xì)胞和結(jié)締組織破壞，與肺功能受損和全身炎癥相關(guān)[29]。其中消化系統(tǒng)相對(duì)豐度增加，可能與肺-腸軸通路有關(guān)[30]。R3組與其他2組的富集結(jié)果存在差異，功能基因豐度增加的通路主要包括疾病感染、遺傳信息呈遞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，這可能與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、微生物在呼吸道中增殖及宿主-微生物互作有關(guān)。真菌類群功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，3組樣品的上呼吸道中均存在動(dòng)物病原菌富集及豐度增加，表明牛呼吸系統(tǒng)疾病存在致病性真菌感染的可能，為臨床治療提供了方向。

4 結(jié)論

本研究從患BRD牛鼻咽微生物出發(fā)，分析了鼻咽微生物中細(xì)菌、真菌的群落組成、相對(duì)豐度及功能預(yù)測(cè)。鑒定出牛鼻咽部致病性細(xì)菌，如：牛支原體、巴氏桿菌、曼氏桿菌、金黃桿菌及不動(dòng)桿菌；致病性真菌，如：曲霉菌屬、假絲酵母屬和克柔菌屬，說(shuō)明患呼吸系統(tǒng)疾病牛鼻咽微生物菌落組成豐富，且包含多種致病性微生物。