梅慧芬, 李秀珍, 林云婷, 徐愛(ài)晶, 盛慧英, 尹曦, 程靜, 張文, 饒敏, 梁翠麗, 劉麗

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心遺傳與內(nèi)分泌科(廣東廣州 510623)

新生兒糖尿病(neonatal diabetes mellitus，NDM)指出生后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)的持續(xù)性高血糖癥，通常需要胰島素治療。國(guó)外報(bào)道其在活產(chǎn)嬰兒中的發(fā)病率為1∶89 000～260 000[1-4]。根據(jù)疾病轉(zhuǎn)歸不同，臨床上分為兩種亞型：短暫性新生兒糖尿病(temporary neonatal diabetes mellitus, TNDM)和永久性新生兒糖尿病(permanent neonatal diabetes mellitus, PNDM)[5]。PNDM患者終生需要藥物治療，占NDM 大約50%～60%的TNDM在治療幾個(gè)月后會(huì)緩解，但常在青春期復(fù)發(fā)。NDM是一種遺傳異質(zhì)性疾病，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)20多種致病基因與NDM的發(fā)病有關(guān)。不同遺傳學(xué)類型NDM臨床表現(xiàn)有很大差異，治療方案及其預(yù)后也不同。比如大部分ATP敏感性鉀離子(KATP)通道基因突變所致的NDM可以應(yīng)用口服磺酰脲類藥物治療，而胰島素(insulin，INS)基因突變者終身需要胰島素注射等[5]。本研究總結(jié)48例NDM患兒的臨床特征，并對(duì)相關(guān)致病基因進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究，探討相關(guān)遺傳發(fā)病機(jī)制，為患兒制定個(gè)體化治療方案并對(duì)家系提供遺傳咨詢。

1 資料與方法

1.1 一般資料 48例均為2007年2月至2019年1月于我院收治的NDM患兒。男32例，女16例，初診年齡2～170 d。首發(fā)癥狀為多飲多尿32例，精神差25例，脫水并氣促15例，無(wú)明顯癥狀常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)高血糖17例。2例患兒父母親一方有糖尿病，1例患兒母親有妊娠期糖尿病，其余無(wú)糖尿病家族史。NDM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]：(1)生后6個(gè)月內(nèi)發(fā)?。?2)符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)病程大于2個(gè)月；(4)排除應(yīng)激性高血糖、醫(yī)源性或其他原因的高血糖癥。符合以上4條可診斷為NDM。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并由患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 入院后抽血分別檢測(cè)血葡萄糖、血?dú)夥治?、電解質(zhì)；糖化血紅蛋白(采用乳膠免疫凝集抑制法，德國(guó)西門(mén)子公司試劑盒)；同時(shí)做血胰島素、C肽、游離三碘甲腺原氨酸、游離甲狀腺素、促甲狀腺激素、皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素(采用化學(xué)發(fā)光法，德國(guó)西門(mén)子公司試劑)；胰島素抗體、谷氨酸脫羧酶抗體、胰島細(xì)胞抗體(采用免疫印跡法，深圳市亞輝龍生物科技有限公司試劑盒)；胰腺影像學(xué)檢查(超聲或核磁共振)等。

1.3 治療及隨訪 除3例血糖輕度升高的患兒，其他患兒在診斷時(shí)應(yīng)用胰島素治療，當(dāng)糖尿病酮癥酸中毒緩解并且血糖穩(wěn)定后，開(kāi)始給予口服磺脲類降糖藥格列本脲(上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H31020795)進(jìn)行試驗(yàn)性替代胰島素治療。起始劑量每天0.2 mg/kg，分3次，根據(jù)血糖水平酌情加量，格列本脲劑量增加的幅度為每天0.1～0.2 mg/kg，胰島素逐漸減量，如果格列本脲增加至每天1.0 mg/kg，胰島素仍不能減量，判定為對(duì)格列本脲無(wú)反應(yīng)，遂停用格列本脲，繼續(xù)胰島素治療。由于格列本脲治療NDM為超說(shuō)明書(shū)用藥，所有父母均簽署了知情同意書(shū)。

臨床隨訪時(shí)間為出院后1個(gè)月，之后每3～6個(gè)月隨訪1次，本研究隨訪至2020年12月。每次就診時(shí)測(cè)量身高和體重，對(duì)精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)懷疑有發(fā)育遲緩的患者進(jìn)行進(jìn)一步的Gesell發(fā)育量表評(píng)估。每次復(fù)診時(shí)檢測(cè)糖化血紅蛋白，并進(jìn)行腎功能、肝功能檢查。根據(jù)檢查結(jié)果及患兒的自我指尖血糖監(jiān)測(cè)結(jié)果調(diào)整格列本脲或胰島素的劑量。

1.4 分子遺傳學(xué)分析 經(jīng)家長(zhǎng)知情同意后，留取患兒血液標(biāo)本，采用PCR-DNA直接測(cè)序法進(jìn)行KCNJ11、ABCC8、INS和葡萄糖激酶(GCK)基因全部外顯子及相鄰內(nèi)含子測(cè)序分析，檢測(cè)到變異后與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)及千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，明確是否為新變異或多態(tài)性。對(duì)新錯(cuò)義變異進(jìn)行變異位點(diǎn)氨基酸10種不同物種間保守性分析，并進(jìn)行SIFT、PolyPhen-2軟件分析預(yù)測(cè)其致病性。

對(duì)經(jīng)過(guò)上面方法未檢出KCNJ11、ABCC8、INS和GCK基因突變的患兒，應(yīng)用甲基化特異性的多重連接依賴的探針擴(kuò)增(MS-MLPA)方法檢測(cè)染色體 6q24區(qū)域異常。對(duì)檢出異常的患兒使用CytoScan 750k陣列(Affymetrix Inc.，Santa Clara, California)進(jìn)行染色體微陣列分析(CMA)進(jìn)行確認(rèn)。按照規(guī)范的方法進(jìn)行DNA消化、擴(kuò)增、分割、標(biāo)記和雜交，結(jié)果用染色體分析套件軟件(Affymetrix Inc.)進(jìn)行分析。

最后，對(duì)經(jīng)過(guò)上述檢測(cè)方法未發(fā)現(xiàn)分子遺傳學(xué)異常的陰性樣品進(jìn)行二代測(cè)序全外顯子檢測(cè)，由諾禾致源基因檢測(cè)公司完成，具體方法參照我們報(bào)道的文獻(xiàn)[8]。

對(duì)于檢測(cè)到分子遺傳學(xué)異常的患兒，父母的DNA樣本被進(jìn)一步分析以確認(rèn)其遺傳性。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn) 48例患兒(包括1對(duì)雙胞胎)來(lái)自47個(gè)沒(méi)有血緣關(guān)系的家庭，父母均非近親結(jié)婚。48例中有1例胰島細(xì)胞抗體陽(yáng)性，5個(gè)月大起病時(shí)被當(dāng)?shù)卣`診為1型糖尿病，5歲時(shí)因?yàn)榫襁\(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、癲癇來(lái)我院就診。除此例患兒外，所有患兒均在4個(gè)月齡大前確診。在發(fā)病時(shí)5例患兒有貧血；5例有精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩；2例有先天性喉喘鳴，2例有皮膚血管瘤；2例有特殊面容；2例有巨舌；分別伴有房間隔缺損、室間隔缺損或臍疝各1例。

48例患兒中有30例(62.5%)為PNDM，18(37.5%)為T(mén)NDM。PNDM和TNDM的臨床特點(diǎn)見(jiàn)表1～2，兩種類型NDM在男女比例、孕齡、出生體重和起病時(shí)的血糖方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然而，與PNDM相比，TNDM起病的時(shí)間更早(P=0.015)，TNDM發(fā)病時(shí)糖尿病酮癥酸中毒(diabetes ketoacidosis,DKA)發(fā)生率較低(P=0.03)。TNDM緩解年齡2.5～10個(gè)月,隨訪時(shí)間2.7～12.2年，其中4例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)年齡4.5～8歲。

表1 PNDM 與TNDM臨床特點(diǎn)比較

表2 分子遺傳學(xué)結(jié)果 例

2.2 分子遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果 48例中有41例(85.4%)明確了NDM的分子遺傳學(xué)病因(表3～5)，其中有25例(50.0%)、3例(6.3%)、2例(4.2%)、3例(6.3%)、8例(16.7%)分別檢出KCNJ11、ABCC8、INS、GCK及染色體異常(其中染色體 6q24區(qū)域異常6例)。1例ABCC8復(fù)合雜合突變(p.Gly251Glu，p.Ile467Phe)及1例KCNJ11雜合突變(p.Ala18Gly)為新發(fā)突變。

表3 48例NDM患兒的臨床特點(diǎn)

在30例PNDM病例中，KCNJ11基因突變是最常見(jiàn)的原因,占70.0%，其中5例 p.Arg201His(R201H)突變，5例p.Val59Met(V59M)突變,4例p.Arg201Cys(R201C)突變，2例p.Cys42Arg(C42R)突變，其他類型突變各1例，另外有3例檢出GCK基因突變，2例檢出INS基因突變，1例為6q24染色體異常，1例為染色體17p13.3微重復(fù)。尚有2例未檢出分子遺傳學(xué)異常。

在18例TNDM中，4例KCNJ11基因突變所致，3例ABCC8基因突變所致，5例染色體6q24異常，1例檢出染色體1p36.23p36.12微缺失。尚有5例未檢出分子遺傳學(xué)異常。

2.3 治療及隨診 48例患兒中有41例嘗試從胰島素過(guò)渡到口服格列本脲治療，其中28例(28/41，69%)成功轉(zhuǎn)用格列本脲單藥治療，且血糖更加平穩(wěn)，低血糖發(fā)生率也顯著減少。停用胰島素時(shí)格列本脲的劑量為0.3～0.8 mg/(kg·d)，平均(0.54±0.19)mg/(kg·d)。41例患兒試用格列苯脲過(guò)程中有6例發(fā)生短暫喂養(yǎng)不良，2例出現(xiàn)短暫性腹瀉。28例格列本脲治療有效的NDM患兒中，有8例在3～10個(gè)月時(shí)血糖正常，其余20例患兒需要長(zhǎng)期服用格列本脲至今，隨訪1.8～8.6年，平均(5.6±4.3)年，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)(如牙齒發(fā)黃、胃腸道不良反應(yīng)、腎功能和肝功能障礙等)。除1例KCNJ11突變(p.V64M)患兒血糖及糖化血糖偏高，在1歲左右需要聯(lián)合應(yīng)用小劑量胰島素外，其他19例患兒只用格列本脲治療，血糖水平及糖化血紅蛋白水平均接近正常，目前格列本脲的維持劑量為0.2～0.4 mg/(kg·d)，平均(0.30±0.07) mg/(kg·d)，末次糖化血紅蛋白為5.2%～6.2%，平均(5.82±0.25)%。這28例格列本脲治療治療有效的NDM患兒的基因突變類型詳見(jiàn)表4。

表4 41例NDM患兒分子遺傳學(xué)結(jié)果

48例患兒隨訪至2020年12月，6例KCNJ11基因突變患兒有輕度精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩(5例V59M突變，1例V64M突變)，1例染色體 1p36.23p36.12微缺失患兒有中度精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，1例GCK基因突變患兒診斷為家族性矮小癥。

3 討論

目前NDM的分型是基于臨床隨訪期間的病情是否緩解分為PNDM和TNDM，隨診至18個(gè)月大時(shí)，血糖正常、糖化血紅蛋白正常且無(wú)需胰島素或口服降糖藥物治療可診斷為T(mén)NDM；如果仍然需要胰島素或口服降糖藥來(lái)維持正常血糖者為PNDM[9-10]。TNDM與PNDM在發(fā)病初期難以區(qū)分。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道研究超過(guò)一半以上的NDM為PNDM[11]。本研究48例患兒中，62.5%(30/48)是PNDM，PNDM與TNDM在出生體重、起病時(shí)血糖平均水平無(wú)明顯差異，但TNDM發(fā)病年齡更早(P=0.015)，DKA發(fā)病率更低(P=0.03)。TNDM緩解年齡2.5～8個(gè)月，其中4例出現(xiàn)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)年齡4.5～8歲。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道大多數(shù)TNDM在兒童晚期或者青春期會(huì)持續(xù)糖耐量受損或者是糖尿病復(fù)發(fā)。糖尿病復(fù)發(fā)原因尚不清楚，可能與青春期胰島素抵抗有關(guān)的。本研究中4例患兒復(fù)發(fā)年齡較文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)偏早，其原因有待進(jìn)一步研究。

NDM是單基因遺傳變異導(dǎo)致的特殊類型糖尿病，明確分子遺傳學(xué)診斷使精準(zhǔn)治療成為可能，并且有助于評(píng)估預(yù)后及對(duì)家族進(jìn)行遺傳咨詢。PNDM的病因較為多樣化，近年來(lái)國(guó)外研究顯示半數(shù)以上的PNDM由編碼胰島β細(xì)胞KATP通道的內(nèi)向整流6.2 (inwardly rectifying potassium channels，Kir6.2)亞單位和磺脲類受體1(sulfonylurea receptor 1，SUR1)亞單位的KCNJ11和ABCC8基因突變所致，其他致病基因有INS基因突變、GCK基因突變等。染色體6q24區(qū)域異常是TNDM的主要病因，目前已發(fā)現(xiàn)的6號(hào)染色體異常包括以下3種情況[12]：(1)6號(hào)染色體的父源性單親二倍體(paternal uniparental disomy of chromosome 6，UPD6)，已經(jīng)證實(shí)與散發(fā)的TNDM發(fā)病相關(guān)。(2)父源性6號(hào)染色體長(zhǎng)臂的部分復(fù)制，當(dāng)家系中出現(xiàn)這種不平衡復(fù)制時(shí)，僅有來(lái)自父親的異常復(fù)制才會(huì)發(fā)病，提示這一缺陷可能存在于印跡區(qū)。(3)少數(shù)患兒是由于染色體6q24關(guān)鍵基因片段的甲基化缺失。KATP通道基因突變是導(dǎo)致TNDM的第二大原因，其余類型TNDM臨床少見(jiàn)。

表5 染色體異常檢測(cè)結(jié)果

本研究48例NDM中有41例(85.4%)檢測(cè)到分子遺傳學(xué)異常，其中KCNJ11(60.9%)和ABCC8(7.3%)突變最為常見(jiàn)。6q24染色體異常(12.2%)是另一常見(jiàn)的病因。我們的發(fā)現(xiàn)與日本和歐洲國(guó)家的研究結(jié)果相似[1,6,13]。在30例PNDM病例中，KCNJ11基因突變是最常見(jiàn)的原因(占70.0%)。其中5例 R201H突變, 5例V59M突變, 4例 R201C突變，2例C42R突變，其他類型突變各1例，均為已經(jīng)報(bào)道的致病突變。國(guó)外研究顯示KCNJ11基因變異引起的NDM表型與基因突變位點(diǎn)相關(guān)，位于Kir6.2亞基ATP結(jié)合區(qū)域的變異多表現(xiàn)為單純的NDM；而遠(yuǎn)離ATP結(jié)合區(qū)域位點(diǎn)的變異出現(xiàn)DEND綜合征(包括發(fā)育遲緩、癲癇、NDM)或部分性DEND綜合征，有發(fā)育遲緩和NDM，但無(wú)癲癇。目前報(bào)道有出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的基因型包括V59M、R201C、G53D、R50P、R50G、C166Y、I167L、G344等，其中以V59M突變最為常見(jiàn)[13]。本研究5例V59M突變NDM中，4例為部分性DEND綜合征，1例為DEND綜合征；另外1例V64M突變患兒為部分性DEND綜合征；其他類型突變患兒未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常臨床表型。最近有研究[14]發(fā)現(xiàn)少數(shù)KCNJ11基因變異引起的NDM患兒會(huì)出現(xiàn)發(fā)育性共濟(jì)障礙如視覺(jué)空間障礙、注意力缺陷多動(dòng)障礙等，本組患兒中未觀察到類似的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，估計(jì)與年齡尚小有關(guān)，有待進(jìn)一步觀察。6q24染色體異常通常導(dǎo)致TNDM，但本研究中1例6q24染色體異常患兒為PNDM，提示對(duì)PNDM患兒也有必要進(jìn)行染色體6q24異常相關(guān)檢查。與PNDM發(fā)病相關(guān)的其他基因包括GCK基因及INS基因等，INS基因突變所致的患兒起病年齡往往較晚，大部分患兒6個(gè)月后才發(fā)病。

在18例TNDM中，KCNJ11(4/18)和ABCC8(3/18)基因突變是主要原因，約占TNDM的38.9%。6q24染色體的遺傳異常占27.8%(5/18)，而在歐美人群中，6q24染色體異常是TNDM最常見(jiàn)的原因[15]。鑒于KCNJ11在NDM中的高突變率和高度相關(guān)基因型和表型，建議在NDM患兒中首先篩查KCNJ11突變，然后篩查ABCC8或其他與特定臨床表現(xiàn)相關(guān)的基因。當(dāng)然，有條件者可以直接行二代測(cè)序檢查。

KATP通道是調(diào)節(jié)胰島素分泌的關(guān)鍵因素，在生理情況下，血糖升高后，葡萄糖被轉(zhuǎn)運(yùn)至胰島β細(xì)胞，在GCK等關(guān)鍵酶作用下經(jīng)過(guò)三羧酸循環(huán)，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度升高，刺激Kir6.2通道關(guān)閉，細(xì)胞膜去極化，胞膜上電壓依賴性Ca2+通道開(kāi)放，Ca2+內(nèi)流，從而引起胰島素分泌。當(dāng)編碼胰島β細(xì)胞KATP通道的亞單位Kir6.2或SURl亞單位的KCNJ11基因和ABCC8基因發(fā)生雜合子激活突變時(shí)，KATP通道與細(xì)胞內(nèi)ATP親和力下降，在葡萄糖刺激下無(wú)法正常關(guān)閉，從而導(dǎo)致B細(xì)胞內(nèi)胰島素?zé)o法正常釋放。文獻(xiàn)報(bào)道90%以上KCNJ11基因突變及85%以上ABCC8基因突變所致的NDM均可從胰島素治療轉(zhuǎn)變到磺酰脲類藥物治療。磺脲類降糖藥物可以直接作用于SUR1，使KATP通道關(guān)閉，從而使胰島素得以正常釋放；同時(shí)，由于SUR廣泛分布于神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等胰腺外組織，磺脲類藥物對(duì)基因缺陷所導(dǎo)致的其他伴隨癥狀如精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、癲癇等也有明顯的改善作用。另外研究報(bào)道磺脲類降糖藥物對(duì)部分6q24染色體異常NDM也有效果[16]。

本研究41例NDM中，有69%患兒能成功轉(zhuǎn)用格列本脲，且葡萄糖更穩(wěn)定，低血糖發(fā)生率也更少。有趣的是，本研究中有1例1p36缺失綜合征患兒在49 d時(shí)應(yīng)用格列本脲治療反應(yīng)良好，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究中格列本脲的維持劑量<0.5 mg/(kg·d)。長(zhǎng)期隨訪沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，一些可能與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)是輕度喂養(yǎng)困難或短暫性腹瀉，所有患者均未因不良反應(yīng)而停止治療，體格發(fā)育與同齡兒相仿。我們的研究結(jié)果顯示磺酰脲類藥物治療NDM是安全有效的，與國(guó)外研究一致，提示磺酰脲類藥物是治療NDM的一種有效方法。此外，早期磺酰脲類藥物治療可以改善神經(jīng)發(fā)育障礙。本研究5例伴有精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩患兒早期應(yīng)用格列本脲治療，不但血糖控制更理想，同時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀均有改善。因此，磺脲類降糖藥物比外源性胰島素注射更加符合這類NDM患者的生理需要。

磺酰脲類藥物轉(zhuǎn)化成功與否與KATP通道突變類型的有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)KCNJ11 基因70多種不同的突變，均為雜合突變，其中R201H、V59M 為熱點(diǎn)突變，可用磺脲類藥物替換胰島素治療的患兒的突變位點(diǎn)主要為R201H、V59M、R201C、F35V、H46Y、R50Q、G53N、G53R和K170T等，而仍然需要依賴胰島素治療者突變位點(diǎn)為Q52R、L164P 和I296L等[17]。本研究中24例KCNJ11突變的患兒試用格列本脲替換胰島素治療，23例(95.8%)成功停用了胰島素，僅1例C42R突變患兒格列苯脲治療(診斷年齡115 d，合并DKA，轉(zhuǎn)換時(shí)年齡125 d)無(wú)效，但另1例攜帶同樣突變的患兒(診斷年齡4 d，無(wú)合并DKA，轉(zhuǎn)換時(shí)年齡18 d)僅需要小劑量格列苯脲治療，血糖就接近正常，提示磺酰脲類藥物轉(zhuǎn)化成功與否還受其他因素的影響。國(guó)外研究顯示年齡越小、病程越短的患兒轉(zhuǎn)用磺酰脲類藥物的成功率越高[18]。較早開(kāi)始使用磺酰脲類藥物治療的患兒對(duì)磺酰脲類藥物的更敏感，也可能導(dǎo)致較低的維持劑量[19-20]。隨著年齡的增長(zhǎng)或糖尿病病程的延長(zhǎng)，對(duì)磺酰脲類藥物的敏感性下降，可能是由于使用胰島素治療的患者隨著時(shí)間的推移，胰島β細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。本研究41例患兒嘗試了應(yīng)用格列本脲替換胰島素治療，其中28例(69%)成功停用了胰島素，血糖水平更加穩(wěn)定。目前格列本脲的維持治療平均劑量為(0.3±0.07) mg/(kg·d)，與Bowman等[21]的研究相接近。與注射胰島素相比，口服格列本脲可以降低醫(yī)療成本，使血糖水平更穩(wěn)定。此外，口服藥物可以避免注射的痛苦，提高家庭生活質(zhì)量。

綜上所述，本研究顯示大部分(85.4%)NDM患兒檢測(cè)到分子遺傳學(xué)異常，其中KCNJ11和ABCC8突變最為常見(jiàn)，6q24染色體異常是另一常見(jiàn)的病因；早期使用格列本脲治療是安全有效的。