賈艷艷,徐建明,吳傳萬,顧大路,楊文飛,杜小鳳,王偉中,諸 俊*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 長江下游平原農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實驗室,江蘇 南京 210014;2.江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室(淮陰師范學(xué)院),江蘇 淮安 223300;3.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 淮安 223001)

磷是作物生長必不可少的營養(yǎng)元素之一。植物體需要的磷主要從土壤磷庫中獲得。我國自19世紀(jì)70年代開始便向土壤中施入較多的磷肥,然而磷肥在農(nóng)田土壤中的利用率極低。研究顯示,當(dāng)季施用的磷肥大部分與Ca2+、Fe3+、Al3+等結(jié)合成難溶性磷酸鹽滯留在土壤中,僅8%～20%的磷被植物根系吸收利用[1,2]。因此土壤中已積累了大量的磷資源;這些磷多以無效態(tài)固定于土壤中而不能被作物吸收利用。這不僅造成了巨大的資源浪費(fèi),而且導(dǎo)致了嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)面源污染。

施入土壤后磷肥被快速固化為作物根系無法吸收的化合物是當(dāng)季農(nóng)田磷肥利用率低的主要原因[3]。微生物是土壤元素轉(zhuǎn)化、吸收的中心，它們既是土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者,又是植物營養(yǎng)元素的活性庫,具有轉(zhuǎn)化有機(jī)質(zhì)、分解礦物和降解有毒物質(zhì)的作用[4,5]。植物根際土壤酸度變化、有機(jī)酸分泌和磷酸酶釋放等均有利于活化和利用土壤中的磷素資源[6,7]。大量研究表明,土壤中部分溶磷細(xì)菌和解磷真菌能夠分泌胞外磷酸酶和有機(jī)酸類來催化難溶性磷酸鹽溶解,從而可以提高植物根系表面原生磷的可獲得性[6,8]。從植物根際土壤篩選得到的溶磷微生物主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌。雖然溶磷真菌的數(shù)量和種類遠(yuǎn)少于溶磷細(xì)菌,但其溶磷能力普遍高于溶磷細(xì)菌,并具有較強(qiáng)的溶磷遺傳穩(wěn)定性[9,10]。目前已研究報道的溶解難溶無機(jī)磷能力較強(qiáng)的真菌主要有曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)真菌[11]。

隨著納米科技的快速發(fā)展,納米材料在農(nóng)作物養(yǎng)分吸收方面的應(yīng)用研究也越來越受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)納米氧化物顆粒作為輔酶因子,能刺激根際微生物酶的分泌,改變植物根際磷的利用率[12,13]。譬如在干旱條件下納米ZnO改良劑能夠促進(jìn)高粱對土壤磷素的吸收,從而提高高粱的產(chǎn)量[14];在小麥幼苗期施用納米CuO和ZnO顆粒,能夠刺激小麥根毛增殖和側(cè)根形成,增加根系對氮、磷等養(yǎng)分的吸收[15]。Raliya等[13](2016)研究顯示作物綠豆施用納米ZnO后根系土壤磷酸酶、植酸酶的活性顯著增加,綠豆的磷素吸收量增加了10.8%。此外，在溶磷真菌與納米TiO2共同作用下綠豆根際微生物數(shù)量以及與磷素循環(huán)相關(guān)的土壤胞外酶的活性均顯著提高,綠豆的葉蛋白、葉綠素含量等物候?qū)W指標(biāo)也得到改善[16]。目前納米顆粒對水稻根系吸收磷素的改善作用還缺乏深入研究。

本試驗選取納米ZnO和納米TiO2兩種典型金屬氧化物納米材料為研究對象,以實驗室常用的兩種曲霉屬溶磷真菌為試驗菌株,通過培養(yǎng)基培養(yǎng)和盆栽方法研究了不同濃度、不同粒徑納米ZnO、納米TiO2與溶磷真菌共同作用對培養(yǎng)基濾液有效磷含量、水稻生物量、土壤磷酸酶活性和土壤磷素含量的影響,旨在為稻田土壤磷素的轉(zhuǎn)化和可利用率的提高提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及納米材料

本試驗所用納米ZnO為30、200 nm兩種粒徑材料,納米TiO2為15、30 nm兩種粒徑材料,均購于阿拉丁試劑有限公司(含量≥ 99.5%)。試驗用菌株為煙曲霉AspergillusfumigatusL. 和黃曲霉AspergillusflavusL.,購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。使用PDA培養(yǎng)基擴(kuò)繁菌株直至其產(chǎn)生孢子,制備成濃度為1×108CFU/mL的孢子菌懸液。

1.2 在納米顆粒影響下溶磷真菌對難溶性磷酸鹽的溶解能力試驗

試驗采用難溶性磷酸鹽液體培養(yǎng)基:葡萄糖10 g、MgSO4·7H2O 10.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、(NH4)2SO40.5 g、難溶性磷酸鹽5 g、1 L蒸餾水,調(diào)整pH值為6.0～6.2,在121 ℃下濕熱滅菌30 min,分裝到錐形瓶中備用。在上述培養(yǎng)基中難溶性磷酸鹽為等量的磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鋅和磷酸鐵的混合物。

納米顆粒添加試驗共設(shè)置10、100、500 mg/L三種濃度,以不添加納米顆粒為對照,總計13個處理(3種濃度處理×4種納米粒徑處理+1個無納米顆粒對照)：無納米顆粒對照CK-0；30 nm粒徑納米ZnO 10、100、500 mg/L處理(納米ZnO 30-10、30-100、30-500)；200 nm粒徑納米ZnO 10、100、500 mg/L處理(納米ZnO 200-10、200-100、200-500)；15 nm粒徑納米TiO210、100、500 mg/L處理(納米TiO215-10、15-100、15-500)；30 nm粒徑納米TiO210、100、500 mg/L處理(納米TiO230-10、30-100、30-500)。將各個粒徑的納米ZnO和納米TiO2按照設(shè)置的濃度分別加入到裝有難溶性磷酸鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中,超聲波震蕩15 min，混勻。

分別取兩種菌株的部分孢子菌懸液,在121 ℃下濕熱滅菌30 min，制成滅活菌液。按照5%的接種量將煙曲霉A.fumigatus、黃曲霉A.flavus菌株的孢子懸液以及滅活菌液分別接入到含有不同粒徑、不同濃度納米顆粒的培養(yǎng)基中,同時設(shè)不接菌對照CK。每個處理4次重復(fù),所有處理在28 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d。在培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min,然后采用鉬銻抗比色法測定上清液中有效磷的含量。

1.3 在納米顆粒影響下真菌的土壤溶磷效果及促生效果試驗

試驗采取室內(nèi)盆栽的方法進(jìn)行,盆栽用土采集自江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高新科技園創(chuàng)新基地稻田(119°1′26.43″E,33°31′26.55″N)。土壤類型為沙壤土,土壤(0～20 cm)有機(jī)質(zhì)含量為12.78 g/kg,全氮含量為1.14 g/kg,有效磷含量為6.82 mg/kg, pH 6.9。將采集的土壤過2 mm篩,風(fēng)干后在121 ℃下濕熱滅菌2 h。所用塑料盆規(guī)格為20 cm口徑×25 cm高,每盆裝入5 kg滅菌土;將供試的難溶性磷酸鹽按照1 g/kg的用量與土充分混勻,難溶性磷酸鹽為等量的磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鋅和磷酸鐵的混合物。

根據(jù)1.2節(jié)的實驗結(jié)果篩選出最優(yōu)納米顆粒與菌株組合,設(shè)置空白對照、單獨(dú)接菌處理、單獨(dú)添加納米顆粒處理、接菌同時添加納米顆粒處理以及接滅活菌株同時添加納米顆粒處理,每個處理4次重復(fù)。按照10 mL/kg的用量將無菌水制備的菌株孢子懸液(1×108CFU/mL)均勻施加到盆栽土壤中,采用逐層添加法[17]進(jìn)行納米顆粒添加處理。供試水稻品種為‘水旱兩優(yōu)898’,在播種前使用10% H2O2表面消毒10 min,并用去離子水浸泡3 h,以每盆5粒的種子量進(jìn)行播種,在出苗后定苗1株。所有盆栽水稻植株在培養(yǎng)60 d后收獲,測量水稻地上和地下生物量。同時測定土樣中有效磷的含量和磷酸酶活性。磷酸酶單位酶活力(IU)定義為1 g土樣每小時分解產(chǎn)生1 mg P2O5所需的酶量[18]。

室內(nèi)實驗在江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所作調(diào)中心實驗室進(jìn)行,所用溶液和化學(xué)試劑均為國藥分析純。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析；在5%水平下用LSD Duncan法檢驗各處理平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 在納米ZnO影響下真菌的溶磷效果

表1數(shù)據(jù)顯示,總體來看,除了無納米顆粒對照CK-0外,在兩種接菌處理下難溶性磷酸鹽培養(yǎng)基濾液中有效磷含量均顯著高于接種滅活菌株處理;接種煙曲霉菌劑A.fumigatus處理的有效磷含量普遍大于接種黃曲霉菌劑A.flavus的。接種A.fumigatus時納米ZnO 30-10、200-10和200-100處理下濾液中有效磷含量均顯著大于CK-0和CK的,而納米ZnO 30-500和200-500處理的則顯著低于CK-0的(P<0.05)。接種A.flavus時納米ZnO 30-10、30-100和200-10處理下濾液中有效磷含量均顯著大于CK-0和CK的;納米ZnO 30-500和200-500處理下的有效磷含量均顯著低于CK-0的。在納米ZnO 30-10+接種A.fumigatus處理下濾液中有效磷含量最高(180.37 mg/L),顯著高于其他處理組的,說明30 nm粒徑納米ZnO在10 mg/kg濃度添加下與菌株A.fumigatus一起培養(yǎng)時產(chǎn)生的有效磷量最多。

表1 接種菌劑和納米ZnO添加處理下難溶性磷酸鹽培養(yǎng)基濾液中有效磷含量 mg/L

2.2 在納米TiO2影響下真菌的溶磷效果

從表2可以看出：在添加納米TiO2影響下，接種兩種菌劑處理的培養(yǎng)基濾液中有效磷含量顯著高于相對應(yīng)的接種滅活菌株處理和CK的,說明兩種菌劑的溶磷效果較好；在添加納米TiO2影響下，接種黃曲霉菌劑A.flavus處理的有效磷含量普遍大于接種煙曲霉菌劑A.fumigatus的,說明納米TiO2與A.flavus組合培養(yǎng)的溶磷效果較好；在接種A.fumigatus時，納米TiO2僅在30-100處理時濾液有效磷含量顯著大于CK-0的；在接種A.flavus時,納米TiO215-100和30-100處理下濾液中有效磷含量均顯著大于CK-0和CK的,其中15-100處理組的有效磷含量最高,達(dá)到142.19 mg/L,顯著高于其他處理組的(P<0.05)。

表2 接種菌劑和納米TiO2添加處理下難溶性磷酸鹽培養(yǎng)基濾液中有效磷含量 mg/L

2.3 接種菌劑和添加納米顆粒對土壤磷酸酶活性、土壤有效磷含量和水稻生物量的影響

土壤磷酸酶的主要功能是水解有機(jī)質(zhì)中的磷脂鍵,從而將無機(jī)磷酸鹽從有機(jī)質(zhì)中水解釋放到土壤中,其活性高低直接影響土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性。由表3可知：納米ZnO 30-10+A.fumigatus處理和單獨(dú)接種A.fumigatus處理中土壤磷酸酶的活性顯著高于CK和納米ZnO 30-10處理的；與CK相比,納米ZnO 30-10+A.fumigatus處理的土壤有效磷含量和磷酸酶活性分別顯著增加了35.83%、35.47%；接種A.fumigatus處理以及納米ZnO 30-10+A.fumigatus處理的土壤磷酸酶活性均顯著高于對照的；但盆栽水稻的地上生物量在各個處理之間無顯著差異;與CK相比,在納米ZnO 30-10+A.fumigatus處理下水稻的地下生物量顯著增加了52.32%。說明以10 mg/kg的劑量添加30 nm粒徑的納米ZnO配合接種菌劑A.fumigatus可以提高土壤磷酸酶的活性,從而增加盆栽水稻的地下生物量。

表3 接種菌劑和添加納米ZnO處理下土壤有效磷含量、磷酸酶活性和水稻生物量

3 討論與結(jié)論

近年來，納米顆粒在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用越來越多,已有多種工程納米顆粒被用于農(nóng)藥、殺蟲劑以及農(nóng)業(yè)新型肥料[19-21]。本試驗研究了將30、200 nm粒徑納米ZnO和15、30 nm粒徑納米TiO2以10、100和500 mg/kg的劑量添加到培養(yǎng)基中對黃曲霉和煙曲霉溶磷效果的影響，發(fā)現(xiàn)納米ZnO在10 mg/kg、TiO2在100 mg/kg濃度下能夠顯著促進(jìn)兩種曲霉屬真菌的溶磷效果；其中添加10 mg/kg 30 nm粒徑的納米ZnO+接種A.fumigatus處理的溶磷效果最好,盆栽水稻土壤中的磷酸酶活性增加了35.47%。據(jù)Raliya等[13](2016)報道，對作物綠豆施用10 mg/L納米ZnO后，根系土壤磷酸酶活性提高了84%,綠豆的磷素吸收量增加了10.8%；該團(tuán)隊推測,納米顆粒能夠促進(jìn)根系對磷素的吸收,可能是因為納米氧化物顆粒作為輔酶因子刺激了與作物根系周圍磷素反應(yīng)相關(guān)的微生物分解酶的分泌,將土壤中復(fù)雜形式的磷分解成植物能吸收的形式[13,16]。Zahra等研究了納米TiO2對生菜、水稻和小麥根際土壤磷素的影響，指出：除了作為輔酶因子外,金屬納米顆粒對磷離子的吸附作用也可引起磷化作用的改變;根際納米顆粒的適應(yīng)力可能也對增強(qiáng)根系溶磷酶的分泌和酸化有促進(jìn)作用;所有這些變化都導(dǎo)致了植物根系磷素的可用性和根系吸收磷素能力的提高[12,22-25]?？梢娎媒饘偌{米顆粒作為輔助劑有望提高作物根系對土壤磷素的吸收與利用。因此納米ZnO、納米TiO2等金屬納米顆粒與水稻根際溶磷微生物、土壤溶磷酶活性以及土壤磷素轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系值得深入探討。

Itroutwar等[26](2019)報道了生物ZnO納米粒子能夠改善水稻的外部形態(tài)特征。尹勇等[27](2019)的研究顯示500 mg/kg納米ZnO處理后水稻幼苗的鮮重、干重和株高分別增加了24.95%、12.42%和9.71%。Yang等[28](2015)的研究表明納米ZnO的植物毒性作用表現(xiàn)為濃度依賴性,其2000 mg/L的濃度能夠顯著抑制玉米和水稻根系的伸長。本研究發(fā)現(xiàn)30 nm粒徑納米ZnO在10 mg/kg濃度下顯著促進(jìn)了水稻地下生物量,在500 mg/kg濃度下對真菌生長產(chǎn)生了抑制作用,顯著降低了培養(yǎng)基中有效磷的含量。多項研究數(shù)據(jù)顯示，金屬納米顆粒進(jìn)入環(huán)境后會受其中各種固相和液相成分的影響而發(fā)生氧化還原等反應(yīng),其溶解性、沉降性等特性會發(fā)生變化,其持久性、反應(yīng)活性以及毒性效應(yīng)從而會改變[29]。土壤環(huán)境中的pH強(qiáng)度、離子強(qiáng)度、有機(jī)質(zhì)組成及含量、粘土含量及礦物質(zhì)(P、K、Mg、S)均會對納米顆粒的環(huán)境行為造成影響[17,30,31]。因此,隨著應(yīng)用與產(chǎn)量的日益增多,在納米科技合理農(nóng)用的同時,納米顆粒的環(huán)境暴露與生態(tài)風(fēng)險問題也不容忽視。

綜上所述,納米ZnO在10 mg/kg濃度水平與煙曲霉菌株A.fumigatus一起施用,可促進(jìn)土壤磷酸酶活性,提高盆栽水稻地下生物量。我們下一步的研究擬將納米顆粒與溶磷真菌應(yīng)用于水稻磷肥減施方向,在保障納米顆粒環(huán)境安全的同時調(diào)節(jié)磷肥的使用量。