龐 賽，龐發(fā)根，江 坤，李玉蘭，王鐵杰

(深圳市藥品檢驗研究院，深圳市藥品質量標準研究重點實驗室，深圳 518057)

歐洲藥品質量管理局(EDQM)是目前全球最權威的實驗室能力驗證機構之一，對實驗室獨立完成檢測的能力有較高的要求。測量不確定度是表征賦予被測量值分散性的非負參數，一個完整的定量分析結果應包含測量值和測量不確定度2個指標[1-2]。近年來，不確定度在藥物分析領域中的應用越來越廣泛[3-8]，如今在EDQM的能力驗證中，組織方亦要求參與者報告測定結果的不確定度值，讓能力驗證的參與者能夠將自己的不確定度估計值與其他實驗室的估計值進行比較。因此，測量不確定度的評定逐漸引起了廣大藥物分析人員的重視。正確表達和評定測量方法的測量不確定度將逐步成為國際通用的要求。

阿司匹林為非甾體抗炎藥，主要的治療功效是解熱、鎮(zhèn)痛、抗風濕、抑制血小板聚集等作用。該品種在各國藥典中均有收載，對羥基苯甲酸為《歐洲藥典》[9]阿司匹林標準中的特定雜質A。本研究為本實驗室在參加EDQM液相色譜法能力驗證中以《歐洲藥典》阿司匹林標準項下收載的方法對雜質對羥基苯甲酸的含量進行測定，參考相關資料并結合EDQM測量不確定度評定的核心文件[10]，對《歐洲藥典》阿司匹林中的對羥基苯甲酸測定的不確定度進行了分析，以期為有效控制對羥基苯甲酸測定方法的準確性，以及對今后各實驗室參加EDQM能力驗證時評定不確定度提供參考。

1 藥品與試劑

對羥基苯甲酸對照品(由EDQM能力驗證組織方提供，含量為100.0%)；乙腈為色譜級；磷酸為分析級；超純水為實驗室自制。

安捷倫1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；XS205DU電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司)；10 ml量瓶(A級)、25 ml量瓶(A級)、100 ml量瓶(A級)、1 ml單標移液管(A級)。

2 實驗方法

測定方法：依據《歐洲藥典》10.0版阿司匹林有關物質項下雜質A的測定方法及EDQM能力驗證文件ProficiencyTestingSchemeonLiquidChromatography(PTS208)[11]。

色譜條件：采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，以磷酸-乙腈-水(2∶400∶600)為流動相，檢測器為紫外檢測器，檢測波長237 nm，進樣量為10 μl，流速為1.0 ml/min。

對照品溶液配制：取對羥基苯甲酸對照品約 50 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.00 ml該溶液至100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液配制：取阿司匹林供試品約0.1 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。

樣品測定：取對照品溶液、供試品溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀并測定峰面積，按外標法計算對羥基苯甲酸的含量。

3 測量模型的建立

按公式計算對羥基苯甲酸含量：

則：

其中，X為供試品中對羥基苯甲酸含量(%)；CT為供試品濃度(mg/ml)；CS為對照品濃度(mg/ml)；WT為供試品的取樣量(g)；WS為對照品的取樣量(g)；AT為供試品溶液色譜圖中對羥基苯甲酸的峰面積；AS為對照品溶液的主峰面積；VT為供試品的稀釋體積(ml)；VS為對照品的稀釋體積(ml)；ωS為對照品的含量(%)。

實際上X的測得值是3份平行試樣的測定數據給出的，重復性標準不確定度不可忽略。應加入重復性修正量R，其值視為零，不確定度非零。加入后公式變?yōu)椋?/p>

X′=X+R

其中，X′為考慮重復性修正量R后的實際含量(%)；X為供試品含量(%)；R為重復性修正量(%)。

4 不確定度來源分析

不確定度來源用因果圖表示，見圖1～圖3。

圖1 X的不確定度來源因果圖

圖2 VS的不確定度來源因果圖

圖3 加入重復性后的不確定度來源因果圖

5 評定對羥基苯甲酸含量的標準不確定度[u(X)]

5.1 評定對照品稱量的相對標準不確定度[urel(WS)]

5.1.1評定u(WS)

u(WS)由天平示值誤差的不確定度u1(WS)和天平稱量重復性的不確定度u2(WS)合成，均屬于B類測量不確定度。

故：

①u1(WS)：對照品稱量約為50 mg，查天平(XS205DU)檢定證書，所用電子天平(d=0.01 mg)的最大允差為±0.05 mg，認為矩形分布：

②u2(WS)：稱量對照品所用天平的檢定證書給出的重復性誤差為0.01 mg，認為矩形分布：

則單次稱量的標準不確定度：

實際實驗過程使用減重法，故不確定度為：

5.1.2評定urel(WS)

對照品稱樣量分別為0.050 10和0.049 85 g，則相對標準不確定度：

=1.177×10-3(mg)

5.2 評定供試品稱量的相對標準不確定度[urel(WT)]

5.2.1評定u(WT)

u(WT)由天平示值誤差的不確定度u1(WT)和天平稱量重復性的不確定度u2(WT)合成，均屬于B類測量不確定度。

故：

①u1(WT)：供試品稱量約為0.1 g，查天平(XS205DU)檢定證書，所用電子天平(d=0.01 mg)的最大允差為±0.05 mg，認為矩形分布：

②u2(WT)：稱量對照品所用天平的檢定證書給出的重復性誤差為0.01 mg，認為矩形分布：

則單次稱量的標準不確定度：

實際實驗過程使用減重法，故不確定度為：

5.2.2評定urel(WT)

對照品稱樣量分別為0.099 51、0.100 20和0.099 70 g，則相對標準不確定度：

urel(WT)=0.722×10-3(mg)

5.3 評定對照品峰面積的相對標準不確定度[urel(AS)]

對照品峰面積的相對標準不確定度主要來源為進樣重復性，屬A類不確定度，取2份對照品溶液分別連續(xù)進樣3次，對照品峰面積測定結果見表1，用極差法計算對照品峰面積的標準不確定度。

表1 對照品峰面積測定結果

=0.494×10-3

=0.383×10-3

則對照品峰面積的相對標準不確定度：

5.4 評定供試品峰面積的相對標準不確定度[urel(AT)]

2份供試品溶液分別連續(xù)進樣2次，峰面積測定結果見表2，用極差法計算供試品峰面積的標準不確定度。

表2 供試品峰面積測定結果

=2.546×10-3

=2.157×10-3

=1.453×10-3

則供試品峰面積的相對標準不確定度：

=3.639×10-3

5.5 評定對照品稀釋體積的相對標準不確定度[urel(VS)]

對照品溶液稀釋過程的不確定度由25 ml量瓶引入的不確定度u(VS1)和100 ml量瓶引入的不確定度u(VS3)、1 ml單標移液管引入的不確定度u(VS2)合成，分別計算每一步稀釋過程引入的不確定度。

采用相對標準不確定度計算：

5.5.1評定urel(VS1)

u(VS1)由25 ml量瓶最大允差引起的標準不確定度u1(VS1)和溫度效應引入的標準不確定度u2(VS1)合成。

①u1(VS1)：在初始溶解對照品時，用到25 ml量瓶，查量瓶檢定規(guī)程JJF196—2006《常用玻璃量器》，使用的25 ml量瓶最大允許誤差絕對值為0.03 ml，歷年檢定結果顯示誤差均較小，視為三角分布：

②u2(VS1)：實驗在控溫環(huán)境下進行，室溫控制在(20±5) ℃,水的體積膨脹系數為0.000 21/℃，按操作描述得初步定容體積為25 ml。因此控溫范圍產生的體積增量半寬分別為25×0.000 21×5=0.026 25(ml)。因為計算結果時不做溫度體積修正，此處將體積變化作為不確定度處理，溫度導致的體積變化為矩形分布，則其標準不確定度為：

合成得到：

則：

5.5.2評定urel(VS2)

u(VS2)由1 ml單標移液管最大允差引起的標準不確定度u1(VS2)和溫度效應引入的標準不確定度u2(VS2)合成。

①u1(VS2)：對照品兩步稀釋時，用到1 ml單標移液管，查檢定規(guī)程JJF196—2006《常用玻璃量器》，使用的A級1 ml單標移液管最大允許誤差絕對值為0.007 ml，歷年檢定結果顯示誤差均較小，視為三角分布:

②u2(VS2)：實驗在控溫環(huán)境下進行，室溫控制在(20±5) ℃,水的體積膨脹系數為0.000 21/℃，按操作描述吸液體積為1 ml。因此,控溫范圍產生的體積增量半寬分別為1×0.000 21×5=0.001 05(ml)。因為計算結果時不做溫度體積修正，此處將體積變化作為不確定度處理，溫度導致的體積變化為矩形分布，則其標準不確定度為：

合成得到：

=2.914×10-3(ml)

則：

=2.914×10-3(ml)

5.5.3評定urel(VS3)

u(VS3)由100 ml量瓶最大允差引起的標準不確定度u1(VS3)和溫度效應引入的標準不確定度u2(VS3)合成。

①u1(VS3)：對照品第2步稀釋時，用到100 ml量瓶，查量瓶檢定規(guī)程JJF196—2006《常用玻璃量器》，使用的100 ml量瓶最大允許誤差絕對值為0.10 ml，歷年檢定結果顯示誤差均較小，視為三角分布：

②u2(VS3)：實驗在控溫環(huán)境下進行，室溫控制在(20±5)℃,水的體積膨脹系數為0.000 21/℃，按操作描述得初步定容體積為100 ml。因此,控溫范圍產生的體積增量半寬分別為100×0.000 21×5=0.1050(ml)。因為計算結果時不做溫度體積修正，此處將體積變化作為不確定度處理，溫度導致的體積變化為矩形分布，則其標準不確定度為：

合成得到：

則：

對照品溶液稀釋的相對標準不確定度：

=3.104×10-3(ml)

5.6 評定供試品稀釋體積的相對標準不確定度[urel(VT)]

u(VT)由10 ml量瓶最大允差引起的標準不確定度u1(VT)和溫度效應引入的標準不確定度u2(VT)合成。故：

①u1(VT)：溶解供試品時用到10 ml量瓶，查量瓶檢定證書及根據檢定規(guī)程JJF196—2006《常用玻璃量器》，使用的10 ml量瓶最大允許誤差絕對值為0.020 ml，視為三角分布：

②u2(VT)：實驗在控溫環(huán)境下進行，室溫控制在(20±5) ℃，與20 ℃的溫差導致的溶液體積膨脹大于量瓶的體積膨脹，可只考慮溶液的體積膨脹。水的體積膨脹系數為0.000 21/℃，按操作描述定容體積為10 ml。因此控溫范圍產生的體積增量半寬分別為10×0.000 21×5=0.010 50(ml)。因為計算結果時不做溫度體積修正，此處將體積變化作為不確定度處理，假設溫度導致的體積變化為矩形分布，則其標準不確定度為：

合成得到

則：

5.7 評定對照品含量的相對標準不確定度[urel(ωS)]

對羥基苯甲酸對照品(EDQM，含量：100.0%)無相關的不確定度信息，且實驗室目前無同類具有不確定度信息的對照品替代，故忽略urel(ωS)。

5.8 對羥基苯甲酸含量的標準不確定度u(X)

對羥基苯甲酸含量的相對標準不確定度：

實驗測得對羥基苯甲酸含量為3份平行樣的平均值，X=0.250%

故：

u(X)=urel(X)×X=5.120×10-3×0.250%=0.001 28%

6 評定重復性的標準不確定度[u(R)]

重復測定3份平行樣，測定結果見表3。

表3 重復性結果 %

用貝塞爾公式計算標準差：

規(guī)程中要求測定3份平行樣，則：

7 計算合成標準不確定度

合成標準不確定度，見公式：

8 報告測量結果

阿司匹林供試品中對羥基苯甲酸含量結果為：(0.250±0.002)%，第2項為標準不確定度(非擴展不確定度)。不確定度一覽表見表4。

表4 不確定度評定一覽表

不確定度A類評定：用對觀測列進行統(tǒng)計分析的方法來評定標準不確定度；不確定度B類評定：用不同于對觀測列進行統(tǒng)計分析的方法來評定標準不確定度

9 討論

測量不確定度評定應盡可能分析測量不確定度的所有可能來源，本文通過參考EDQM測量不確定度評定核心文件，對《歐洲藥典》[9]收載的阿司匹林標準中對羥基苯甲酸測定過程中的不確定度各分量來源進行分析，建立了測定阿司匹林中對羥基苯甲酸的不確定度評定方法，可為同分析方法的不確定度評定提供參考。

由表4可知，本研究不確定度分量中，對結果影響最大的分量為測量重復性。因此，在整個實驗過程中應注重分析人員平行操作的重要性，在雙份樣品或多份樣品測定時，應將測量結果的相對標準偏差控制在要求的范圍內，以保證數據的準確性和可靠性。提示可通過以下途徑降低不確定度，提高檢驗結果的準確性和可靠性:① 定期對液相色譜儀進行性能確認，加強日常維護保養(yǎng)，確保儀器始終處于穩(wěn)定的工作狀態(tài)并具有良好的進樣精密度。② 在分析過程中，溶液稀釋過程應使用經校準合格的容量儀器，合理控制實驗環(huán)境溫度。③ 稱量應選用經性能確認合格的天平，且天平精度符合使用要求。④ 實驗人員在整個測定過程中應注意標準操作，避免引起不必要的誤差，使測定結果更加準確可靠。