石雅馨，王 新，張乘源，張緒丹，劉 雙，王雁飛，師 偉

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 濟(jì)南250014）

子宮腺肌病（adenomyosis，AMs）是指子宮肌層內(nèi)出現(xiàn)具有活性的子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）的一類雌激素依賴性的疾病[1-2]。甲狀腺結(jié)節(jié)（thyroid nodule，TN）是指甲狀腺局部細(xì)胞異常增生所引起的組織結(jié)構(gòu)團(tuán)塊狀病變[3]，一般認(rèn)為其發(fā)病多與碘攝入量、自身免疫因素、激素水平密切相關(guān)[4]，且有良惡性之分。乳腺結(jié)節(jié)（breast nodule，BN）目前為止尚無準(zhǔn)確的定義，臨床主要分為乳腺良性結(jié)節(jié)與乳腺惡性腫瘤，多通過超聲影像學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)[5]。此三種疾病雖分屬不同器官的不同疾病，但均受下丘腦-垂體-腺體軸的調(diào)控，為內(nèi)分泌的靶器官。西醫(yī)發(fā)病機(jī)制為內(nèi)分泌紊亂、雌激素水平過高等因素導(dǎo)致腺體局部細(xì)胞異常增生而致組織結(jié)構(gòu)紊亂[6-7]。且有研究證明，甲狀腺、乳腺、子宮疾病發(fā)病過程有明確相關(guān)性[8]。目前西醫(yī)治療較單一且療效差強(qiáng)人意，手術(shù)治療是唯一的根治方法。

從中醫(yī)角度而言，此三種病雖分屬“癥瘕”、“乳癖”、“癭瘤”等不同疾病，其病異而本同也，如《圣濟(jì)總錄》云“癥瘕結(jié)癖者，積聚之異名也。證狀不一，原其根本，大略相類”。根據(jù)經(jīng)絡(luò)循行部位及疾病病機(jī)特點(diǎn)，可將其歸為任脈癥瘕類病。任脈起于胞宮，循腹由下而上貫穿子宮、甲狀腺、乳腺各器官。任脈瘀滯，互結(jié)于經(jīng)絡(luò)，積而成癥，聚而成瘕則易產(chǎn)生癥瘕類疾病。中醫(yī)辨證論治對此類疾病治療有較好的成效，故從“異病同治”角度出發(fā)，將其歸為一類，運(yùn)用經(jīng)方桂枝茯苓丸進(jìn)行論治可為臨床提供新思路。

桂枝茯苓丸是《金匱要略》經(jīng)典名方，有通脈化癥、緩消瘀結(jié)的作用。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，桂枝茯苓丸可緩解子宮腺肌病患者痛經(jīng)程度，降低雌激素水平[9]，亦可發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及雌激素等作用治療甲狀腺結(jié)節(jié)和乳腺結(jié)節(jié)[10]。本課題組前期對子宮腺肌病病機(jī)與治療已進(jìn)行深入挖掘與研究，在臨床及實(shí)驗(yàn)方面證明桂枝茯苓丸治療子宮腺肌病的有效性，數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果顯示，赤芍、桃仁、茯苓在子宮腺肌病治療中出現(xiàn)頻次最高[11]，動物實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)有治療效果。且已有研究證明子宮、乳腺、甲狀腺發(fā)病有明顯相關(guān)性，為了進(jìn)一步佐證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，拓寬課題研究思路，探索疾病之間共同機(jī)制及桂枝茯苓丸在“異病同治”過程中所發(fā)揮的分子生物學(xué)作用，故進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供初步證據(jù)與發(fā)掘?qū)颉?/p>

1 方法

1.1 桂枝茯苓丸有效作用成分的篩選及靶點(diǎn)的獲取

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）對桂枝茯苓丸中5味中藥桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，并根據(jù)成分藥物代謝動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行選擇，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和 類 藥 性（Drug-Likeness，DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，初步獲得有效作用成分及蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。之后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）對相關(guān)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范。

1.2 有效成分-疾病共有靶點(diǎn)的獲取

在GenCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org)、DrugBank（https://www.drugbank.com）數(shù)據(jù)庫中以“adenomyosis”、“thyroid nodule”、“breast nodule”為關(guān)鍵詞獲取AMs、TN、BN相關(guān)疾病靶點(diǎn)，并通過韋恩圖獲取中藥在任脈癥瘕類病“異病同治”過程中的所存在的共有數(shù)據(jù)庫。

1.3 復(fù)方網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將桂枝茯苓丸方中中藥、有效成分、靶點(diǎn)上傳至Cytoscape3.7.2，利用Merge功能將其合并，最終繪制成復(fù)方網(wǎng)絡(luò)圖。

將有效成分-疾病共有靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），物種選擇為“人類”，下載靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2進(jìn)行蛋白質(zhì)間相互作用分析（Protein-Protein Interaction，PPI）。

1.4 生物學(xué)及通路富集分析

運(yùn)用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫對共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體功能富集（Gene Ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics，KEGG）通路富集分析，并對結(jié)果根據(jù)P值進(jìn)行排序，以備后續(xù)處理。

為了深入研究通路關(guān)鍵靶標(biāo)在桂枝茯苓丸“異病同治”任脈癥瘕類疾病中發(fā)揮的作用，選取通路關(guān)鍵靶 標(biāo)，通 過BioGPS（http://biogps.org/）、Genecards、DisGENET數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)組織、亞細(xì)胞分布及蛋白歸屬信息。

1.5 分子對接

選取桂枝茯苓丸中度值（Degree）排名前十的有效成分與Degree值≥中位數(shù)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。從TCMSP中下載配體的mol2結(jié)構(gòu)，經(jīng)Autodock Tools處理后，保存為pdbqt結(jié)構(gòu)；從RCSB中獲取受體3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)Discovery Studio去除水分子、分離配體、受體后，利用Autodock Tools進(jìn)行加氫，并計(jì)算結(jié)合位點(diǎn)，將受體另存為pdbqt文件。通過Autodock Vina進(jìn)行對接模擬運(yùn)算（PDB ID及對接相關(guān)參數(shù)見表1），根據(jù)對接后得到的配體-受體最低結(jié)合能，構(gòu)建熱圖并分析相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)及氨基酸殘基相互作用力。

表1 受體蛋白PDB ID及對接相關(guān)參數(shù)表

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸有效作用成分的篩選及靶點(diǎn)的獲取

初步提取，桂枝茯苓丸有效成分共494個(gè)，其中桂枝220個(gè)，茯苓34個(gè)，赤芍119個(gè)，牡丹皮55個(gè)，桃仁66個(gè)。經(jīng)過篩選后，共獲得化合物有效成分85個(gè)，相關(guān)靶點(diǎn)102個(gè)。對有效成分進(jìn)行歸納梳理發(fā)現(xiàn)，常春藤素（hederagenin）為茯苓、桃仁共有活性成分，(+)-兒茶素[(+)-catechin]、谷甾醇（sitosterol）為桂枝、牡丹皮、赤芍的共有活性成分，分布范圍廣泛，且出現(xiàn)頻次較高。預(yù)測其可能對任脈癥瘕類病的治療發(fā)揮較大的作用，可對下一步深入細(xì)化研究提供方向。

2.2 有效成分-疾病共有靶點(diǎn)的獲取

通過對AMs、TN、BN的疾病基因進(jìn)行檢索，分別獲得AMs疾病靶點(diǎn)291個(gè)，TN靶點(diǎn)2564個(gè)，BN靶點(diǎn)2828個(gè)，將上述疾病靶點(diǎn)與桂枝茯苓丸102個(gè)作用靶點(diǎn)取交集并構(gòu)建韋恩圖，最終獲取桂枝茯苓丸治療AMs、TN、BN的共有靶點(diǎn)為24個(gè)（圖1）。

圖1 桂枝茯苓丸治療子宮腺肌病、甲狀腺結(jié)節(jié)、乳腺結(jié)節(jié)共有靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 復(fù)方網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分

利用Cytoscape3.7.2軟件對桂枝茯苓丸5味中藥，有效成分及其靶點(diǎn)進(jìn)行處理，構(gòu)建桂枝茯苓丸復(fù)方網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。151個(gè)節(jié)點(diǎn)通過386條邊相連接，其中，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表5味中藥，綠色節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，其余不同顏色代表不同藥物的有效成分。可以看出，桂枝茯苓丸有效成分及作用靶點(diǎn)在分子生物學(xué)層面存在多層次、多維度交叉對應(yīng)關(guān)系，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。其中桂枝茯苓丸中關(guān)鍵有效成分黃芩素（baicalein，degree=38）、鞣花酸（ellagic acid，degree=21）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，degree=36）、(+)-兒茶素[(+)-catechin，degree=15]、豆 甾 醇（Stigmasterol，degree=28）等主要通過環(huán)加氧酶2（PTGS2，degree=20）、雌激素受體（ESR1，degree=6）等共有關(guān)鍵靶點(diǎn)對AMs、TN、BN發(fā)揮“異病同治”作用。

圖2 桂枝茯苓丸中藥-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

通過STRING和Cytoscape3.7.2構(gòu)建共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3A）。由24個(gè)節(jié)點(diǎn)，175條邊組成，平均節(jié)點(diǎn)度值（average node degree）是14.6，平均中心聚類系數(shù)（avg.local clustering coefficient）為0.815，中位 數(shù)（median）為17。篩選degree≥17的靶點(diǎn)有12個(gè)（圖3B），分別為：TP53、AKT1、VEGFA、IL6、MMP9、TNF、PTGS2、MMP2、CXCL8、ESR1、TGFB1、HIF1A。由此分析，這12個(gè)靶點(diǎn)為此網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)，可能在桂枝茯苓丸干預(yù)AMs、TN、BN過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)條形圖

2.4 生物學(xué)及通路富集分析

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫對共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，主要包含生物過程（Biological Process，BP）、細(xì)胞組成（Cellular Component，CC）、分 子 功 能（MolecularFunction，MF），并按P值進(jìn)行排序（圖4）。結(jié)果顯示，桂枝茯苓丸治療AMs、TN、BN過程中，主要集中在凋亡過程的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、機(jī)體免疫反應(yīng)及平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)等生物過程中；主要包含細(xì)胞、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等細(xì)胞組成。此外，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇激素受體活性等分子功能亦參與其中。

圖4 桂枝茯苓丸治療子宮腺肌病、甲狀腺結(jié)節(jié)、乳腺結(jié)節(jié)GO富集分析

為了研究桂枝茯苓丸在干預(yù)AMs、TN、BN過程中通路發(fā)揮的關(guān)鍵作用，故進(jìn)行KEGG分析。結(jié)果顯示，72條信號通路參與桂枝茯苓丸對任脈癥瘕類疾病的調(diào)控中，根據(jù)P值大小，選取前20位信號通路進(jìn)行可視化分析（圖5）。結(jié)果顯示，Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）等與桂枝茯苓丸治療AMs、TN、BN 的過程密切相關(guān)。

圖5 KEGG信號通路氣泡圖（TOP20）

2.5 通路關(guān)鍵靶標(biāo)的獲取及其組織分布、亞細(xì)胞分布、蛋白歸屬信息

為了深入挖掘各通路中的關(guān)鍵靶標(biāo)及相關(guān)分布信息，根據(jù)P值對其進(jìn)行排序，保留前6條信號通路，即腫瘤信號通路（Pathways in cancer）、蛋白聚糖腫瘤（Proteoglycans in cancer）信號通路、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）等信號通路。通過STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape3.7.2對此6條通路的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，選取度值≥中位數(shù)且出現(xiàn)次數(shù)≥平均數(shù)的靶點(diǎn)為通路關(guān)鍵靶標(biāo)，共8個(gè)（表2）。結(jié)果顯示，這些靶標(biāo)可通過調(diào)控不同的信號通路對AMs、TN、BN發(fā)揮“異病同治”的作用。

表2 通路關(guān)鍵靶標(biāo)

將上述關(guān)鍵靶標(biāo)上傳至BioGPS數(shù)據(jù)庫獲取其在體內(nèi)組織分布情況，根據(jù)基因表達(dá)情況保留前5位組織分布信息。利用Cytoscape3.7.2進(jìn)行分析，獲取關(guān)鍵靶標(biāo)-組織分布信息網(wǎng)絡(luò)圖（圖6-A），并按照度值對其進(jìn)行排序。其中，紅色V型代表關(guān)鍵靶標(biāo)，綠色橢圓形代表組織分布，其中平滑?。⊿mooth Muscle，degree=2）、721-B淋巴細(xì)胞（721-B-lymphoblasts，degree=3）、CD33+髓細(xì)胞（CD33+Myeloid，degree=3）等器官組織在桂枝茯苓丸“異病同治”中意義重大，分析發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞、CD33+髓細(xì)胞度值排名靠前，故推測免疫細(xì)胞在提高機(jī)體免疫功能，治療此類疾病中發(fā)揮較大作用。此外，子宮（Uterus，degree=1），甲狀腺（Thyroid，degree=1）可能作為桂枝茯苓丸治療過程中的靶器官發(fā)揮“異病同治”作用。

通過Gnencards數(shù)據(jù)庫獲取其亞細(xì)胞分布相關(guān)信息，根據(jù)其confidence值進(jìn)行排序，將前五位的亞細(xì)胞分布信息上傳至Cytoscape3.7.2軟件繪制靶標(biāo)-亞細(xì)胞分布信息網(wǎng)絡(luò)圖（圖6-B），其中紅色V型代表關(guān)鍵靶標(biāo)，紫色橢圓形代表亞細(xì)胞分布信息。結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶標(biāo)多分布于細(xì)胞核（nucleus，degree=8）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，degree=5）、細(xì) 胞 骨 架（cytoskeleton，degree=5）、線 粒 體（mitochondrion，degree=5）等一系列重要的細(xì)胞器中。

圖6 關(guān)鍵靶標(biāo)-組織分布網(wǎng)絡(luò)圖（A）和關(guān)鍵靶標(biāo)-亞細(xì)胞分布網(wǎng)絡(luò)圖（B）

將關(guān)鍵靶標(biāo)上傳至DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取其蛋白歸屬信息（見表3），其主要涉及信號分子（Signaling）、轉(zhuǎn) 錄因子（Transcription factor）、激 酶（Kinase）、酶（Enzyme）等。

表3 關(guān)鍵靶標(biāo)-蛋白歸屬信息表

2.6 分子對接

為了深入探析桂枝茯苓丸干預(yù)AMs、TN、BN關(guān)鍵分子機(jī)制，篩選10個(gè)有效成分作為配體，12個(gè)靶點(diǎn)蛋白作為受體，對接結(jié)果如圖7所示。橫坐標(biāo)代表桂枝茯苓丸有效成分，縱坐標(biāo)代表靶點(diǎn)蛋白，顏色深淺代表結(jié)合能的大小。結(jié)果顯示，β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、豆甾醇等10個(gè)有效成分與IL-6、AKT1、TP53等12個(gè)靶點(diǎn)蛋白對接所得最低結(jié)合能均小于-5.0kJ·mol-1,其中，（+）-兒茶素、豆甾醇分別與基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix Metallo Proteinase 9，MMP9）、趨 化 因 子8（Interleukin-8，CXCL8）結(jié)合能力較優(yōu)。

圖7 有效成分與靶點(diǎn)蛋白分子對接最低結(jié)合能熱圖

根據(jù)分子對接最低結(jié)合能篩選出結(jié)合能力較優(yōu)的前三組蛋白，如圖8所示。其中，（+）-兒茶素通過Ala417、Leu397、Glu402、Ala189氨基酸殘基形成四條氫鍵，與MMP9緊密結(jié)合（圖8A）；豆甾醇通過Glu48氨基酸殘基形成1條氫鍵，β-谷甾醇通過Arg6、Cys7形成2條氫鍵，二者均與CXCL8結(jié)合較緊密（圖8B、8C）。由此看來，此三種化合物及兩種蛋白可能為桂枝茯苓丸“異病同治”中的關(guān)鍵化合物及核心靶點(diǎn)蛋白，也為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

圖8 桂枝茯苓丸關(guān)鍵化合物與核心靶點(diǎn)蛋白分子對接圖

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，AMs、TN、BN雖分別屬于“癥瘕”、“乳癖”、“癭瘤”等不同疾病，但其病位及病機(jī)均有極大關(guān)聯(lián)性與相似性，任脈阻瘀貫穿其發(fā)病始終，故在中醫(yī)學(xué)上可將其歸納為任脈癥瘕類病進(jìn)行“異病同治”研究。古籍記載桂枝茯苓丸多用于婦人癥病的治療，但其溫通經(jīng)脈，治血兼治水之功，亦可用于經(jīng)脈不通，任脈瘀阻所導(dǎo)致的癥瘕類病。方中桂枝、茯苓相配溫經(jīng)脈、滲痰濕，桃仁配丹皮，消癥結(jié)，涼血瘀，寓通因通用之意，赤芍調(diào)營陰，緩急痛，全方共奏通脈化癥、緩消瘀結(jié)之功。藥理研究表明，桂枝茯苓丸有調(diào)節(jié)免疫功能及抗炎的功效，其可能與促進(jìn)腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）的分泌，活化自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）有關(guān)，除此之外，桂枝茯苓丸可降低體內(nèi)雌激素，具有雌激素樣活性[12]。桂枝茯苓配伍可降低血液中前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）、TNF-α的含量，提高小鼠胸腺及脾臟重量，提高免疫能力[13]，對任脈癥瘕類病有一定治療作用。

通過前期對桂枝茯苓丸“異病同治”AMs、TN、BN有效化合物進(jìn)行篩選并用分子對接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)（+）-兒茶素、豆甾醇在桂枝茯苓丸中分布范圍最廣，且分子對接中分別與CXCL8、MMP9結(jié)合最緊密，黃芩素、β-谷甾醇degree值較高，提示可能在桂枝茯苓丸治療AMs、TN、BN中發(fā)揮較大作用。（+）-兒茶素屬于酚類活性物質(zhì)，可通過多種途徑發(fā)揮不同藥理作用，可與體內(nèi)雌激素受體結(jié)合[14]，從而發(fā)揮抗雌激素作用，通過降低體內(nèi)VEGF生成從而抑制子宮內(nèi)膜異位病灶的生長[15]。豆甾醇通過增加體內(nèi)IL-2及γ-干擾素（INF-γ）的含量，活化NK細(xì)胞，增強(qiáng)免疫功能，可應(yīng)用于AMs、TN、BN的治療[16]。黃芩素為黃酮類化合物，有抗炎、抗腫瘤等作用，可通過PI3K/AKT通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]，亦可上調(diào)CD4+、CD8+表達(dá)而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，對于乳腺、甲狀腺惡性結(jié)節(jié)有較好的抑制作用[18]。β-谷甾醇能提高血清IgM和IgB的含量，優(yōu)化免疫系統(tǒng)，改善甲狀腺功能[19]。

桂枝茯苓丸治療AMs、TN、BN過程中主要涉及AKT1、VEGFA、IL6、MMP9、TNF、CXCL8、ESR1、TGFB1等靶點(diǎn)蛋白，與炎癥、腫瘤、免疫、雌激素等密切相關(guān)，其中CXCL8、MMP9為分子對接中結(jié)合最優(yōu)的活性靶點(diǎn)蛋白。CXCL8作為趨化因子，參與細(xì)胞黏附、侵襲過程，通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）表達(dá)和血管生成，促進(jìn)AMs異位細(xì)胞、乳腺癌、甲狀腺癌的侵襲遷移[20-22]。MMP9在促進(jìn)血管生成及病灶黏附過程中發(fā)揮重要作用，研究表明[23]，對于子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞，桂枝茯苓丸能阻止其血管再生及異位病灶黏附，抑制體內(nèi)MMP9及血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）水平，也可通過旁分泌刺激甲狀腺內(nèi)VEGF受體的增加進(jìn)而促進(jìn)血管的生成。蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1 or PKB）參與調(diào)控細(xì)胞增殖侵襲、細(xì)胞

分化及組織纖維化的過程，主要通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）結(jié)合成纖維細(xì)胞膜上受體，激活PI3K/Akt通路，進(jìn)而磷酸化激活A(yù)KT因子來完成[24]。已有研究證明[25]，TGF-β1與子宮腺肌病異位病灶纖維化及甲狀腺結(jié)節(jié)、乳腺結(jié)節(jié)密切相關(guān)。雌激素受體α（Estrogen Receptor 1，ESR1）主要發(fā)揮調(diào)節(jié)雌激素的作用，在AMs、TN、BN中表達(dá)增高[26]，桂枝茯苓丸通過降低其受體水平，達(dá)到抑制乳腺上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增生的作用。本研究對于桂枝茯苓丸治療AMs、TN、BN過程中有效化合物及靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行篩選分析，發(fā)現(xiàn)干預(yù)過程通過多靶點(diǎn)、多角度發(fā)揮作用，由此推測，此三種疾病發(fā)病機(jī)理及藥物作用靶點(diǎn)具有較大一致性，且文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，部分結(jié)果已通過實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證，對臨床有一定指導(dǎo)作用，但仍有部分基因有待于深入分析研究。

通過GO和KEGG富集分析得知桂枝茯苓丸通過多途徑、多通路發(fā)揮多種治療作用。結(jié)合分析結(jié)果及文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，桂枝茯苓丸發(fā)揮治療作用與Pathways in cancer、Toll樣受體、TNF、雌激素等信號通路關(guān)系較密切，其主要涉及腫瘤、炎癥因子、免疫調(diào)控、雌激素等不同環(huán)節(jié)。Toll樣受體大多存在于機(jī)體免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞表面，通過識別并結(jié)合病原微生物等，誘發(fā)免疫應(yīng)答[27]，也參與子AMs、TN、BN發(fā)展過程中[28]。TNF信號通路主要參與AMs、TN、BN的免疫、炎癥反應(yīng)的過程[29-31]，文獻(xiàn)表明，桂枝茯苓丸分泌TNF-α可促進(jìn)集落刺激因子及NK細(xì)胞的活化，以治療免疫、內(nèi)分泌失調(diào)所致的任脈癥瘕類疾病[12]。桂枝茯苓丸對于體內(nèi)雌激素異常所致的此類疾病中具有類雌激素作用[12,32]。為進(jìn)一步預(yù)測桂枝茯苓丸作用的主要組織及器官，通過BioGPS分析發(fā)現(xiàn)，共有關(guān)鍵靶點(diǎn)主要存在于平滑肌、淋巴細(xì)胞、甲狀腺、子宮等組織器官中，這可能與AMs、TN、BN發(fā)病過程中炎癥免疫反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖及組織器官纖維化密切相關(guān)。AMs常表現(xiàn)為子宮局部組織纖維化、肌層回聲欠均及子宮腺肌瘤。這一過程多由于增生的內(nèi)膜向肌層侵入，形成內(nèi)膜-肌層結(jié)合帶，進(jìn)而使局部平滑肌細(xì)胞增殖而形成[7]，BN形成的過程多有組織纖維化的形成，且缺氧環(huán)境可加速膠原纖維的沉積[33]。分析發(fā)現(xiàn)，桂枝茯苓丸通過多途徑、多通路發(fā)揮對AMs、TN、BN的治療，對進(jìn)一步分析研究有較深的指導(dǎo)意義，但由于通路篩選是根據(jù)所在通路靶點(diǎn)富集數(shù)目而定，故篩選的通路及關(guān)鍵靶點(diǎn)仍存在一定的不準(zhǔn)確性，其作用機(jī)制較為復(fù)雜，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本課題組前期已通過數(shù)據(jù)挖掘、藥效學(xué)研究、多維指紋圖譜及動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證桂枝茯苓丸有效成分通過減少VEGF、Caspase-3、Caspase-9、TNF-α等表達(dá)從而抑制血管生成、細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)，達(dá)到抗子宮腺肌病的目的[11,34]，一定程度佐證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的準(zhǔn)確性，并為下一步實(shí)驗(yàn)提供方向。且基于中醫(yī)理論及文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，AMs、TB、BN有極大關(guān)聯(lián)性，故推而廣之，試從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步探索桂枝茯苓丸對任脈癥瘕類病治療的機(jī)制與靶點(diǎn)，為TN、BN的治療探索新方向。然而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)由于數(shù)據(jù)庫的不完善性及欠缺相應(yīng)的基因數(shù)據(jù)庫，其在體內(nèi)的生物過程及作用通路仍尚不明確，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。但桂枝茯苓丸治療AMs、TN、BN過程中所篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)、信號通路及分子對接結(jié)果與發(fā)病機(jī)制及目前研究方向較為一致，主要包含炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、雌激素變化等多個(gè)過程，也證明了桂枝茯苓丸多成分、多靶點(diǎn)、多通路的治療作用，為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及中醫(yī)學(xué)“異病同治”更深層次的探討提供了參考。