孫稚穎，李強，田曉萌，郭慶梅，邵長倫

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院濟南250355；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院福州350122；3.中國海洋大學(xué)海洋藥物教育部重點實驗室/醫(yī)藥學(xué)院青島266003）

紅樹林是海灘上特有的森林類型，通常生長在港灣河口地區(qū)的淤泥質(zhì)灘涂上，為自然分布于亞熱帶和熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，周期性遭受海水浸淹。因長期處于陸地與海洋的動態(tài)交界面這樣一種特殊的環(huán)境中，而形成了在結(jié)構(gòu)和功能上具有海陸兩棲的生態(tài)特性，在自然生態(tài)平衡中具有特殊的作用。據(jù)報道，中國紅樹植物共有38種，其中真紅樹植物26-27種（含變種），半紅樹11-12種[1-2]。海桑屬植物是真紅樹植物。在《中國植物志》中[3]，海桑屬隸屬于海?？?，我國僅分布2種，即海桑Sonneratia caseolaris(L.)Engl.和杯萼海桑S.albaJ.Smith，而后經(jīng)相關(guān)學(xué)者研究修訂[4]，目前在《中國植物志》英文版（FOC）[5]中，海桑屬植物隸屬千屈菜科，我國包括6種，即海桑、無瓣海 桑S.apetalaBuch.-Ham.、海 南 海 桑Sonneratia×hainanensisW.C.Ko et al.、杯 萼 海 桑、擬 海 桑Sonneratia×gulngaiN.C.Duke & B.R.Jackes和卵葉海桑（桑海桑）S.ovataBacker，主要分布在海南島，其中無瓣海桑為引進栽培種，海南海桑為杯萼海桑與卵葉海桑的天然雜交種，而擬海桑為杯萼海桑與海桑的天然雜交種。

關(guān)于海桑屬植物，我國學(xué)者主要從木材結(jié)構(gòu)比較解剖[6]、木材結(jié)構(gòu)及其系統(tǒng)演化意義[7]、葉片的結(jié)構(gòu)及其生態(tài)適應(yīng)[8]、孢粉學(xué)[9]、形態(tài)解剖學(xué)[10]、分子標記[11-12]、遺傳多樣性[13-14]等方面做了一系列研究，充分表明植物的形態(tài)構(gòu)造是與它所生存的環(huán)境相適應(yīng)的，特殊的環(huán)境衍生出一些獨特的結(jié)構(gòu)。近些年隨著國家提出的“向海洋要藥”、“向海洋要健康”思潮的引領(lǐng)，為了更好的開發(fā)海洋藥用生物資源，有關(guān)紅樹類海桑屬植物的化學(xué)成分及生物活性[15-17]等方面研究也逐漸增加。

準確的物種鑒定是藥用植物資源開發(fā)的前提和保障。海桑屬植物形態(tài)特征隨環(huán)境變化較大，尤其是葉形，在不同生長環(huán)境及不同生長時期，往往表現(xiàn)出不同的形狀。海桑屬內(nèi)種間雜交種的出現(xiàn)更增加了物種識別的困難。如果沒有長期的野外經(jīng)驗，僅依靠形態(tài)特征往往不易識別[11]。DNA條形碼概念由加拿大分類學(xué)家Paul Hebert于2003年首次提出[18]，隨之受到各國科學(xué)家的關(guān)注，DNA條形碼不受生物個體形態(tài)特征、個體發(fā)育階段、外界環(huán)境等影響，能夠?qū)τ诜诸悓W(xué)中難以區(qū)分的類群,從基因水平上提供一種分類依據(jù)，因此成為近年來廣泛應(yīng)用于動植物分類鑒定研究中的有效手段。關(guān)于紅樹類植物的DNA條形碼研究，毛曉萌等[19]在中國植物學(xué)會85周年學(xué)術(shù)年會發(fā)表論文摘要對中國紅樹植物進行了DNA條形碼構(gòu)建，認為rbcL+ITS2是紅樹植物的條形碼的理想標記，而matK和trnH-psbA并不適用于紅樹植物，同時指出DNA條形碼在研究物種間雜交情況也有不可忽視的作用。陳怡君等[20]對6種紅樹林植物進行了ITS2條形碼鑒定，認為ITS2序列可準確有效地鑒別不同紅樹植物。Wu等[21-22]對中國廣東省紅樹植物進行了DNA條形碼研究，認為rbcL和trnH-psbA是進行紅樹植物物種鑒定的最合適DNA條形碼。Saddheet al[23]對印度西海岸果阿地區(qū)的14種紅樹植物進行了DNA條形碼研究，驗證了matK和rbcL作為DNA條形碼的鑒定能力，結(jié)果表明二者對除紅樹屬、海桑屬以及海欖雌屬植物以外的其他紅樹植物能夠很好區(qū)分。

目前基于DNA條形碼技術(shù)，針對我國分布的海桑屬所有物種的分子鑒定和親緣關(guān)系探討尚未見系統(tǒng)報道，本文依據(jù)《中華人民共和國藥典》2020版（第四部）[24]，并參照前人研究，選用葉綠體psbA-trnH基因間隔區(qū)和核ITS2序列為DNA條形碼，以采自中國南部的6種紅樹類海桑屬植物為研究對象，對其進行分子鑒定研究，以期為海桑屬植物的后續(xù)資源開發(fā)利用、育種及保護等相關(guān)研究提供重要參考依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物樣品

海桑屬植物來源見表1，均采自我國亞熱帶及熱帶紅樹林保護區(qū)，經(jīng)保護區(qū)科研人員準確鑒定后，拍照，單株取樣，每種3份，每份來自不同個體，采集幼嫩葉片，變色硅膠快速干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 材料來源

1.1.2 主要儀器

5424R離心機（德 國Eppendorf公 司）；T100 Themrmal Cycle熱循環(huán)儀（Bio-rad）；電子天平PL202-L（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；DYY-8C型電泳儀電源（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（BIORAD）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2（國華電器有限公司）；天寶（Trimble）Juno 3B手持GPS全球定位儀（Trimble導(dǎo)航公司）；佳能相機（80D）；ABI 3730XL測序儀等。

1.1.3 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒，TBE緩沖液，DL2000 marker，2×Taq PCR MasterMIX，GeneRed核酸染料均購自天根生物有限公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇、β-巰基乙醇、瓊脂糖（分析純）；ITS2片段（引物1：ITS2F；引物2：ITS3R）；psbA-trnH片段（引物1：psbAF；引物2：trnHR）（引物由上海生物工程有限公司合成）。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物DNA提取

海桑屬植物干燥樣品各稱取約20 mg，分別進行液氮研磨，利用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生物）提取總DNA，具體方法步驟參見試劑盒說明書。

1.2.2 PCR擴增及產(chǎn)物測序

核序列ITS2和葉綠體序列psbA-trnH擴增、測序正反向引物見表2，PCR反應(yīng)體積為25 μL，擴增體系和擴增條件參見文獻[25-26]。

表2 植物DNA條形碼通用引物序列

經(jīng)電泳檢測后的PCR擴增產(chǎn)物，直接送樣測序。由上海生工利用ABI3730XI測序儀進行雙向測序獲得相應(yīng)序列。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

測序獲得的峰圖使用CodonCode Aligner 4.2.1（CodonCode Co.,USA）軟件校對拼接，去除引物區(qū)。然后將ITS2序列使用基于隱馬爾科夫模型的HMMer注釋方法去除兩端的5.8S和28S區(qū)段以獲得ITS2間隔區(qū)序列，psbA-trnH序列參照GenBank相關(guān)物種序列切除兩端，獲取完整序列。將6種海桑屬植物測序獲得的兩種序列分別利用MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）6.0進行堿基序列比對及K2P遺傳距離分析，然后利用NJ（鄰接）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，bootstrap（1000次重復(fù)）檢驗各分支的支持率[27,28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

6種紅樹類海桑屬植物核ITS2序列編號同樣品編號（表1）；為便于區(qū)分，葉綠體psbA-trnH序列編號在各樣品編號前加數(shù)字，分別為1HS海桑、2WB無瓣海桑、3HN海南海桑、4BE杯萼海桑、5NH擬海桑、6LY卵葉海桑。

2.1.1 ITS2序列分析

所研究6種海桑屬植物ITS2序列長度均為229bp；GC含量在67.7-70.3%之間，各種種內(nèi)無差異，故序列比對中每種僅列1條代表序列進行種間比較，由圖1可見，6種海桑屬植物種間具有或多或少的堿基差異。其中海南海桑和杯萼海桑堿基差異很小，僅有2個位點不同，分別為68nt處的一堿基插入缺失，以及227 nt處的C-A顛換；擬海桑與海桑堿基差異也較小，只有3個穩(wěn)定的變異位點，分別為58 nt處的G-T顛換，77nt處的G-T顛換，以及220nt處的C-G顛換；卵葉海桑與無瓣海桑相比有6個位點的堿基差異?；贙2P雙參數(shù)模型計算遺傳距離，遺傳距離最小的是海南海桑與杯萼海桑，為0.004，遺傳距離最大的是卵葉海桑和海桑，為0.074。

圖1 ITS2序列比對

2.1.2psbA-trnH序列分析

參照GenBank，本研究樣品psbA-trnH序列長度為395-406 bp，GC含量在24.7-25.6%之間。經(jīng)序列比對后長度為406bp，各種種內(nèi)無差異，種間部分物種存有差異，6種紅樹類海桑屬植物種間的psbA-trnH序列比對見圖2。其中海南海桑、擬海桑和杯萼海桑堿基序列完全相同，無瓣海桑與卵葉海桑相比僅有3個位點的堿基差異，分別為271nt處的A-T顛換，337nt處的A-G轉(zhuǎn)換，以及365 nt處的一插入缺失?；贙2P雙參數(shù)模型計算遺傳距離，遺傳距離最小的是海南海桑、擬海桑和杯萼海桑，為0.000，遺傳距離最大的是卵葉海桑和海桑之間，遺傳距離為0.021。

圖2 psbA-trnH序列比對

2.2 聚類分析

2.2.1 ITS2聚類樹

基于ITS2序列，以6種紅樹類海桑屬植物為樣本，利用Mega6.0構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹中顯示，卵葉海桑和無瓣海桑聚為一支，海桑和擬海桑、杯萼海桑和海南海桑各聚為一支（圖3）。其中海桑與擬海桑之間的自展支持率為97%，杯萼海桑與海南海桑之間的自展支持率為100%。

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的中國6種紅樹類海桑屬植物的鄰接（NJ）樹

2.2.2psbA-trnH聚類樹

基于psbA-trnH序列，利用Mega6.0構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹顯示，海桑與其它海桑屬植物遺傳距離最遠，無瓣海桑和卵葉海桑聚為一支，自展支持率為90%，海南海桑、擬海桑和杯萼海桑聚為另一支，自展支持率為87%（圖4）。

圖4 基于psbA-trnH序列構(gòu)建的中國6種紅樹類海桑屬植物的鄰接（NJ）樹

3 討論

紅樹植物常年生長在特殊的海陸交匯邊緣環(huán)境中，由于土壤缺氧嚴重、日照時間長且紫外線強、鹽漬化程度高等特征促使紅樹植物為適應(yīng)環(huán)境也相應(yīng)的衍生出一套特殊的生物系統(tǒng)，該特點使紅樹植物產(chǎn)生了一些不同于陸生植物的特殊產(chǎn)物[16]。本研究對中國所分布的紅樹類海桑屬全部6種植物進行了考察、采集，根據(jù)文獻記載及走訪調(diào)查，發(fā)現(xiàn)民間有藥用記載的海桑屬植物主要為海桑和杯萼海桑。其中海桑的果實、葉和花可以作為內(nèi)科用藥，另外果實搗爛成糊狀，可治療扭傷。杯萼海桑的果實榨汁發(fā)酵，可用于止溢血[15]。目前，由于人們對海洋藥用生物資源的關(guān)注，無瓣海桑、卵葉海桑、擬海桑以及海南海桑中的化學(xué)成分也陸續(xù)被研究和報道。海桑屬植物次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型豐富多樣，主要包含脂肪酸類、酚酸類、黃酮類、萜類、甾醇類、生物堿類化合物等，其中有一部分化合物被發(fā)現(xiàn)具有良好的生物活性,如抗氧化、抗腫瘤、抑制病原菌等[16,17]，隨著對海桑屬植物的廣泛深入開發(fā)研究，相信該屬植物藥用價值將會進一步被挖掘。

關(guān)于海桑屬植物的分子鑒定研究，我國學(xué)者曾采用ISSR等分子標記技術(shù)進行了相關(guān)研究，研究表明，ISSR標記多態(tài)性強，具有特異型譜帶，能很好地區(qū)分海桑屬物種[11]，此外，海桑屬植物具有較豐富的遺傳多樣性[13]。而有關(guān)紅樹植物的DNA條形碼研究，目前可見報道的仍主要集中于DNA條形碼片段的篩選，涉及海桑屬植物僅一種或兩種[20-23]，毛曉萌等人[19]對中國紅樹植物DNA條形碼構(gòu)建研究摘要中提到包含我國所有紅樹植物物種，但未見其針對海桑屬植物的DNA條形碼鑒定的深入系統(tǒng)闡述與分析。為了更好地開發(fā)利用海桑屬植物藥用資源，本研究運用DNA條形碼技術(shù)對中國6種紅樹類海桑屬植物的ITS2和psbA-trnH序列進行了測定分析，研究表明，中國6種紅樹類海桑屬植物的ITS2序列長度約為229bp，psbA-trnH序列在395-406bp之間。6種海桑屬植物各具有其特有的ITS2序列，因每種種內(nèi)取樣均在一個保護區(qū)內(nèi)，所以種內(nèi)序列間堿基無差異，而6種海桑屬植物彼此間有或多或少的差異，因此可以相互區(qū)分開來；除海南海桑、擬海桑和杯萼海桑之外，其余海桑的葉綠體psbAtrnH序列彼此間也有堿基差異，可以相互鑒別?；贗TS2和psbA-trnH序列建立的鄰接（NJ）樹可以在一定程度上反映各種間的相互關(guān)系。如在ITS2的NJ樹圖中，海南海桑與杯萼海桑親緣關(guān)系很近，而海桑與擬海桑關(guān)系也很近。在葉綠體psbA-trnH序列比對中，杯萼海桑、擬海桑、海南海桑具有完全相同的序列，而海南海桑是杯萼海桑和卵葉海桑的自然雜交種，擬海桑是杯萼海桑和海桑的自然雜交種[29]，葉綠體序列是母系遺傳，因此推斷擬海桑與海南海桑具有相同的母本即杯萼海桑，這一關(guān)系在其系統(tǒng)進化樹上得以證明。此外，在傳統(tǒng)的分類學(xué)上，常常依據(jù)海桑屬植物花瓣的有無將其分為兩大類：杯萼海桑、海桑和擬海桑為有花瓣的一類，無瓣海桑、卵葉海桑和海南海桑則屬于無花瓣類型，而從本研究則可以推斷擬海桑遺傳了父本海桑、海南海桑遺傳了父本卵葉海桑的表型特征。

DNA條形碼是通過使用一段或幾段短的、標準DNA片段，對物種進行快速、準確識別和鑒定的技術(shù)，目前，已越來越廣泛地應(yīng)用于生物的物種鑒定、分類以及親緣關(guān)系探討。本研究中DNA條形碼核序列ITS2與葉綠體psbA-trnH基因間隔區(qū)片段表現(xiàn)了較好的物種鑒定能力，并能在一定程度上揭示出物種間的親緣關(guān)系，適用于中國6種紅樹類海桑屬植物物種鑒定，同時為該屬植物的資源開發(fā)利用、栽培、保護以及生物多樣性研究提供了重要參考資料。