楊玉雙，覃 碧，張繼川，張立群，聶秋海，劉實(shí)忠

（1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，海口 571101；2北京化工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100029；3北京玲瓏蒲公英科技發(fā)展有限公司，北京 101102）

0 引言

橡膠草(Taraxacum kok-saghyzRodin,TKS)為菊科(Asteraceae)蒲公英屬(Taraxacum)大角蒲公英組(Sect.Macrocornuta V.Soest)多年生草本植物(2n=2x=16)，原產(chǎn)于哈薩克斯坦，歐洲及中國(guó)新疆等地[1]。橡膠草根部可合成天然橡膠，含膠率在2.89%～27.89%之間[2]，其天然橡膠的分子結(jié)構(gòu)與巴西三葉橡膠相同，均為順式-1,4-聚異戊二烯，且物理機(jī)械性能與三葉橡膠非常相似，可用于工業(yè)化生產(chǎn)[3]。此外，橡膠草具有生長(zhǎng)收獲周期短（1年即可收獲，而三葉橡膠樹(shù)需要5～8年）[4]；種植區(qū)域廣（在亞熱帶和溫帶均可正常生長(zhǎng)）；適合機(jī)械化種植和采收，具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)繁殖能力等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其成為最具商業(yè)開(kāi)發(fā)前景的產(chǎn)膠替代作物之一[5-6]。野生橡膠草的含膠量和生物量偏低，且變異大[7]，不能滿足橡膠草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的要求，為此，科學(xué)家們?cè)谙鹉z草種質(zhì)創(chuàng)新和改良方面做了大量工作，并取得了顯著進(jìn)步。其中，美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)Cornish團(tuán)隊(duì)利用育種手段將橡膠草的平均含膠量提高到9%，小規(guī)模種植產(chǎn)膠量可達(dá)三葉橡膠樹(shù)水平[8]。但由于橡膠草在大田中的生長(zhǎng)活力和競(jìng)爭(zhēng)力弱，自交不親和的特性使群體的優(yōu)良特性無(wú)法穩(wěn)定遺傳，使其實(shí)際的大田種植產(chǎn)量達(dá)不到預(yù)期效果，橡膠草的種質(zhì)改良工作仍然任重道遠(yuǎn)。

多倍體育種作為植物育種的重要手段之一，因多倍體植株常具有花大、抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)健壯和生物量大等特點(diǎn)，被育種家們廣泛應(yīng)用于各種植物育種中[9-10]。20世紀(jì)40—50年代，歐美科學(xué)家利用秋水仙素誘導(dǎo)成功獲得四倍體橡膠草，并培育出四倍體橡膠草Navashin等品種，含膠量和干根產(chǎn)量均明顯提高，但由于年代久遠(yuǎn)，相關(guān)研究信息及材料已無(wú)法找到[11-12]。2018年Luo等[13]利用秋水仙素誘導(dǎo)橡膠草種子獲得四倍體橡膠草植株，表現(xiàn)出一定的天然橡膠產(chǎn)量提高潛力。到目前為止，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于橡膠草多倍體育種的報(bào)道。

秋水仙素作為一種常用的化學(xué)誘變劑，一直廣泛地應(yīng)用于植物多倍體誘導(dǎo)中[14-15]，但其有效誘導(dǎo)率低，且因與植物蛋白的親和性低，處理濃度大，對(duì)植物材料的毒害比較嚴(yán)重，容易造成誘導(dǎo)植株生長(zhǎng)異常，甚至死亡[16-17]。Luo等[13]利用秋水仙素誘導(dǎo)橡膠草四倍體，誘變率最高只有4.92%，且秋水仙素的毒性導(dǎo)致橡膠草萌發(fā)率和成苗達(dá)率不到50%，許多誘導(dǎo)植株生長(zhǎng)異常?？梢?jiàn)，秋水仙素的毒性對(duì)橡膠草生長(zhǎng)影響顯著，其多倍體誘導(dǎo)效果很不理想。氨磺靈，作為一種除草劑類(lèi)誘變劑，因其與植物微管蛋白的親和性高，使用誘變濃度低，且對(duì)植物材料傷害較小，價(jià)格低廉等特點(diǎn)[18-19]，在植物染色體加倍中的應(yīng)用逐漸增多[20-21]，且研究發(fā)現(xiàn)，氨磺靈在大蒜[22]、觀賞姜花[23]、西瓜[24]等許多植物上的多倍體誘導(dǎo)效果要好于秋水仙素。

本研究以橡膠草幼芽為試驗(yàn)材料，采用浸芽法比較氨磺靈和秋水仙素2 種誘變劑的誘變效果，分析四倍體橡膠草的形態(tài)變化，旨在探尋獲得適用于橡膠草的四倍體誘變劑和誘變方案，為橡膠草的種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為橡膠草品系CXCH，2017 年種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所橡膠草種質(zhì)資源圃，2018年初收獲種子。

2種誘變劑分別選擇上海阿拉丁生化科技股份有限公司的氨磺靈（分析標(biāo)準(zhǔn)品）和上海麥克林生化科技有限公司的秋水仙素粉末（含量≥99%）。

試驗(yàn)在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所橡膠草種質(zhì)資源圃，于2018年9月—2020年5月份進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 多倍體誘導(dǎo) 采用浸芽法進(jìn)行誘變處理。設(shè)置秋水仙素濃度為0.05%、0.1%、0.2%；氨磺靈濃度為0.01 mmol/L（約0.0003%），0.02 mmol/L（約0.0007%），0.04 mmol/L（ 約0.0014% ）和0.08 mmol/L（ 約0.0028%），對(duì)照采用無(wú)菌水浸泡30 min。橡膠草CXCH種子用1%雙氧水浸泡、殺菌1 h，之后用水沖洗干凈，放入帶濾紙的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，當(dāng)種子萌發(fā)，胚根長(zhǎng)至5～10 mm左右時(shí)，進(jìn)行誘變處理。處理時(shí)間分別為30 min，1 h，2 h，4 h 和8 h。每組處理100 個(gè)幼芽，3個(gè)重復(fù)。處理結(jié)束后用無(wú)菌水沖洗3 遍，然后移栽至培養(yǎng)土中正常培育，待植株生長(zhǎng)至5～7片葉時(shí)，進(jìn)行倍性篩選。

1.2.2 多倍體鑒定 流式細(xì)胞儀倍性分析：流式細(xì)胞倍性分析參考康向陽(yáng)等[25]的方法，取待測(cè)植株新鮮葉片0.1～0.15 g 放入直徑6 cm 的玻璃培養(yǎng)皿中，滴加500 μL 細(xì)胞核提取液（CyStain UV Precise P05-5002，Partec 德國(guó)），用鋒利刀片一次性快速切碎葉片至糊狀，用尼龍網(wǎng)濾膜(30 μm)過(guò)濾到5.0 ml 離心管中，加入1.6 mL 的DAPI 染色液(Solarbio)，混勻染色30 s，將樣品移至上樣管，用流式細(xì)胞儀（Sysmex CyFlow Cube8，德國(guó)）檢測(cè)。

細(xì)胞學(xué)倍性鑒定：采用橡膠草根尖壓片法，參考楊玉雙等[26]的方法，切取待測(cè)植株約2 mm 長(zhǎng)根尖，洗凈后用2 mmol/L 8-羥基喹啉溶液室溫預(yù)處理4 h，卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇:冰醋酸=3:1）在4℃冰箱中固定24 h，無(wú)菌水漂洗5次，60℃條件下1.0 mol/L鹽酸解離10 min，再用無(wú)菌水漂洗5次，然后用改良卡寶品紅染色5 min 后壓片。在萊卡DM68 全自動(dòng)生物光學(xué)顯微鏡（德國(guó)）下觀察染色體變化情況，拍照記錄。

1.2.3 誘變相關(guān)參數(shù)測(cè)定 發(fā)芽率和成苗率測(cè)定：誘變處理后，將各試驗(yàn)組幼芽分別移栽至相應(yīng)花盆中正常培育，30天以后計(jì)算成苗率。利用流式細(xì)胞儀和根尖染色體壓片技術(shù)篩選、鑒定四倍體植株，統(tǒng)計(jì)、計(jì)算誘導(dǎo)率和嵌合體率。

1.2.4 形態(tài)特征比較 氣孔特征比較：參照劉歡等[16]的方法，選取對(duì)照和多倍體植株各6株，撕取其植株葉片的下表皮，利用萊卡DM68全自動(dòng)生物光學(xué)顯微鏡（德國(guó)）對(duì)氣孔的大小、密度等性狀進(jìn)行觀察測(cè)定，并計(jì)算氣孔的長(zhǎng)度、寬度，統(tǒng)計(jì)氣孔密度（每mm2中的氣孔數(shù)目），并拍照記錄。

葉形態(tài)比較：待處理后植株長(zhǎng)出12 片新葉后，選取對(duì)照和多倍體植株各6 株，測(cè)定其葉長(zhǎng)、葉寬（葉片中間最寬部位）、葉厚（葉片中間最厚部位），葉形指數(shù)（葉長(zhǎng)/葉寬），每指標(biāo)數(shù)據(jù)連續(xù)測(cè)3次。

花和種子形態(tài)測(cè)量：待處理后植株開(kāi)花結(jié)果后，選取對(duì)照和多倍體植株各6 株，測(cè)定其花的長(zhǎng)度、直徑（花基部最寬部位）和花桿的直徑（與花的連接處）、種子粒長(zhǎng)和粒寬（種子最寬處），每指標(biāo)數(shù)據(jù)連續(xù)測(cè)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)用使用IBM SPSS Statistics 19 (IBM,New York,USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、方差分析及LSD多重比較等，所有數(shù)據(jù)用平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變植株倍性鑒定

利用流式細(xì)胞儀對(duì)氨磺靈和秋水仙素處理的待測(cè)植株進(jìn)行倍性檢測(cè)。結(jié)果顯示，氨磺靈和秋水仙素處理后都能誘導(dǎo)染色體加倍。流式細(xì)胞倍性鑒定結(jié)果顯示（圖1），對(duì)照橡膠草二倍體(2n=2x=16)的熒光通道值為200（圖1A）；變異植株，有的在熒光通道值400處出現(xiàn)一個(gè)單峰，DNA 含量較對(duì)照增加了一倍，為四倍體（圖1B）；有的在熒光通道值200和400處同時(shí)出現(xiàn)峰，為二倍體和四倍體的混倍體，即嵌合體（圖1C）。根尖染色體壓片觀察結(jié)果顯示（圖2），二倍體植株的根尖細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目為2n=2x=16（圖2A）；誘導(dǎo)后的四倍體植株染色體數(shù)目為2n=4x=32（圖2B），與流式細(xì)胞儀的倍性鑒定結(jié)果一致。具體倍性鑒定統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 橡膠草流式細(xì)胞倍性分析

圖2 橡膠草二倍體與四倍體的根尖染色體數(shù)比較

2.2 2種誘變劑對(duì)橡膠草多倍體誘變效果比較

氨磺靈不同濃度及時(shí)間誘變處理均能導(dǎo)致一定程度的誘變效果（表1）。隨著處理濃度和處理時(shí)間的增加，氨磺靈處理的成苗率呈下降趨勢(shì)。同一處理濃度下，隨著處理時(shí)間的增加，變異率逐漸減少，處理濃度為0.04 mmol/L時(shí)，不同處理時(shí)間的變異率均高于相應(yīng)其它處理濃度的變異率，其中，0.04 mmol/L 處理30 min的誘變率最高，為14.08%。

秋水仙素的各處理也能產(chǎn)生一定程度的變異。隨著秋水仙素處理濃度和處理時(shí)間的增加，其成苗率呈下降趨勢(shì)，其中，0.2%處理濃度對(duì)橡膠草的成苗率影響最為明顯，當(dāng)處理時(shí)間為30 min 時(shí)，成苗率僅為37%，當(dāng)處理時(shí)間≥1 h 時(shí)，成苗率為0.00%。在0.05%和0.1%處理濃度下，隨著處理時(shí)間的增加，其誘變率逐漸降低，其中，0.1%秋水仙素處理30 min 的誘變率最高，為5.56%。0.2%處理濃度下的不同處理時(shí)間的變異率均為0.00%。

比較2種誘變劑的誘變效果（表1）：氨磺靈的處理濃度范圍為0.01～0.08 mmol/L，即0.0003%～0.0028%，明顯低于秋水仙素0.05%～0.2%的誘變處理濃度；氨磺靈處理的成苗率(60%～75%)要明顯高于秋水仙素處理的成苗率(0～59%)，而且其最高變異率14.08%也高于秋水仙素處理的最高變異率5.56%；而氨磺靈處理的嵌合體率為27.27%，明顯低于秋水仙素處理的75.00%。綜上可知，相對(duì)于秋水仙素處理，氨磺靈處理橡膠草的成苗率和變異率高，嵌合體率低，整體誘變效果更好，其中，0.04 mmol/L 氨磺靈處理30 min 的成苗率為71%，變異率14.08%，嵌合體率25%，為最佳誘變條件。

表1 氨磺靈和秋水仙素對(duì)橡膠草多倍體的誘導(dǎo)效果

續(xù)表1

2.3 四倍體植株與野生型二倍體植株形態(tài)特征比較

與野生型二倍體相比，四倍體植株葉片肥厚，葉色濃綠，生長(zhǎng)較為緩慢，約60 天后，生長(zhǎng)速度恢復(fù)正常。氨磺靈和秋水仙素處理后的四倍體植株形態(tài)特征變化基本一致。

氣孔特征：與野生型二倍體植株相比，四倍體植株的氣孔密度顯著減少(P<0.01)，氣孔顯著增大。二倍體植株氣孔大小為16.87 μm×6.77 μm（長(zhǎng)×寬），四倍體植株氣孔為20.67 μm×9.07 μm；氣孔長(zhǎng)和寬分別比二倍體增加22.53%和33.97%（表2）。

葉片形態(tài)：四倍體植株葉片與二倍體相比，葉長(zhǎng)、葉寬和葉型指數(shù)無(wú)顯著變化，葉片厚度顯著增加（表2，圖3A）(P<0.01)，比二倍體葉片增厚85.71%。

花和種子特征：與二倍體植株相比，四倍體植株的花苞長(zhǎng)度無(wú)顯著變化，而花苞直徑和花桿直徑顯著增大(P<0.01)，分別增大了23.51%和36.77%；四倍體植株的種子大小和千粒重均顯著大于二倍體植株(P<0.01)，其中，四倍體的種子千粒重達(dá)到了0.95 g，是二倍體種子千粒重的2.11倍（表2，圖3B和3C）。

圖3 二倍體與四倍體橡膠草形態(tài)特征比較

表2 二倍體與四倍體橡膠草植株的形態(tài)特征參數(shù)比較

3 討論

3.1 誘變劑和誘變條件的選擇

氨磺靈是二硝基苯胺類(lèi)除草劑，也是一種有絲分裂抑制劑，與秋水仙素的誘導(dǎo)作用類(lèi)似，通過(guò)抑制紡錘絲的形成，使染色體加倍[27]。本研究中，氨磺靈處理的成苗率在60%～75%之間，而秋水仙素的成苗率僅在0%～59%之間，當(dāng)處理濃度為0.2%，處理時(shí)間≥1 h時(shí)，成苗率為0.00%，可見(jiàn)秋水仙素對(duì)橡膠草的毒害作用要大于氨磺靈，這與孔素萍等[22]對(duì)大蒜多倍體誘導(dǎo)的研究結(jié)果大致相似，其原因可能因?yàn)榍锼伤嘏c植物微管蛋白的親和性要比氨磺靈低，秋水仙素的誘變濃度一般要高于氨磺靈誘變濃度，且秋水仙素毒性要高于氨磺靈。誘變率和嵌合體率是判斷誘變劑誘變效果的重要指標(biāo)。Sakhanokho等[23]誘導(dǎo)觀賞姜花多倍體結(jié)果顯示，氨磺樂(lè)靈誘變的效果（最高誘變率15%）優(yōu)于秋水仙素（最高誘變率13%）。

閻志紅等[24]在西瓜四倍體誘導(dǎo)時(shí)，氨磺靈的四倍體誘導(dǎo)率高于秋水仙素，分別達(dá)33.3%和13.3%；孔素萍等[22]對(duì)大蒜多倍體誘導(dǎo)的研究結(jié)果顯示，氨磺靈的誘變率(20.25%)要高與秋水仙素(12.25%)，其嵌合體率(2.45%)要低于秋水仙素(3.10%)；而儲(chǔ)麗紅等[17]在安祖花多倍體誘導(dǎo)研究結(jié)果顯示，秋水仙素的四倍體誘導(dǎo)率高于氨磺靈，分別為45.10%和42.22%?？梢?jiàn)，2 種誘變劑對(duì)不同植物的誘變效果存在差異。本研究中，氨磺靈的最高誘變率在14.08%，嵌合體率為27.27%；而秋水仙素的最高誘變率為5.56%，嵌合體率為75.00%，這與Luo 等[13]獲得的秋水仙素誘導(dǎo)四倍體橡膠草的最高誘變率(4.92%)一致。綜上所述，相對(duì)于秋水仙素，氨磺靈因具有高成苗率、高變異率和低嵌合體，而更適用于橡膠草多倍體誘變。其中，氨磺靈處理0.04 mmol/L處理30 min的誘變率最高，為14.08%，是橡膠草四倍體誘變的最佳處理?xiàng)l件。

3.2 倍性的鑒定

倍性鑒定是倍性育種的重要環(huán)節(jié)，簡(jiǎn)單、快速、有效的鑒定倍性能大大減少工作量，實(shí)現(xiàn)早期篩選與應(yīng)用，加快育種進(jìn)程。染色體計(jì)數(shù)法是鑒定倍性最直觀、最可靠的方法之一，但制片難度較大，工作量大，而且嵌合體植株很難檢出，故不宜用來(lái)進(jìn)行大批量的植株倍性快速鑒定[28]，由于橡膠草幼苗根尖細(xì)小，取材困難，用染色體計(jì)數(shù)法確定植株倍性就更難實(shí)施。流式細(xì)胞儀分析法根據(jù)測(cè)定細(xì)胞的DNA 含量比較染色體倍性，是近幾年發(fā)展起來(lái)的較為快捷、準(zhǔn)確鑒定多倍體植株的方法，已在許多植物倍性鑒定中成功應(yīng)用[29]，但由于不同植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同及次級(jí)代謝產(chǎn)物的特殊性和復(fù)雜性，流式細(xì)胞儀鑒定植株倍性的適用性也不同[30]。本研究顯示，利用流式細(xì)胞儀可在植株幼苗階段可快速鑒定出多倍體、嵌合體，且流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)的染色體數(shù)觀察鑒定結(jié)果一致，證明該方法用于橡膠草植株倍性分析是有效的。此外，學(xué)者們?cè)谠S多植物多倍體誘導(dǎo)研究中表明，四倍體植株常表現(xiàn)為根、莖、葉、花、果實(shí)等器官明顯增大，葉下表皮氣孔增大、密度減少等特點(diǎn)[29-30]。本研究顯示，橡膠草四倍體植株，較野生型二倍體植株，葉片顯著增厚(P<0.01)，花苞和種子顯著增大(P<0.01)，葉下表皮氣孔顯著增大、密度顯著減少(P<0.01)。這與Luo等[13]獲得的四倍體橡膠草形態(tài)變化一致，進(jìn)一步說(shuō)明這些形態(tài)特征可作為橡膠草多倍體初步快速鑒定和育種的有效方法。

4 結(jié)論

氨磺靈和秋水仙素2種誘變劑均能誘導(dǎo)出四倍體橡膠草。氨磺靈誘變效果和成苗率均高于秋水仙素，更適合用于橡膠草多倍體誘變，氨磺靈0.04 mmol/L處理30 min 的誘變率最高，為14.08%，是橡膠草四倍體誘變的最佳處理?xiàng)l件。利用流式細(xì)胞儀可在植株幼苗階段快速鑒定出多倍體、嵌合體，說(shuō)明該方法可用于橡膠草快速倍性鑒定。對(duì)比形態(tài)特征顯示，橡膠草四倍體植株葉片增厚，花苞和種子增大，葉下表皮氣孔增大、密度顯著減少，與二倍體植株差異顯著，可作為多倍體初步篩選標(biāo)準(zhǔn)。本研究初步探明了2種誘變劑對(duì)橡膠草染色體加倍的誘導(dǎo)效果，為今后橡膠草多倍體育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。