周冰倩，韓 麗，陳哲逸，陳詩宇，鄭英霞

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院檢驗科，上海 200082

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤［1］。在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居各類癌癥之首，且呈逐年上升趨勢［2］。近年來，隨著手術治療、化學治療、靶向和個體化治療的全面開展，肺癌患者短期生存率有了明顯改善，但其5年生存率仍不容樂觀，即從早期的73%降至晚期的13%［3］；且相關研究［4］顯示，局部侵襲和遠處轉移仍然是晚期肺癌患者最主要的致死原因。因此，深入探究參與肺癌細胞生長、轉移的相關分子及其信號轉導通路已成為了當前的研究熱點。

蛋白精氨酸甲基轉移酶5（protein arginine methyltransferase 5，PRMT5）是一種Ⅱ型甲基化轉移酶，能夠催化組蛋白3和組蛋白4的不同精氨酸發(fā)生對稱性二甲基化修飾，如組蛋白4精氨酸3的對稱性二甲基化（symmetric di-methylation of histone4 arginine3，H4R3me2s）、組蛋白3精氨酸8的對稱性二甲基化（symmetric di-methylation of histone3 arginine8，H3R8me2s），以調(diào)控基因的轉錄激活/抑制［5-7］。已有研究表明PRMT5在肺癌［8-9］、肝癌［10］、乳腺癌［11］、黑色素瘤［12］等多種癌癥中有較高的表達，提示PRMT5可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。動物肺癌轉移模型的相關研究［8］顯示，PRMT5表達增加時腫瘤細胞生長速度較快。上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤生長、侵襲和轉移等過程中發(fā)揮著重要作用［13］。有研究［14］發(fā)現(xiàn)PRMT5是腫瘤EMT過程中的重要調(diào)控因子，如其可誘導胰腺癌細胞發(fā)生EMT進而增強細胞的遷移和侵襲能力?；诖?，本研究結合生物信息學分析，檢測PRMT5在肺癌組織中的表達，并通過體外功能實驗驗證PRMT5對肺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，分析其與患者生存預后的關聯(lián)，為PRMT5作為肺癌的治療靶標提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織芯片獲取及患者信息

73對經(jīng)石蠟包埋的肺癌及癌旁組織制成的芯片購于上海芯超生物科技有限公司。在上述患者中，男性39例、女性34例，年齡為20～84歲。

1.2 數(shù)據(jù)收集和分析

從基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中下載癌細胞系百科全書（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）數(shù)據(jù)集GSE36139。該數(shù)據(jù)集包含917種癌細胞系的DNA突變、基因表達和染色體拷貝數(shù)等遺傳信息。從UCSC Xena數(shù)據(jù)平臺（https：//xenabrowser.net/datapages/）下載肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）的癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，并獲得RNA測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)；其中，LUAD數(shù)據(jù)中包含了517例LUAD組織和59例正常組織的測序數(shù)據(jù)，LUSC數(shù)據(jù)中包含了502例LUSC組織和51例正常組織的測序數(shù)據(jù)。采用R4.0.3分析PRMT5mRNA在上述2種肺癌及正常肺組織中的表達。同時，獲取Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/）中的肺癌數(shù)據(jù)，對PRMT5的表達與患者預后進行相關性分析。

1.3 細胞和主要試劑

肺癌細胞NCI-H1299、NCI-H460、HCC827、PC-9和人胚肺成纖維細胞MRC-5均購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。293T細胞為本實驗室保存。

檸檬酸（pH6.0）抗原修復液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、蘇木精染液、蘇木精返藍液、中性樹膠、免疫組織化學試劑盒及DAB顯色劑均購于武漢賽維爾生物科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購于美國Gibco公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、RNA反轉錄試劑盒購于日本Takara公司，實時熒光定量PCR試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PRMT5單克隆抗體、EMT抗體盒購于美國CST公司，肌動蛋白（β-actin）購于武漢愛博泰克生物科技有限公司，CCK8試劑盒購于日本同仁化學研究所，Transwell和Invasion小室購于美國Corning公司。PBST緩沖液［磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）∶Tween-20=1 000∶1］為實驗室自行配制。

1.4 方法

1.4.1 石蠟包埋組織芯片中PRMT5表達量檢測 采用免疫組織化學法檢測73對石蠟包埋組織芯片中PRMT5的表達，經(jīng)脫水、封片后置于光學顯微鏡下觀察，胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃顆粒則視為PRMT5陽性細胞。PRMT5表達評分標準見表1，最終評分=強弱評分×比例評分。后續(xù)，將根據(jù)其獲得的最終評分與患者的臨床特征行相關性分析。

表1 PRMT5表達評分標準Tab 1 PRMT5 expression scoring criteria

1.4.2 細胞培養(yǎng) MRC-5、PC-9、293T細胞均采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，NCI-H1299、NCI-H460、HCC827細胞均采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。所有細胞的培養(yǎng)條件均為37℃、5%CO2。

1.4.3 細胞中PRMT5表達量檢測 采用蛋白質印跡法（Western blotting）檢測MRC-5、NCI-H1299、NCI-H460、HCC827、PC-9細胞中PRMT5的表達。制備上述5種細胞的蛋白，按照說明書進行電泳、轉膜、封閉、一抗和二抗孵育，最后用Odyssey紅外成像系統(tǒng)進行檢測。使用的一抗為β-actin、PRMT5抗體（稀釋比例均為1∶1 000），熒光二抗稀釋比例為1∶5 000。

1.4.4PRMT5-shRNA寡核苷酸合成 目的基因為PRMT5，物種來源為人。靶向PRMT5的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）寡核苷酸序列見表2。

表2 sh RNA寡核苷酸序列Tab 2 Oligonucleotide sequence of shRNA

1.4.5PRMT5-shRNA慢病毒重組質粒構建 選用PLenR-GPH載體［吉滿生物科技（上海）有限公司］作為慢病毒載體，其自帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記，便于后續(xù)觀察轉染效率。利用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶使載體線性化，而后分別將表2中的寡聚核苷酸序列插入PLenR-GPH載體的EcoRⅠ和BamHⅠ位點之間，構建PRMT5-shRNA慢病毒重組質粒。

1.4.6 慢病毒包裝 使用促轉染試劑將構建好的重組質粒及輔助包裝質粒［吉滿生物科技（上海）有限公司］與293T細胞共轉染10～12 h，而后加入轉染增強試劑促進轉染8 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液并進行濃縮，獲得慢病毒原液。

1.4.7 慢病毒感染、穩(wěn)定敲除PRMT5細胞株建立及其敲除效果分析 將處于對數(shù)生長期的H1299細胞以105個/mL接種于6孔板，按照慢病毒感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=20加入病毒并添加2.5μg/mL聚凝胺進行感染，以獲取穩(wěn)定敲除PRMT5的H1299細胞株。培養(yǎng)48 h后，于熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率。更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，提取細胞總RNA并制備細胞裂解蛋白，采用反轉錄及實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、Western blotting檢測PRMT5的敲除效果，具體步驟參照說明書進行。引物序列見表3。

表3 q PCR引物序列Tab 3 Primer sequences for qPCR

1.4.8 細胞增殖能力檢測 將分別轉染PRMT5-shRNA和NC-shRNA的H1299細胞以5×104個/mL接種至96孔板中，37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，而后向每孔加入10μL CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標儀測定細胞在450 nm處的吸光度。

1.4.9 細胞遷移和侵襲能力檢測 將分別轉染PRMT5-shRNA和NC-shRNA的H1299細胞按5×104個/孔分別加入Transwell和Invasion小室中，各設置3個復孔。將小室放入下層添加了700μL含10%FBS的RPMI-1640的24孔板中培養(yǎng)48 h，而后經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌3次，采用結晶紫染料染色30 min，再用PBS洗滌3次，最終用平底的濕棉簽輕輕擦去小室內(nèi)部未遷移至下層的細胞，于顯微鏡下拍照并統(tǒng)計穿過Transwell和Invasion小室的細胞總數(shù)，取3個復孔的平均值分別代表細胞的遷移、侵襲能力。

1.4.10 EMT相關蛋白及其基因檢測 選取生長狀態(tài)良好的已分別轉染PRMT5-shRNA和NC-shRNA的NCIH1299細胞，抽提總RNA并制備細胞裂解蛋白，采用Western blotting、qPCR檢測敲除PRMT5后的EMT相關蛋白［E鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和轉錄因子SNAI1］及其基因的表達。qPCR引物序列見表3，其中VIM和SNAI1是轉移激活基因，CDH1是轉移抑制基因。使用的抗體包括β-actin、PRMT5、E-cadherin、vimentin和SNAI1抗體（稀釋比例均為1∶1 000）。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism 8.0軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。定量資料以±s表示，采用Student′st檢驗進行分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PRMT5在肺癌及癌旁組織中的表達

對73例患者的肺癌及癌旁組織芯片進行免疫組織化學分析，結果（圖1）顯示PRMT5在肺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織（P=0.000）；隨后，對PRMT5表達與患者的不同臨床特征間的相關性進行分析，結果（表4）顯示PRMT5在腫瘤Ⅲ～Ⅳ期的表達高于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.033）。

圖1 免疫組織化學檢測PRMT5在肺癌及癌旁組織中的表達Fig 1 Expression of PRMT5 in lung cancer tissuesand adjacent tissuesby immunohistochemistry

表4 PRMT5的表達水平與肺癌患者臨床特征間的關系Tab 4 Relationship between the expression of PRMT5 and the clinical features of lung cancer patients

Continued Tab

2.2 PRMT5在肺癌細胞系中的表達

CCLE數(shù)據(jù)集GSE36139中共有來自24個原發(fā)部位的腫瘤，共917株不同的癌細胞系。對這917種癌細胞系進行分析，結果（圖2A、B）顯示PRMT5mRNA在肺癌等多個原發(fā)部位腫瘤中表達，且在LUAD和大細胞肺癌中的表達水平均高于LUSC（P=0.034，P=0.028）。隨后，采用Western blotting檢 測MRC-5、NCI-H1299、NCI-H460、HCC827、PC-9細胞中PRMT5的表達，結果（圖2C）顯示與MRC-5細胞相比，PRMT5在肺癌細胞系中高表達。

圖2 PRMT5在多種癌細胞中的表達Fig 2 Expression of PRMT5 in various cancer cells

2.3 穩(wěn)定敲除PRMT5細胞株的構建及PRMT5對細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

本研究通過轉染PRMT5-shRNA1、PRMT5-shRNA2、PRMT5-shRNA3篩選穩(wěn)定敲除PRMT5的細胞株，于熒光顯微鏡下觀察轉染效率，并采用反轉錄及qPCR、Western blotting檢測PRMT5的mRNA和蛋白表達，結果（3A、B）顯示，與轉染NC-shRNA相比，轉染PRMT5-shRNA3后的NCIH1299細胞中PRMT5表達明顯降低，因此該細胞株即為穩(wěn)定敲除PRMT5的NCI-H1299細胞株（在后續(xù)實驗中，提及PRMT5-shRNA即為PRMT5-shRNA3）。

采用CCK8法檢測轉染PRMT5-shRNA細胞和轉染NC-shRNA細胞的增殖能力，結果（圖3C）顯示，在培養(yǎng)48、72 h后，PRMT5-shRNA組細胞的增殖能力顯著低于NC-shRNA組（均P=0.000）。采用Transwell小室和Invasion小室檢測轉染PRMT5-shRNA組和NC-shRNA組細胞的遷移和侵襲能力，結果（圖3D、E）顯示，PRMT5-shRNA組細胞的遷移、侵襲能力均低于NCshRNA組（均P=0.000）。

圖3 沉默PRMT5對肺癌細胞NCI-H1299的增殖、遷移和侵襲能力的影響Fig 3 Effectsof silencing PRMT5 on proliferation,migration and invasion abilities of lung cancer cell NCI-H1299

2.4 干擾肺癌細胞系PRMT5對EMT相關蛋白及其基因的影響

采用Western blotting檢測穩(wěn)定敲除PRMT5的細胞NCI-H1299中EMT相關蛋白的表達，結果（圖4A）顯示敲除PRMT5后E-cadherin的表達水平增加、vimentin和SNAI1的表達水平下降；同時，采用反轉錄及qPCR檢測上述蛋白的基因（CDH1、SNAI1、VIM）表達情況，結果（圖4B）顯示轉移激活基因VIM和SNAI1的表達水平下降，轉移抑制基因CDH1的表達水平增加。

圖4 敲除PRMT5后EMT相關蛋白及其基因的表達Fig 4 Expression of EMT-associated proteinsand the genesafter PRMT5 knockout

2.5 PRMT5 mRNA在肺癌及正常肺組織中的表達及其表達與患者預后的相關性

從UCSC Xena數(shù)據(jù)平臺下載TCGA數(shù)據(jù)庫，獲得LUAD和LUSC的RNA-seq數(shù)據(jù)，并通過R語言分析PRMT5mRNA在該2種肺癌及正常肺組織中的表達。結果（圖5A、B）顯示，PRMT5mRNA在肺癌組織中的表達顯著高于正常肺組織（均P=0.000）。隨后，通過Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫對肺癌組織中PRMT5mRNA的表達與肺癌患者總生存（overall survival，OS）率、無復發(fā)生存（relapse-free survival，RFS）率的相關性進行分析，結果（圖5C、D）顯示PRMT5mRNA高表達的LUAD患者的OS率低于PRMT5mRNA低表達患者（P=0.005），而PRMT5mRNA的表達水平與LUSC患者的OS率無相關性；同時，與PRMT5mRNA低表達的LUSC患者相比，PRMT5mRNA高表達患者的RFS率較低（P=0.028）。繼而提示，PRMT5表達的增加與肺癌的不良預后有關。

圖5 TCGA數(shù)據(jù)庫中PRMT5 mRNA在肺癌及正常肺組織中的表達及其表達與患者預后的關系Fig 5 Expression of PRMT5 mRNAin lung cancer tissues and normal lung tissuesfrom TCGA database and thecorrelation with prognosis

3 討論

在全球范圍內(nèi)，肺癌已成為癌癥致死的首要原因，平均每年致死人數(shù)高達170多萬［15］。多項研究［9，11，16］表明，PRMT5在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，即其可通過對H4R3me2s、H3R8me2s行甲基化修飾來調(diào)控腫瘤相關基因的轉錄抑制或激活，進而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究通過免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)PRMT5在肺癌組織中高表達，其表達水平與臨床病理分級相關。隨后，我們通過慢病毒干擾體外實驗發(fā)現(xiàn)PRMT5能促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，且EMT相關上皮標記蛋白E-cadherin表達增加、間質性標記蛋白vimentin和SNAI1表達減少；繼而提示，PRMT5可能通過調(diào)控EMT相關蛋白的表達來促進肺癌細胞的遷移和侵襲。但PRMT5究竟是對EMT相關蛋白直接作用，還是通過組蛋白甲基化來影響該蛋白的表達，尚需進一步探討。本研究進一步結合大數(shù)據(jù)對PRMT5mRNA在LUAD和LUSC中的表達進行分析，結果顯示其在2種肺癌組織中均表達增加，且隨著PRMT5mRNA表達的增加，LUAD患者OS、LUSC患者RFS縮短，表明PRMT5發(fā)揮著促進肺癌發(fā)展的作用。

相關文獻［9］報道，高濃度的特異性PRMT5抑制劑GSK591可阻斷細胞中PRMT5的活性，對人胚肺成纖維細胞IMR-90和肺癌細胞A549有選擇性殺傷活性。目前，已有多項針對PRMT5的臨床試驗處于安全性和有效性的測試階段［17］。綜上所述，PRMT5在肺癌中高表達，可發(fā)揮促腫瘤的作用，并且其可能通過參與調(diào)節(jié)肺癌EMT信號通路促進肺癌細胞的侵襲轉移。PRMT5表達與肺癌的不良預后有關，該結果或將為篩選肺癌的潛在治療靶標提供參考。

參·考·文·獻

[1] Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2020[J].CA Cancer JClin,2020,70(1):7-30.

[2] Feng RM,Zong YN,Cao SM,et al.Current cancer situation in China:good or bad news from the 2018 Global Cancer Statistics?[J].Cancer Commun,2019,39(1):22.

[3] Woodard GA,Jones KD,Jablons DM.Lung cancer staging and prognosis[J].Cancer Treat Res,2016,170:47-75.

[4] Mehlen P,Puisieux A.Metastasis:a question of life or death[J].Nat Rev Cancer,2006,6(6):449-458.

[5] Stopa N,Krebs JE,Shechter D.The PRMT5 arginine methyltransferase:many roles in development,cancer and beyond[J].Cell Mol Life Sci,2015,72(11):2041-2059.

[6] Pal S,Baiocchi RA,Byrd JC,et al.Low levels of miR-92b/96 induce PRMT5 translation and H3R8/H4R3 methylation in mantle cell lymphoma[J].EMBO J,2007,26(15):3558-3569.

[7] Migliori V,Müller J,Phalke S,et al.Symmetric dimethylation of H3R2 is a newly identified histone mark that supports euchromatin maintenance[J].Nat Struct Mol Biol,2012,19(2):136-144.

[8] Jing PY,Zhao N,Ye MX,et al.Protein arginine methyltransferase 5 promotes lung cancer metastasisviathe epigenetic regulation of miR-99 family/FGFR3 signaling[J].Cancer Lett,2018,427:38-48.

[9]Chen H,Lorton B,Gupta V,et al.ATGFβ-PRMT5-MEP50 axisregulatescancer cell invasion through histone H3 and H4 arginine methylation coupled transcriptional activation and repression[J].Oncogene,2017,36(3):373-386.

[10] Jiang H,Zhu Y,Zhou ZY,et al.PRMT5 promotes cell proliferation by inhibiting BTG2 expressionviathe ERK signaling pathway in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Med,2018,7(3):869-882.

[11] Chiang K,Zielinska AE,Shaaban AM,et al.PRMT5 is a critical regulator of breast cancer stem cell functionviahistone methylation and FOXP1 expression[J].Cell Rep,2017,21(12):3498-3513.

[12] Nicholas C,Yang J,Peters SB,et al.PRMT5 is upregulated in malignant and metastatic melanoma and regulates expression of MITF and p27(Kip1.)[J].PLoSOne,2013,8(9):e74710.

[13] Brabletz T,Kalluri R,Nieto MA,et al.EMT in cancer[J].Nat Rev Cancer,2018,18(2):128-134.

[14] Ge L,Wang H,Xu X,et al.PRMT5 promotes epithelial-mesenchymal transitionviaEGFR-β-catenin axis in pancreatic cancer cells[J].JCell Mol Med,2020,24(2):1969-1979.

[15] Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics 2018:globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer JClin,2018,68(6):394-424.

[16] Shailesh H, Zakaria ZZ, Baiocchi R, et al. Protein arginine methyltransferase 5(PRMT5)dysregulation in cancer[J].Oncotarget,2018,9(94):36705-36718.

[17] Yuan YY,Nie H.Protein arginine methyltransferase 5:a potential cancer therapeutic target[J].Cell Oncol(Dordr),2021,44(1):33-44.