陳 盛，嚴志龍，吳曄明，徐 敏，顧 松，馬 靖

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心普外科，上海 2 0 0 1 2 7；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院兒外科，上海 200092；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心病理科，上海 200127

神經母細胞瘤（neuroblastoma，NB）源于交感神經節(jié)的原始神經嵴細胞，是最常見的兒童惡性實體腫瘤之一。雖然有手術、化學治療（化療）、放射治療（放療）、自身造血干細胞移植等多種治療方式，但由于進展期NB具有易轉移、易復發(fā)、預后較差的特點，治療效果均不理想。據文獻［1-2］報道，國際神經母細胞瘤分期系統(tǒng)（International Neuroblastoma Staging System，INSS）3期的NB患兒5年生存率約為50%，4期NB的5年生存率僅為20%。因此，尋找NB發(fā)生、發(fā)展中的關鍵分子靶點，對提高該病的療效、判斷其預后具有重要意義。

實體腫瘤快速生長，而腫瘤滋養(yǎng)血管生長速度相對落后，并可能存在血管畸形，因此，腫瘤內部存在血液供應不足、缺氧是典型的微環(huán)境特征［3-4］。已知低氧導致NB具有更強的侵襲、轉移能力，也使得NB細胞去分化，具備腫瘤干細胞特征，對放療、化療有更強的耐受性［5-6］。在缺氧過程中，NB的低氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達增加，HIF-1α在NB細胞適應缺氧環(huán)境、惡性程度增加的過程中發(fā)揮關鍵作用［7-8］。本課題組前期研究［7］首先發(fā)現，NB細胞中HIF-1α通過激活下游的音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信號通路，促進NB細胞生長和侵襲。在前期研究的基礎上，本研究通過測定HIF-1α/SHH通路在NB中的表達，報道該信號通路與NB臨床特征的聯系，以及對其預后的提示意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2009年1月—2014年12月在上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心、上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院住院行NB切除術，手術年齡為0～18歲的兒童患者作為研究對象，在2家醫(yī)院的病理科調取NB石蠟切片。并選擇相同時間段和年齡段、接受節(jié)細胞神經瘤（ganglioneuroma，GN）切除術的患兒作為對照組，同樣調取其石蠟切片。NB患兒共101例，其中男性53例，女性48例；中位年齡為3歲（4個月～10歲）；收集相關病史資料進行回顧性分析。GN患兒共20例，其中男性8例，女性12例；中位年齡為10歲（4～17歲）。本研究經上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心和上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院倫理委員會批準（批件號分別為SCMCIRB-K2017024、XHEC-D-2036）。

1.2 主要試劑

免疫組織化學實驗所需的HIF-1α一抗（工作濃度1∶200）購自美國Abcam公司，SHH一抗（工作濃度1∶200）購自美國Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標記的二抗（工作濃度1∶100）購自美國Santa Cruz公司。

1.3 免疫組織化學實驗

采用免疫組織化學SP（streptavdin-peroxidase）法進行染色，在NB和GN石蠟切片中檢測HIF-1α和SHH蛋白表達，實驗步驟如參考文獻［9］所述。

切片由2位病理科醫(yī)師盲法閱片，對免疫組織化學結果進行半定量評分，如有意見不同則協商討論達成一致。每張石蠟切片隨機選5個高倍視野（×400），每個視野計數200個細胞。按照細胞著色百分比和著色強度分別評分，評分標準如參考文獻［10］所述：著色細胞≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；細胞無著色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕褐色計3分。2種分值的乘積為最終得分，≥6分為高表達，<6分為低表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以中位數（全距）表示；定性資料以頻數（百分比）表示，采用χ2檢驗。對HIF-1α和SHH在NB中的表達水平進行Spearman相關分析，采用Kaplan-Meier生存分析法進行預后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NB患兒的一般信息

將101例NB患兒按INSS分期標準，分為1期患者20例、2期患者23例、3期患者22例、4期患者36例（包括4s期4例）。腫瘤原發(fā)部位位于腎上腺49例、后腹膜39例、后縱隔12例、頸部1例。所有患兒均接受NB完全或部分切除術，61例術后接受正規(guī)化療，其中8例接受自體干細胞移植。有5例因家庭原因或經濟原因術后未接受或未完成正規(guī)化療，均死亡。22例死于腫瘤進展或復發(fā)、轉移，3例死于化療后嚴重感染，失訪9例。去除失訪病例，本組病例5年總體生存（overall survival，OS）率為67.4%，5年無事件生存（event-free survival，EFS）率為62.0%。其中1期NB患兒OS率和EFS率均為100%，2期NB患兒OS率和EFS率均為95.7%，3期NB患兒OS率和EFS率分別為59.1%、45.5%，4期NB患兒OS率和EFS率分別為37.5%、31.2%。

2.2 HIF-1α、SHH在NB和GN中的表達差異

免疫組織化學顯示HIF-1α表達于細胞核，SHH表達于細胞核和細胞質（圖1）。HIF-1α在27例（26.7%）NB患兒中高表達，在74例（73.3%）例患兒中低表達；SHH在33例（32.7%）NB患兒中高表達，在68例（67.3%）例患兒中低表達；在GN中，只有1例高表達HIF-1α（5.0%），2例高表達SHH（10.0%）（表1、圖1）。因此，HIF-1α、SHH在NB中的表達率高于GN，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。Spearman相關分析顯示，101例NB中HIF-1α、SHH表達水平呈顯著正相關（r=0.41，P=0.000）。

表1 HIF-1α、SHH在NB和GN中的表達水平Tab 1 Expression levels of HIF-1αand SHH in NBs and GNs

2.3 HIF-1α、SHH表達水平和NB臨床病理特征的關系

3、4期NB中HIF-1α、SHH的高表達患者比例高于1、2期NB，差異有統(tǒng)計學意義（HIF-1α：38.6%vs11.4%，P=0.002；SHH：42.1%vs20.5%，P=0.021）（圖1、表2）。病理分類為組織分化不良型（unfavorable histology，UFH）NB中HIF-1α、SHH的高表達患者比例也高于組織分化良好型（favorable histology，FH）NB，差異有統(tǒng)計學意義（HIF-1α：37.0%vs14.9%，P=0.012；SHH：44.4%vs19.1%，P=0.007）（圖1、表2）。此外，HIF-1α、SHH的高表達也與局部淋巴結轉移有關（HIF-1α：36.2%vs14.0%，P=0.012；SHH：46.6%vs14.0%，P=0.001），而與年齡、性別、MYCN proto-oncogene（MYCN）基因擴增、腫瘤遠處轉移等因素無關（均P>0.05）（表2）。

表2 HIF-1α、SHH表達水平和NB患兒臨床病理特征的關系Tab 2 Relationship between expression levels of HIF-1α/SHH and clinicopathological characteristics of NB patients

圖1 HIF-1α、SHH在GN和NB中的典型表達Fig 1 Typical expression of HIF-1αand SHH in GN and NB

2.4 HIF-1α、SHH表達水平和NB預后相關

去除失訪病例，92例NB患兒中位隨訪時間為7.1年（5.1年～11.4年）。Kaplan-Meier生存分析顯示，HIF-1α高表達組的5年OS率和EFS率均低于HIF-1α低表達組，差異有統(tǒng)計學意義（OS率：40.9%vs75.7%，P=0.001；EFS率：40.9%vs70.0%，P=0.008）（圖2）。SHH高表達組的5年OS率、EFS率也同樣低于SHH低表達組，差異有統(tǒng)計學意義（OS率：42.9%vs78.1%，P=0.000；EFS率：39.3%vs73.4%，P=0.001）（圖2）。

圖2 NB患兒中HIF-1α、SHH的表達水平和預后的關系Fig 2 Relationship between theexpression levels of HIF-1α/SHH and theprognosis in NBpatients

3 討論

腫瘤微環(huán)境中，低氧通過調節(jié)與細胞增殖、凋亡、黏附、代謝、血管生成等相關基因的轉錄，使腫瘤細胞增殖性、耐藥性、侵襲力增加［11-12］。HIF-1是細胞在低氧下調節(jié)生理功能的重要轉錄因子，可調節(jié)與氧氣輸送、利用，以及葡萄糖代謝有關的1 000多種人類基因的表達［13-14］。HIF-1是一個異二聚體，由氧調節(jié)性表達的α-亞基和組成性表達的β-亞基構成。常氧下α-亞基中的2個關鍵脯氨酸殘基會被羥化，在von Hippel-Lindau腫瘤抑制蛋白的作用下，HIF-1α被泛素化，隨后被蛋白酶體降解；低氧下α-亞基的降解被阻斷，其表達升高，并促進下游靶基因轉錄［13-14］。有文獻［7，15-16］報道，在包括NB在內的一些惡性腫瘤中，HIF-1α高表達可增加腫瘤細胞的惡性程度，促進其生長侵襲，并提示不良預后。

SHH信號通路在胚胎發(fā)育和組織分化中起到重要作用，但是該通路的異常激活會導致細胞過度增殖，有產生腫瘤的風險［17］。研究［18］證明，NB中該信號通路存在異常激活，阻斷該通路后可有效抑制NB生長，促進凋亡，降低MYCN的表達水平。本課題組前期研究［7］發(fā)現，在NB中HIF-1α可正向調控SHH信號通路，通過激活該通路實現HIF-1α促NB生長的效應。本研究在較大樣本量的NB病例中測定HIF-1α/SHH信號通路的表達，并將其和患者的臨床特征、遠期預后相聯系，探索該通路的臨床意義。

HIF-1α在NB中的作用仍有爭議。Dungwa等［19］發(fā)現NB中HIF-1α高表達與高的INSS分期、UFH病理類型、高危分組等臨床特征密切相關，并提示患兒的不良預后。但也有研究［20］結論與之相反，即HIF-1α高表達的NB患兒傾向于有更低的INSS分期、更高的5年OS率。GN同樣起源于交感神經節(jié)的原始神經嵴細胞，和NB是同一家族的腫瘤，但GN組織分化成熟，是良性腫瘤。本研究發(fā)現HIF-1α、SHH在GN中均低表達，而在NB中表達升高，尤其在進展期NB中表達更高；說明HIF-1α/SHH信號通路激活和NB的惡性表型相關，也可能在NB的發(fā)生、發(fā)展以及組織分化中起到重要作用。3、4期以及UFH型NB的HIF-1α、SHH表達水平高于1、2期以及FH型NB，有局部淋巴結轉移的NB中HIF-1α、SHH表達水平同樣升高，這進一步說明HIF-1α/SHH信號通路激活可能是NB進展、轉移、去分化的分子機制。在本研究中，NB的HIF-1α和SHH表達水平呈正相關，也證實HIF-1α對SHH通路的正向調控作用。我們也發(fā)現HIF-1α、SHH高表達組的5年OS率、EFS率均降低，提示HIF-1α/SHH信號通路激活可能預示NB患兒的不良預后，可作為年齡、分期、MYCN基因擴增、病理類型等已知的NB預后因素的補充條件，進一步增加判斷NB預后的準確性。

原癌基因MYCN擴增在促進NB生長、侵襲、轉移、血管生成等方面發(fā)揮重要作用，強烈提示NB的不良預后［21-22］。MYCN在NB中的擴增率為10%～25%，在進展期NB中擴增率更高［23］。HIF-1α/SHH信號通路和MYCN擴增之間的關系尚不明確，需進一步研究。本研究中MYCN的擴增率為11.9%（12/101），我們未發(fā)現MYCN擴增組和非擴增組之間HIF-1α和SHH的表達差異，無法提示HIF-1α/SHH信號通路和MYCN之間的調控關系，這也可能和NB中MYCN的擴增率較低有關。

綜上所述，HIF-1α、SHH表達升高和NB高的INSS分期、局部淋巴結轉移、UFH病理分型等臨床特征密切相關，并預示NB患兒的不良預后。因此，HIF-1α/SHH信號通路激活可能在NB發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，該信號通路可能是NB潛在的生物標志物和治療靶點。

參·考·文·獻

[1] Tas ML,Reedijk AMJ,Karim-Kos HE,et al.Neuroblastoma between 1990 and 2014 in the netherlands:increased incidence and improved survival of high-risk neuroblastoma[J].Eur JCancer,2020,124:47-55.

[2] 張安安,潘慈,葉啟東,等.4期神經母細胞瘤綜合治療的遠期隨訪觀察[J].中華醫(yī)學雜志,2014,94(20):1547-1552.

[3] 連烜曄,崔晶.低氧對腫瘤轉移的促進作用[J].癌癥進展,2019,17(10):1139-1142.

[4] Hapke RY,Haake SM. Hypoxia-induced epithelial to mesenchymal transition in cancer[J].Cancer Lett,2020,487:10-20.

[5] Zhang L,Marrano P,Wu B,et al.Combined antitumor therapy with metronomic topotecan and hypoxia-activated prodrug,evofosfamide,in neuroblastoma and rhabdomyosarcoma preclinical models[J].Clin Cancer Res,2016,22(11):2697-2708.

[6] Yu T,Li L,Liu W,et al.Silencing of NADPH oxidase 4 attenuates hypoxia resistance in neuroblastoma cells SH-SY5Y by inhibiting PI3K/Aktdependent glycolysis[J].Oncol Res,2019,27(5):525-532.

[7] Chen S,Zhang M,Xing L,et al.HIF-1αcontributes to proliferation and invasiveness of neuroblastoma cellsviaSHH signaling[J].PLoSOne,2015,10(3):e0121115.

[8] Sun W,Zhang L,Hou L,et al.Isatin inhibits SH-SY5Y neuroblastoma cell invasion and metastasis through MAO/HIF-1α/CXCR4 signaling[J].Anticancer Drugs,2017,28(6):645-653.

[9] Xiao Y,Qu C,Ge W,et al.Depletion of thymosinβ4 promotes the proliferation,migration,and activation of human hepatic stellate cells[J].Cell Physiol Biochem,2014,34(2):356-367.

[10] 陳康,莢衛(wèi)東,葛勇勝,等.KLK7在肝細胞癌中的表達及其意義[J].安徽醫(yī)科大學學報,2019,54(10):1637-1641.

[11] Miranda-Galvis M, Teng Y. Targeting hypoxia-driven metabolic reprogramming to constrain tumor progression and metastasis[J].Int JMol Sci,2020,21(15):5487.

[12] Xiong Q,Liu B,Ding M,et al.Hypoxia and cancer related pathology[J].Cancer Lett,2020,486:1-7.

[13] Koyasu S,Kobayashi M,Goto Y,et al.Regulatory mechanisms of hypoxiainducible factor 1 activity:two decades of knowledge[J].Cancer Sci,2018,109(3):560-571.

[14] Sousa Fialho MDL,Abd Jamil AH,Stannard GA,et al.Hypoxia-inducible factor 1 signalling, metabolism and its therapeutic potential in cardiovascular disease[J].Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis,2019,1865(4):831-843.

[15] Lin CS,Liu TC,Lee MT,et al.Independent prognostic value of hypoxiainducible factor 1-αexpression in small cell lung cancer[J].Int JMed Sci,2017,14(8):785-790.

[16] Sowa T,Menju T,Chen-Yoshikawa TF,et al.Hypoxia-inducible factor 1 promotes chemoresistance of lung cancer by inducing carbonic anhydraseⅨexpression[J].Cancer Med,2017,6(1):288-297.

[17] Doheny D,Manore SG,Wong GL,et al.Hedgehog signaling and truncated GLI1 in cancer[J].Cells,2020,9(9):2114.

[18] Wickstr?m M,Dyberg C,Shimokawa T,et al.Targeting the hedgehog signal transduction pathway at the level of GLI inhibits neuroblastoma cell growthin vitroandin vivo[J].Int JCancer,2013,132(7):1516-1524.

[19] Dungwa JV,Hunt LP,Ramani P.HIF-1αup-regulation is associated with adverse clinicopathological and biological factors in neuroblastomas[J].Histopathology,2012,61(3):417-427.

[20] Noguera R,Fredlund E,Piqueras M,et al.HIF-1αand HIF-2αare differentially regulatedin vivoin neuroblastoma:high HIF-1αcorrelates negatively to advanced clinical stage and tumor vascularization[J].Clin Cancer Res,2009,15(23):7130-7136.

[21] Dzieran J,Rodriguez Garcia A,Westermark UK,et al.MYCN-amplified neuroblastoma maintains an aggressive and undifferentiated phenotype by deregulation of estrogen and NGF signaling[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2018,115(6):E1229-E1238.

[22] 湯夢婕,袁曉軍,安霞,等.轉移性神經母細胞瘤伴骨和骨髓轉移的治療療效及預后分析[J].中華轉移性腫瘤雜志,2019(03):18-24.

[23] Lee JW,Son MH,Cho HW,et al.Clinical significance of MYCN amplification in patients with high-risk neuroblastoma[J].Pediatr Blood Cancer,2018,65(10):e27257.